先天性巨結(jié)腸不同節(jié)段腸壁神經(jīng)、平滑肌分布特征及臨床價值研究*

莫優(yōu)煉 楊六成 胡小華 陳茂芳 段立鋒 蘇嘉鴻 張平鋒鐘陳 張家德 馮大軍

先天性巨結(jié)腸（Hirschsprung’s disease，HD）是小兒常見的先天性腸道疾病之一，發(fā)病是由于結(jié)腸神經(jīng)節(jié)細胞缺乏引起腸管持續(xù)痙攣，進而糞便淤滯結(jié)腸近端，長期淤滯使該段結(jié)腸肥厚擴張[1-2]。HD臨床上常表現(xiàn)為胎便排出障礙、患兒便秘腹脹及營養(yǎng)不良等，HD在很大程度上影響幼兒的生長發(fā)育，不利于其正常的學習與生活。本研究通過觀察HD不同節(jié)段腸壁神經(jīng)、平滑肌的分布特點，探究HD手術結(jié)腸切除范圍及術后胃腸功能紊亂的原因，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月-2016年12月本院收治的手術切除的46例HD標本，設其為觀察組。選取本院同期收治的死于與胃腸道疾病無關的同年齡段的25例患兒的結(jié)腸標本，將其設為對照組。（1）納入標準：觀察組參照文獻[3]中HD的診斷標準，患兒有HD相關臨床癥狀、經(jīng)腹部平片和鋇劑灌腸等影像學檢查及肛門直腸側(cè)壓臨床診斷為HD；術后病理診斷確診為HD。兩組患兒需有完整的病例資料；家屬知情研究，并簽署同意書。（2）排除標準：合并有其他腸道疾病、類源性巨結(jié)腸者；HD標本無法滿足研究要求者。研究具體事項已上報相關部門，醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核通過此研究。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化法 存檔蠟塊，以腸管縱軸為固定方向，從遠端到近端手術切除點每2厘米進行1次取材。（1）SP法：常規(guī)脫蠟，采用3%的H2O2在37 ℃條件下孵育10 min左右；之后進行抗原修復，修復時微波溫度控制在92～98 ℃，時間為10 min，選擇0.01 mol/L的枸櫞酸緩沖液（pH=6.0）作為Syn、NCAM抗原修復液；運用正常羊血清工作液封閉，滴入稀釋度均為1∶100的兔抗人Syn/NCAM單克隆抗體，4 ℃環(huán)境下孵育過夜，PBS緩沖液代替一抗起陰性對照作用。二抗選用抗兔SP試劑盒。DAB/H2O2染色，充分沖洗后再蘇木素復染，常規(guī)脫水、干燥、封片。（2）蘇木素-伊紅染色：所有標本同時進行HE染色。

1.3 觀察指標 （1）記錄兩組肌間神經(jīng)叢、叢內(nèi)神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量。（2）肌層厚度、厚度比：在HE染色后通過低倍鏡觀察，隨機選取10個視野，借助測微尺對環(huán)、縱肌的厚度進行測量，并計算厚度比。每小格為10 μm。（3）肌層病變：對肌層的空泡變性程度分為四個等級，無（-）、少量（+）、中等量（++）、大量（+++）。（4）免疫組化染色（Syn、NCAM染色）：用于判斷腸壁肌層中陽性著色的神經(jīng)纖維分布情況。參考文獻[4]中相關內(nèi)容將分布密度分為四等級，陰性（-）：無著色，陽性細胞數(shù)不超過10%；弱陽性（+）：黃色，陽性細胞數(shù)不超過25%；中度陽性（++）：棕色，陽性細胞數(shù)不超過50%；強陽性（+++）：棕褐色，陽性細胞數(shù)超過50%。

1.4 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料應用（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，等級資料比較采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒的一般資料比較 觀察組的患兒年齡1～10個月，平均（4.57±2.26）個月；46例都為短段型、普通型的HD。對照組的患兒年齡1～11個月，平均（4.89±2.02）個月。兩組的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 HE染色 （1）HE染色后對照組的標本。腸壁結(jié)構完整、顯示清晰，環(huán)肌厚度/縱肌厚度為（1.98±0.13），比值正常，在肌間、黏膜下可見豐富神經(jīng)叢，叢中同樣有豐富神經(jīng)節(jié)細胞。（2）觀察組標本形態(tài)學變化。①狹窄段：該段神經(jīng)叢數(shù)量少于對照組（P＜0.05）；肌間神經(jīng)叢中未見神經(jīng)節(jié)細胞，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且其內(nèi)的神經(jīng)纖維增粗、排列異常；在痙攣節(jié)段環(huán)、縱肌層均增厚（P＜0.05）；兩肌層厚度比值為（1.47±0.07），比例失調(diào)。②移行段：神經(jīng)叢內(nèi)可見神經(jīng)節(jié)細胞，且細胞為幼稚的和少量成熟的；肌層增厚，環(huán)、縱肌層厚度比為（1.67±0.79），有肌層空泡樣變。③擴張段：肌間神經(jīng)叢的神經(jīng)節(jié)細胞仍然少于正常對照組，在距該段遠端8 cm位置神經(jīng)節(jié)細胞計數(shù)基本達到正常水平，與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在擴張段-0、2、4、6 cm處兩肌層厚度均增厚，遠端8 cm處兩肌層厚度較之前有變薄，但與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；擴張段各處的環(huán)縱比與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。肌層有空泡樣變。（3）兩組的空泡樣程度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

2.3 免疫組化 （1）Syn。對照組的腸段有豐富肌間神經(jīng)叢；在低倍鏡下可見黃褐色染色的小型團塊狀結(jié)構；高倍鏡下神經(jīng)節(jié)的胞質(zhì)呈黃褐色深染狀態(tài)，在其中有圓形胞核，偶爾可以在腺體處見棕黃色顆粒。在觀察組的狹窄段的肌間有神經(jīng)束，且該束支為Syn陽性增粗狀態(tài)，未見神經(jīng)叢內(nèi)有神經(jīng)節(jié)細胞，與對照組比較，該段增粗的神經(jīng)干計數(shù)多、肌層內(nèi)神經(jīng)纖維分布密度高，尤其是環(huán)肌層；分析移行段低倍鏡下的情況，其神經(jīng)纖維分布密度高于狹窄段；分析肌層神經(jīng)纖維在擴張段的分布情況，該段纖維分布密度比對照組高，到距該段遠端8 cm處的肌肉與肌間的密度比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。（2）NCAM。腸段的肌內(nèi)神經(jīng)叢為NCAM陽性表達的主要區(qū)域。胞質(zhì)為NCAM的定位處，在神經(jīng)叢中的幼稚的精神節(jié)細胞和神經(jīng)纖維中NCAM呈弱陽性表達。狹窄段腸壁肌間表現(xiàn)為增粗的神經(jīng)干、肌內(nèi)神經(jīng)纖維的NCAM檢查分別呈強陽性、陽性。肌間NCAM表達在移行段為中度陽性，可見幼稚神經(jīng)節(jié)細胞胞質(zhì)深染、胞體小、未見大核仁。在擴張段NCAM在肌間、肌肉神經(jīng)組織中的表達弱，觀察到成熟神經(jīng)節(jié)細胞胞質(zhì)淡染、核大、可見明顯核仁；在距該段遠端8 cm處與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表4。

表1 兩組肌間神經(jīng)叢、神經(jīng)節(jié)細胞、肌層厚度和厚度比比較（±s）

表1 兩組肌間神經(jīng)叢、神經(jīng)節(jié)細胞、肌層厚度和厚度比比較（±s）

注：*P＜0.01、**P＜0.05，除擴張段-8以外，其他節(jié)段的肌間神經(jīng)叢、叢間神經(jīng)節(jié)細胞與對照組比較；各節(jié)段的環(huán)、縱肌層厚度均大于對照組。

組別 神經(jīng)叢（個/低倍視野×100）神經(jīng)節(jié)細胞（個/低倍視野×400）環(huán)肌層厚度（μm×102/低倍視野）縱肌層厚度（μm×102/低倍視野）環(huán)縱厚度比對照組（n=25） 7.66±0.48 5.16±0.41 3.82±0.35 1.93±0.17 1.98±0.13觀察組（n=46） 狹窄段 5.37±0.28* 0* 4.05±0.20* 2.94±0.16* 1.47±0.07移行段 4.76±0.29* 1.63±0.73* 7.03±0.20* 4.24±0.17* 1.67±0.79擴張段 -0 5.88±0.25** 3.91±0.34* 10.21±0.14* 4.57±0.11* 2.35±0.69擴張段 -2 6.05±0.26** 4.04±0.17** 12.36±0.19* 4.98±0.13* 2.57±0.08擴張段 -4 6.62±0.23** 4.18±0.35** 11.21±0.13* 5.16±0.26* 2.33±0.06擴張段 -6 7.04±0.24** 4.46±0.39** 11.11±0.13* 4.92±0.13* 2.26±0.06擴張段 -8 7.55±0.23 4.87±0.21 9.81±0.12* 4.66±0.31* 2.18±0.04

表2 兩組肌層空泡樣變比較 例

3 討論

HD又稱為腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥，臨床通常表現(xiàn)為腸梗阻的癥狀[5]。文獻[6-9]數(shù)據(jù)表明，HD在新生兒中的發(fā)病率在1/5 000左右，且發(fā)病存在性別、種族差異，男性發(fā)病多于女性。目前，HD的治療方式主要為保守和手術治療，一旦診斷明確、病情加重、術前準備充足則多選擇通過巨結(jié)腸根治術解除癥狀[10]。當HD伴發(fā)小腸結(jié)腸炎時，如果治療不及時將會危及患兒生命，提高死亡率[11]。目前，HD的術前診斷方式都存在一定局限性，例如不能較好確定病變的性質(zhì)和范圍、不易與HD類緣疾病鑒別等，這些不足很大程度上為HD的診斷增加難度[12]。因此，根治術術前即對直腸黏膜活檢標本進行相關標志物的免疫學檢測具有重要意義，同時選用特異性的抗體是關鍵。

Syn是一種存在于突觸小泡膜表面的特有蛋白質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)胃腸功能，且功能的發(fā)揮與興奮傳導相關[13]。在腸壁神經(jīng)節(jié)細胞、神經(jīng)纖維中Syn都呈陽性表達，而Syn陽性突觸囊泡則隨著腸段神經(jīng)節(jié)細胞的變化而變化，其陽性突觸囊泡在環(huán)、縱肌層中的布局主要顯示結(jié)腸蠕動功能的分布情況，此外，它還能說明病變部位的肌間、黏膜下的神經(jīng)叢都發(fā)生了病理改變，通常體現(xiàn)為神經(jīng)遞質(zhì)的異常[14]。NCAM是細胞間黏附因子，在協(xié)調(diào)神經(jīng)肌肉的發(fā)展中具有顯著作用。NCAM在平滑肌細胞增殖時呈高表達，其表達下降主要在細胞突觸與神經(jīng)末梢之間建立成熟聯(lián)系后[15-16]。研究結(jié)果顯示，觀察組狹窄段的神經(jīng)叢中MCAM的表達明顯強于對照組（弱陽性），且腸神經(jīng)的異常分布沿著腸段下行而減少，NCAM表達漸趨正常，表明神經(jīng)、平滑肌細胞分化不完全，影響神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)肌肉的正常傳導，從而導致腸管功能的異常，此時神經(jīng)組織的未分化成熟程度主要通過NCAM體現(xiàn)。分析HE染色后腸段肌間神經(jīng)叢中神經(jīng)節(jié)細胞的情況，觀察組狹窄段未見該細胞，從移行段開始可見且隨著遠離該段神經(jīng)叢及叢中神經(jīng)節(jié)細胞都朝著正常計數(shù)恢復，對照組與觀察組距擴張段遠端8 cm處差異已不明顯，這對確定手術切除范圍具有參考價值，如果病變部位切除不到位則極有可能導致預后不良、術后復發(fā)。研究中觀察組腸管均肥厚，尤其以環(huán)肌層明顯，且環(huán)、縱肌層厚度比例失調(diào)，盡管在距擴張段遠處8 cm處也未恢復正常。在環(huán)、縱肌層出現(xiàn)了不同程度的空泡樣變，研究表明，空泡樣變的形成與炎癥、水腫相關，細胞毒素的暴露將加強空泡化。

表3 兩組Syn神經(jīng)纖維分布密度比較 例

表4 兩組NCAM神經(jīng)纖維分布密度比較 例

綜上，HD的不同腸段神經(jīng)、平滑肌的病變情況能夠作為根治術切除范圍的參考，但合理性仍需進一步研究證實。

[1]高亞，黃強.先天性巨結(jié)腸發(fā)病機制的研究進展[J].中華實用兒科臨床雜志，2014，29（23）：1761-1763.

[2] Cuddapah V A，Turner K L，Sontheimer H.Calcium entry via TRPC1 channels activates chloride currents in human glioma cells[J].Cell Calcium，2013，53（3）：187-194.

[3]張文，武海燕，李惠，等.先天性巨結(jié)腸病理診斷規(guī)范（2016版）[J].中華病理學雜志，2016，45（3）：149-152.

[4]周小琴，牛麗文，陶強，等.先天性巨結(jié)腸相關標志物的研究及意義[J].南昌大學學報（醫(yī)學版），2014，54（6）：12-15.

[5]黃發(fā)新，劉磊.神經(jīng)遞質(zhì)異常在先天性巨結(jié)腸生理變化中的作用[J].臨床小兒外科雜志，2015，14（2）：142-144.

[6]胡書奇，岳雷，夏肇波，等.先天性巨結(jié)腸患兒腸神經(jīng)干細胞培養(yǎng)的實驗研究[J].中華小兒外科雜志，2015，36（11）：846-850.

[7]馬光榮，馬克林.神經(jīng)嵴細胞移植在先天性巨結(jié)腸癥腸道神經(jīng)組織重建中的作用[J].甘肅科技，2017，33（15）：127-128.

[8]蘇剛.先天性巨結(jié)腸治療方法[J].中國實用兒科雜志，2012，27（12）：897.

[9]黃強，段怡濤，高亞，等.先天性巨結(jié)腸患兒p75NTR免疫陽性腸神經(jīng)元的時空分布研究[J].中華小兒外科雜志，2014，35（12）：956-958.

[10]向磊，李娜萍，武海燕，等.先天性巨結(jié)腸及其同源病診斷熱點討論[J].中華小兒外科雜志，2016，37（4）：248-252.

[11]李龍至，徐偉玨.先天性巨結(jié)腸癥分子基因?qū)W研究進展[J].國際兒科學雜志，2015，42（4）：363-366.

[12]魏強，陳東，徐泉.WNT3A基因在先天性巨結(jié)腸癥中的表達研究[J].陜西醫(yī)學雜志，2016，45（9）：1117-1119.

[13]朱偉雄，李雪清，嚴麗霞.神經(jīng)標記物在先天性巨結(jié)腸中的表達[J].實用醫(yī)學雜志，2014，30（13）：2136-2137.

[14]江遜.先天性巨結(jié)腸的診斷與治療現(xiàn)狀[J].中華實用兒科臨床雜志，2013，28（7）：559-560.

[15]邵雷朋，潘登，謝文雅，等.腹腔鏡輔助經(jīng)肛門Soave治療新生兒先天性巨結(jié)腸36例分析[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2016，13（6）：112-115.

[16]劉勝中，譚今，黃克力.同期雙極射頻消融治療先天性心臟病合并心房顫動[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2015，12（3）：28-30.