17-AAG聯(lián)合吉西他濱對(duì)人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株增殖的影響

戴樹龍 馬海青 李斐 楊坤興

吉西他濱(gemcitabine, GEM)單藥化療為晚期胰腺癌的標(biāo)準(zhǔn)一線治療，但療效欠佳，耐藥是導(dǎo)致化療失敗的主要原因[1]。HSP90是一種分子伴侶蛋白，參與蛋白質(zhì)的聚集、折疊、裝配及轉(zhuǎn)運(yùn)等過程，與胃癌、肝癌、胰腺癌、白血病等多種惡性腫瘤的發(fā)展都有密切的關(guān)系[2]。17-AAG是HSP90的特異性抑制劑，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用，成為治療的新靶點(diǎn)。本研究采用CCK-8法測(cè)定不同時(shí)間、不同濃度的17-AAG、GEM及兩者聯(lián)合用藥對(duì)人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株增殖的抑制作用，為中晚期胰腺癌患者提供新的聯(lián)合化療方案和理論依據(jù)。

一、材料與方法

1．細(xì)胞培養(yǎng)及分組： 人胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3購(gòu)自南京凱基生物公司，常規(guī)培養(yǎng)傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以3×104個(gè)/ml的密度接種于96孔板，每孔200 μl，分為空白組、對(duì)照組、17-AAG組、GEM組、聯(lián)合用藥組。空白組只加培養(yǎng)液；對(duì)照組為不加藥的BxPC-3；17-AAG組分為終濃度10.0、5.00、2.50、1.25、0.62、0.31 μg/ml 17-AAG的各組；GEM組分為終濃度10.0、5.00、2.50、1.25、0.62、0.31 μg/ml GEM的各組；聯(lián)合用藥組按照單藥組的濃度梯度聯(lián)合應(yīng)用17-AAG和GEM。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。17-AAG購(gòu)自美國(guó)SANTA公司，GEM由南京市第一醫(yī)院腫瘤科提供。

2．CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率： 上述各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48 h后每孔加入5 mg/ml CCK-8液20 μg，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。上酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在波長(zhǎng)490 nm處的吸光值(A490值)，以空白組調(diào)零。細(xì)胞增殖抑制率=(對(duì)照組A490值-實(shí)驗(yàn)組A490值)/ 對(duì)照組A490值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

二、結(jié)果

17-AAG組、GEM組及聯(lián)合用藥組均呈濃度及時(shí)間依賴性抑制BxPC-3細(xì)胞的增殖。與對(duì)照組相比，不同濃度的17-AAG、GEM對(duì)BxPC-3細(xì)胞作用24 、48 h后均有抑制作用(圖1、2)；隨著藥物濃度的增加，其產(chǎn)生的抑制效果越明顯(P<0.05)。作用48 h各組對(duì)BxPC-3細(xì)胞增殖的抑制率高于24 h各組；聯(lián)合用藥組24、48 h時(shí)對(duì)BxPC-3細(xì)胞增殖的最高抑制率分別為65.1%及83.2%，顯著高于單獨(dú)用藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

討論胰腺癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，85%的患者就診時(shí)已屬晚期，手術(shù)切除率僅10%～15%，5年生存率僅1%～5%[3]。GEM常用于中晚期胰腺癌的化療，但易產(chǎn)生耐藥。Derong等[4]研究表明，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)參與調(diào)節(jié)多重耐藥基因(MDR-1)和核糖核苷還原酶(RRM1)的表達(dá)改變可能與胰腺癌對(duì)GEM的抵抗有關(guān)。

圖1 24 h時(shí)各實(shí)驗(yàn)組藥物對(duì)人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖的抑制率

圖2 48 h時(shí)各實(shí)驗(yàn)組藥物對(duì)人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖的抑制率

HSP90在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)。李亮等[5]發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中HSP90的表達(dá)不僅明顯高于正常組織，且其表達(dá)還與淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)。17-AAG是HSP90的特異性拮抗劑，目前已進(jìn)入了臨床應(yīng)用，在實(shí)體腫瘤及白血病的臨床治療中均有不錯(cuò)的效果[6]。一方面，17-AAG通過增加抑癌基因p53的表達(dá)從而發(fā)揮抗腫瘤作用[7]；另一方面，17-AAG可減輕肺癌患者對(duì)放療藥的耐藥性，明顯增強(qiáng)其治療效果[8]。因此，17-AAG可能還可以通過調(diào)節(jié)ERK通路增強(qiáng)胰腺癌患者對(duì)GEM的敏感性。

本研究通過CCK-8法證實(shí)聯(lián)合應(yīng)用17-AAG與GEM對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖的抑制率明顯高于單獨(dú)用藥組，在48 h時(shí)最高可達(dá)83.2%。但目前的結(jié)果僅限于細(xì)胞水平的研究，本課題組還將進(jìn)一步建立胰腺癌裸鼠動(dòng)物模型來評(píng)估聯(lián)合用藥在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的效果及安全性，并測(cè)定與腫瘤相關(guān)的HSP90伴侶蛋白胰島素樣生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子受體、磷脂酰激酶-3-激酶及酪氨酸激酶的表達(dá)，進(jìn)一步探討17-AAG和GEM聯(lián)合用藥的抗癌機(jī)制，為胰腺癌聯(lián)合化療的可行性提供新的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

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