浙北地區(qū)334例甲真菌病真菌培養(yǎng)結(jié)果分析

潘 露 胡麗華 陶亦帆 楊 波

甲真菌病由真菌侵犯甲板所致，是皮膚科常見(jiàn)的淺部真菌病之一。近年來(lái)，隨著生活水平的不斷提高，廣譜抗生素的濫用、免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素使用的增多、甲真菌病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，致病菌種分布也發(fā)生變化，且菌種分布存在一定的地域差異。為了解浙北地區(qū)甲真菌病致病菌種分布特征，本研究對(duì)2016年1～12月來(lái)我院就診的甲真菌病病人的真菌培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病例及標(biāo)本來(lái)源 所有病例均是2016年1～12月來(lái)我院就診的臨床初診為甲真菌病患者，其中1007例真菌鏡檢陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行真菌培養(yǎng)，334例培養(yǎng)陽(yáng)性,陽(yáng)性率33.17%。平均年齡42.5歲。

主要試劑與儀器 試劑：含氯霉素(0.005 g/100 mL)和放線菌酮(0.05 g/100 mL)沙保羅氏瓊脂(杭州濱和微生物試劑有限公司)，梅里埃(上海)生物制品有限公司生產(chǎn)的酵母菌鑒定培養(yǎng)基(CAN2),乳酸酚棉蘭染液。

儀器：CX-31熒光顯微鏡(OLYMPUS),低溫恒溫培養(yǎng)箱(MIP-154)，海爾醫(yī)用冷藏箱(HYC-68A)，力康生物安全柜(HFsafe-1200LC)，三洋高壓蒸汽滅菌器(MLS-3750)。

1.2 方法

1.2.1 直接鏡檢 選擇病變最嚴(yán)重的病甲作為靶甲， 取材前先用75%酒精棉拭徹底清潔后，用無(wú)菌鈍手術(shù)刀刮取表層，采集病甲邊緣下的較深層(貼近甲床)的甲屑置于載玻片上，用10% KOH溶解病甲屑制成片，在酒精燈火焰上微加熱，直接在低倍鏡下檢查有無(wú)菌絲和孢子，初步判斷致病菌。

1.2.2 真菌培養(yǎng)與菌種鑒定 將甲屑標(biāo)本接種于含氯霉素和放線菌酮的沙保斜面培養(yǎng)基中(SCCA)，每管至少接種3點(diǎn)。25℃～28℃培養(yǎng)2周，隔1～2天觀察生長(zhǎng)情況，皮膚癬菌和非皮膚癬菌的鑒定根據(jù)菌落形態(tài)、培養(yǎng)基顏色變化和小培養(yǎng)的鏡下結(jié)構(gòu)，主要依據(jù)大分生孢子的特征進(jìn)行菌種鑒定。小培養(yǎng)的鏡下結(jié)構(gòu)運(yùn)用乳酸酚棉藍(lán)染色后菌絲和孢子呈深藍(lán)色，形態(tài)結(jié)構(gòu)更加清晰，背景干凈，反差大。乳酸可殺滅真菌，棉藍(lán)可使其著色，甘油可使玻片長(zhǎng)期保存[1]。

酵母菌通過(guò)梅里埃(上海)生物制品有限公司生產(chǎn)的酵母菌鑒定培養(yǎng)基的顏色來(lái)鑒定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究所得數(shù)據(jù)均通過(guò)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析和處理，數(shù)據(jù)組之間的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的構(gòu)成比例 1007例甲真菌鏡檢陽(yáng)性患者進(jìn)行真菌培養(yǎng),334例培養(yǎng)陽(yáng)性,陽(yáng)性率33.17%.其中感染病原菌菌種以皮膚癬菌為主，共148例(44.31%)，其中紅色毛癬菌最多，有136例(40.72%)，其次是非皮膚癬菌中的曲霉(14.67%)，酵母菌中的白念珠菌(10.48%)，詳見(jiàn)表1。

2.1.1 甲真菌病患者致病菌菌種性別分布情況 334例真菌培養(yǎng)陽(yáng)性患者中，男121例，女213例。男性以皮膚癬菌為主，占46.28%，女性同樣以皮膚癬菌為主，占43.19%，男女病原菌分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.59,P=0.745)。詳見(jiàn)表 2。

2.1.2 甲真菌病患者病原菌菌種的年齡分布情況 334例真菌培養(yǎng)陽(yáng)性的患者中，36～55歲年齡段，甲真菌病患者最多，其中以皮膚癬菌感染最多有65例(39.16%)，>55歲以酵母菌感染為主有29例(48.33%)，各個(gè)年齡組病原菌菌種分布不同，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=23.94，P<0.01)，詳見(jiàn)表 3。

表1 真菌培養(yǎng)陽(yáng)性的334例甲真菌病中分離的病原菌種類(lèi)及構(gòu)成比例

表2 男女甲真菌病患者病原菌分布情況 例(%)

表3 甲真菌病患者病原菌年齡分布情況 例(%)

2.1.3 甲真菌病患者不同甲部位感染病原菌種類(lèi)的對(duì)比 不同病原菌菌種在感染的部位總體上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=51.86，P<0.01),其中皮膚癬菌與酵母菌比較感染部位存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=51.54，P<0.01),指甲更易受酵母菌感染(52.34%)，趾甲更易受皮膚癬菌感染(58.74%);皮膚癬菌與非皮膚癬菌比較感染部位差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.65，P<0.01)。酵母菌與非皮膚癬菌比較感染部位差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.21，P=0.013)，詳見(jiàn)表 4。

表4 甲真菌病患者不同甲部位感染病原菌種類(lèi) 例(%)

2.2 甲真菌病患者各年齡段的性別分布情況 334例真菌培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中，男121例，女213例，男女比例為1∶1.75，36～55歲組的甲真菌病患者最多，其中主要是女性患者有122例(36.53%)，甲真菌病患者各年齡段性別分布有差異(χ2=14.70，P<0.01)。

3 討論

甲真菌病是最常見(jiàn)的甲病，是由各種真菌引起的甲板或甲下組織感染，最常見(jiàn)致病菌是皮膚癬菌，其次為酵母菌和非皮膚癬菌霉菌(nondermatophyte mould，NDM)[2]。本研究表明，皮膚癬菌是浙北地區(qū)甲真菌病的優(yōu)勢(shì)致病菌，且以紅色毛癬菌為多見(jiàn)，其次為非皮膚癬菌，然后是酵母菌中的白念珠菌，這與國(guó)內(nèi)各地區(qū)的調(diào)查研究得到的優(yōu)勢(shì)菌種結(jié)果類(lèi)似，但亦有報(bào)道部分地區(qū)病甲中的致病菌以酵母菌占首位[3，4]，其次為皮膚癬菌，霉菌相對(duì)少些，具有一定的差異。本文對(duì)334例甲真菌病例進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，本組甲真菌病的臨床特點(diǎn)和致病菌菌種分布與國(guó)內(nèi)有著相似的地方，同時(shí)也有自身特點(diǎn)。本研究的病例中，男女甲真菌病的致病菌都以皮膚癬菌為主，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而王麗納等[5]報(bào)道的卻是男性以感染皮膚癬菌為主，女性感染酵母菌為主，這種差異可能與地域、氣候、生活環(huán)境有關(guān)，還可能與收及患者的性別比例不同相關(guān)。在感染部位上，指甲更易受酵母菌感染(52.34%)，趾甲更易受皮膚癬菌感染(58.74%)，可能與指、趾甲接觸面不同有關(guān)，這與王麗納等[5]報(bào)道類(lèi)似。而甲真菌病患者在年齡分布上主要是中青年階段36～55歲，可能原因是中青年新陳代謝旺盛、經(jīng)常參加社交活動(dòng)和不良衛(wèi)生習(xí)慣導(dǎo)致的。在性別分布上，男女患病比例為1∶1.75，女性明顯多于男性，尤其是中青年女性(36～55)歲多發(fā)，這與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道相符合。這可能與女性更注重自身儀表，患病后會(huì)更加積極就診、更多地參與家務(wù)勞動(dòng)、穿皮鞋，潮濕的環(huán)境更利于真菌生長(zhǎng)，還有做美甲等對(duì)甲造成的物理及化學(xué)性損傷的情況增加等因素有關(guān)[6]。小孢子菌屬很少感染甲，國(guó)內(nèi)外均有少數(shù)小孢子菌屬菌種感染甲板的文獻(xiàn)報(bào)道[7]，而本研究沒(méi)有培養(yǎng)出小孢子菌，可能和地域，氣候和生活環(huán)境有關(guān)。短帚霉是英國(guó)最常見(jiàn)的霉菌感染源。柱頂孢霉也可從熱帶地區(qū)患者的病甲中分離出。其他引起甲感染的霉菌包括曲霉屬、枝頂孢霉、鐮刀菌屬等，而本研究只培養(yǎng)出了曲霉和青霉兩種非皮膚癬菌，這同樣可能和地域，氣候和生活環(huán)境有關(guān)

近年來(lái)隨著糖尿病及器官移植等疾病患者逐漸增多，甲真菌病在免疫功能低下及糖尿病等基礎(chǔ)疾病患者中的感染率也升高，應(yīng)結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)、一般情況等，注意甲真菌病的鑒別診斷，如甲營(yíng)養(yǎng)不良及銀屑病甲病、慢性濕疹甲改變等繼發(fā)性甲損害疾病[8]。酵母菌在甲真菌病主要致病菌中的比例升高亦可能與此有關(guān)[9，10]。本次調(diào)查值得注意的是甲真菌病培養(yǎng)時(shí), 雖然培養(yǎng)基中加了放線菌酮、氯霉素等抑菌劑,但仍有多株污染真菌生長(zhǎng),考慮其中有部分為致病菌,因?yàn)榉椒▽W(xué)的原因,不能將其分離并鑒別出來(lái),在今后工作中采用Tosti等提出的非皮膚癬菌甲真菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]將其進(jìn)一步分離鑒定。

因?yàn)榧渍婢』颊咧苯隅R檢和真菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率均不高，而且培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)，難以符合臨床的實(shí)際需要。因此，在臨床工作中，國(guó)內(nèi)外很多皮膚科醫(yī)生憑借經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)皮損的形態(tài)和鏡檢結(jié)果，沒(méi)有等到真菌培養(yǎng)結(jié)果出來(lái)便開(kāi)具常用藥物，如特比萘芬片或伊曲康唑膠囊等。所以，詳細(xì)了解浙北地區(qū)甲真菌病致病菌種的種類(lèi)和分布，對(duì)本地區(qū)甲真菌病的防治具有一定的參考價(jià)值和指導(dǎo)意義[12]。

甲真菌病病原菌菌種分布受年齡，性別，氣候，地理等重要因素的影響，處于不斷變遷之中。因此，堅(jiān)持開(kāi)展甲真菌病病原菌的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，對(duì)甲真菌病的治療和預(yù)防都有積極意義。

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