Wnt-1/β-catenin通路在亞硒酸鈉抑制人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞體外增殖過(guò)程中表達(dá)研究

楊陸濤 張守忠 潘擁軍 曾元臨

目前對(duì)生物體的演變和發(fā)展規(guī)律研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)，而作為在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和分化過(guò)程中起重要作用的Wnt/β-catenin信號(hào)通路也得到越來(lái)越多的研究。本課題主要研究亞硒酸鈉對(duì)人增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HS）成纖維細(xì)胞（Fibroblasts，F(xiàn)B）體外增殖的影響，前期研究已發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉在體外可以抑制人HSFB的增殖，顯示可以明顯抑制FB中的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)[1-3]。還沒有相關(guān)文獻(xiàn)顯示亞硒酸鈉在抑制人HSFB增殖相關(guān)機(jī)制方面的報(bào)道，為了進(jìn)一步明確亞硒酸鈉對(duì)人HSFB抑制的分子機(jī)制，決定首先從Wnt-1/β-catenin信號(hào)通路在亞硒酸鈉作用后的人HSFB中的變化方面研究入手，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 取自2016年1-3月在九江市第一人民醫(yī)院燒傷整形科行HS整形手術(shù)的患者瘢痕組織（年齡4～12歲，3例患者的瘢痕組織，其身體健康、近期未使任何抗瘢痕藥物、瘢痕組織處于穩(wěn)定期且無(wú)惡變，瘢痕用于研究實(shí)驗(yàn)均征得患者家屬的知情同意）。設(shè)置試驗(yàn)組與和對(duì)照組，試驗(yàn)組分為A、B、C、D、E組，每組3份標(biāo)本，分別加入等量含2.5、5、10、20、40 μmol/L濃度的亞硒酸鈉10%胎牛血清的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入等量的10%胎牛血清培養(yǎng)基（即0 μmol/L濃度的亞硒酸鈉）。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 亞硒酸鈉粉末（Sigma，美國(guó)），DMEM（Hyclone，美國(guó)），胎牛血清（Hyclone，美 國(guó) ）， 胰 蛋 白 酶（Hyclone， 美 國(guó) ），PBS液（Hyclone，美國(guó)），Wnt-1一抗（中杉金橋，北京），β-catenin（中杉金橋，北京），PV-9000試劑盒（中杉金橋，北京），DAB試劑盒（中杉金橋，北京）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo-BB15，德國(guó)），臺(tái)式離心機(jī)（Allegra，美國(guó)），超凈工作臺(tái)（蘇干，中國(guó)），微量電子秤（上海儀展，中國(guó)），倒置顯微鏡及照相分析系統(tǒng)（CX 40，Olympus，日本），-20 ℃低溫冰箱（Siemens，德國(guó)）。

1.2.2 FB體外培養(yǎng) 采用林尊文等[2]的改良組織塊貼壁結(jié)合胰蛋白酶消化法體外培養(yǎng)，將HS剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，經(jīng)過(guò)胰酶消化后再鋪于培養(yǎng)瓶底部貼壁，F(xiàn)B從組織塊中爬出增生，連續(xù)培養(yǎng)后取第4代用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3 細(xì)胞免疫組化法測(cè)細(xì)胞內(nèi)Wnt-1、β-catenin蛋白的表達(dá) 細(xì)胞爬片的制備以及免疫組化實(shí)驗(yàn)采用楊陸濤等[1]前期研究細(xì)胞免疫組化法檢測(cè)FB內(nèi)TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原同樣方法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)；組間比較采用單因素多樣本均數(shù)SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HS組織塊培養(yǎng)FB 前3 d未見細(xì)胞，第4天可見單個(gè)呈梭形狀細(xì)胞分布于組織塊周圍，第7天可見較多細(xì)胞整齊排列于瘢痕塊周圍，第15天時(shí)細(xì)胞基本爬滿瓶底，將瘢痕塊移出繼續(xù)培養(yǎng)，瓶底細(xì)胞按1∶2傳代培養(yǎng)，取第4代用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 細(xì)胞免疫組化法檢測(cè)Wnt-1、β-catenin的表達(dá)情況 亞硒酸鈉的濃度在0～40 μmol/L，隨著濃度的遞增，F(xiàn)B的總數(shù)在逐漸減少，細(xì)胞形狀也在發(fā)生不同的變化，在40 μmol/L的濃度時(shí)FB處于抑制狀態(tài)，細(xì)胞核出現(xiàn)多形性，較多細(xì)胞出現(xiàn)核碎裂甚至死亡；隨著濃度的遞增FB內(nèi)所表達(dá)的Wnt-1和β-catenin蛋白表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸減少，陽(yáng)性率逐漸降低。見表1和圖1、2。

表1 各組間各指標(biāo)免疫組織化學(xué)結(jié)果分析（±s）

表1 各組間各指標(biāo)免疫組織化學(xué)結(jié)果分析（±s）

注：n=3，同一個(gè)載玻片中均取3個(gè)相對(duì)分布均勻的視野便于統(tǒng)計(jì)；*與對(duì)照組比較，P＜0.05；#與A組比較，P＜0.05；△與B組比較，P＜0.05；○與C組比較，P＜0.05；●與D組比較，P＜0.05。

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圖1 不同濃度亞硒酸鈉作用后細(xì)胞內(nèi)Wnt-1蛋白變化趨勢(shì)（免疫組化，×400倍）

圖2 不同濃度亞硒酸鈉作用后細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白變化趨勢(shì)（免疫組化，×400倍）

3 討論

文獻(xiàn)[4-8]的研究顯示，Labus和Okuse對(duì)小鼠創(chuàng)面模型及FB損傷模型的研究中均發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)面愈合初期存在Wnt信號(hào)的激活，其中Wnt-1表達(dá)活躍促進(jìn)FB的增殖；Sato等[9]觀察到HS組織中β-catenin表達(dá)量顯著高于萎縮性瘢痕組織；Cheon等[10]則觀察到β-catenin在HS組織中的表達(dá)量與正常手術(shù)后瘢痕無(wú)明顯差異，但其表達(dá)持續(xù)時(shí)間卻顯著延長(zhǎng)，因此還是說(shuō)明在HS中Wnt信號(hào)通路的激活還是很明顯的；在最新的研究中Ho等[11]通過(guò)外源性干預(yù)激活Wnt/β-catenin，發(fā)現(xiàn)可以抑制高糖誘發(fā)、TGF-β1介導(dǎo)的腎纖維化；在HS或纖維化效應(yīng)細(xì)胞活化的研究中，Caraci等[12]認(rèn)為TGF-β1可通過(guò)ERK途徑激活β-catenin，進(jìn)而促進(jìn)肺FB的表型轉(zhuǎn)化。上述的研究充分證明，Wnt信號(hào)通路在瘢痕的形成和組織的纖維化的過(guò)程中起到非常重要的調(diào)節(jié)作用，其中發(fā)揮主要作用的是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路，并且β-catenin表達(dá)的增加對(duì)通路的激活起到關(guān)鍵作用。

人HSFB的本質(zhì)是由于FB的過(guò)度增生，在細(xì)胞的增殖的過(guò)程中，可能是由于某些代謝產(chǎn)物的刺激，導(dǎo)致細(xì)胞的分裂速度過(guò)快或者某些信號(hào)通路的異常調(diào)節(jié)，導(dǎo)致細(xì)胞周期的異常，在這一點(diǎn)上，人HSFB和腫瘤細(xì)胞的異常增殖有一定的相似性。人HS由于組織中FB凋亡減少，繼而細(xì)胞增殖過(guò)度分泌過(guò)多的膠原和細(xì)胞外基質(zhì)是導(dǎo)致HS發(fā)生的重要機(jī)制。細(xì)胞凋亡障礙和增殖異常是人HS發(fā)生的重要機(jī)制之一，但這兩者之間并不是相互孤立的。

本實(shí)驗(yàn)使用亞硒酸鈉抑制人HSFB增殖，探討Wnt-1/β-catenin信號(hào)通路在這個(gè)過(guò)程中的變化，細(xì)胞免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示隨著亞硒酸鈉的濃度升高，Wnt-1蛋白和β-catenin蛋白在FB中的表達(dá)均呈現(xiàn)出遞減的趨勢(shì)，同時(shí)細(xì)胞的數(shù)量也表現(xiàn)出逐漸減少的趨勢(shì)，說(shuō)明隨著亞硒酸鈉的濃度增加，可能會(huì)促進(jìn)FB的凋亡和抑制細(xì)胞分裂，導(dǎo)致細(xì)胞的數(shù)量的減少。在HSFB中Wnt-1蛋白和β-catenin蛋白呈現(xiàn)出比正常皮膚中的FB內(nèi)的Wnt-1蛋白和β-catenin蛋白表達(dá)增強(qiáng)的狀態(tài)，說(shuō)明在HS形成的過(guò)程中，Wnt-1/β-catenin信號(hào)通路是一種激活狀態(tài)，可以促進(jìn)FB的增殖與分化。而亞硒酸鈉中的硒可以明顯地抑制FB的增殖與分化，目前單從Wnt-1/β-catenin信號(hào)通路的研究中可發(fā)現(xiàn)，該條信號(hào)通路可以被亞硒酸鈉明顯的抑制作用，在今后的研究中，可以進(jìn)一步明確亞硒酸鈉是否對(duì)其他的信號(hào)通路也存在一定程度的抑制作用。

通過(guò)本課題的研究可發(fā)現(xiàn)硒在瘢痕的抑制方面可起到一定的作用，通過(guò)未來(lái)對(duì)硒在抑制瘢痕的進(jìn)一步深度研究，可以在臨床上對(duì)燒傷瘢痕的抑制發(fā)揮作用；以及近年來(lái)的研究已確證硒在人體健康中的重要性，在人體正常的生理生化活動(dòng)起重要調(diào)控作用，隨著人們對(duì)硒認(rèn)識(shí)的逐步加深，硒元素對(duì)人體的作用越來(lái)越大，在未來(lái)的腫瘤治療中、心血管疾病中以及在瘢痕防治中等多方面，均都會(huì)看到硒元素發(fā)揮的作用，本課題組會(huì)繼續(xù)探討硒對(duì)人HS的抑制作用機(jī)制研究。

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