AP1S3基因突變與泛發(fā)性膿皰型銀屑病的相關(guān)性研究

李璐璐 尤家寶 付希安 于功奇 劉 紅 張福仁

泛發(fā)性膿皰型銀屑病(generalized pustular psoriasis, GPP)是一種病因不明、危及生命的系統(tǒng)性炎癥性皮膚病。該病常表現(xiàn)為突然、反復(fù)發(fā)作的高熱、泛發(fā)性皮疹及播散性無(wú)菌性膿皰，常伴有白細(xì)胞和 C反應(yīng)蛋白升高，嚴(yán)重者可累及內(nèi)臟器官，甚至危及生命[1]。該病的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，研究已經(jīng)證實(shí)遺傳因素在疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]。 2011 年， Marrakchi等[3]最先采用純合子定位與直接測(cè)序法發(fā)現(xiàn)9個(gè)GPP家族均攜帶同一IL36RN 純合子錯(cuò)義突變，此突變導(dǎo)致 IL36Rα 結(jié)構(gòu)和功能變異從而發(fā)生 GPP，使得 GPP 的遺傳研究取得了突破性的進(jìn)展。2012年，Jordan等[4]首次報(bào)道1例歐洲散發(fā)GPP患兒的CARD14基因c.413A>C(p.Glu138Ala)突變。我們團(tuán)隊(duì)在2014年也對(duì)62例GPP進(jìn)行了IL36RN基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)新的突變位點(diǎn)，這些病例的CADR14基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)新的突變位點(diǎn)。2個(gè)基因在GPP患者群體的突變率分別為46.77%(基因IL36RN)，4.8%(基因CARD14)，顯示GPP的發(fā)病具有遺傳異質(zhì)性[5,6]。最近， Setta-Kaffetzi等[7]首次報(bào)道了歐洲膿皰型銀屑病人群中AP1S3基因2個(gè)有害的少見(jiàn)突變位點(diǎn)，分別為c.11T>G(p.Phe4Cys)、c.97C>T(p.Arg33Trp)，該發(fā)現(xiàn)尚未在其他種群中得到驗(yàn)證。因此為系統(tǒng)闡釋GPP的遺傳發(fā)病機(jī)制，探討AP1S3基因是否與中國(guó)漢族種群GPP相關(guān)，我們收集了2014-2017年在我院住院的107例GPP，對(duì)其進(jìn)行了AP1S3基因測(cè)序，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象根據(jù)GPP的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，將2014年1月至2017年2月山東省皮膚病醫(yī)院住院患者中確診為GPP的107例納入研究，所有患者病史資料完整?；颊呓詾橹袊?guó)漢族。其中男60例，女47例，男∶女=1.3∶1。年齡5～76 (35.44±18.02)歲，發(fā)病年齡(31.47±18.55)歲，男性患者年齡(33.93±18.73)歲，女性患者年齡(37.06±17.19)歲，二者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.332)。我們的研究根據(jù)是否合并尋常型銀屑病(psoriasis vulgaris，PV)癥狀,將所有GPP患者分為不合并PV癥狀的GPP(GPP alone)和合并PV癥狀的GPP(GPP with PV)；根據(jù)GPP的發(fā)病年齡分為兒童型泛發(fā)性膿皰型銀屑病(pediatric-onset GPP, PGPP)和成人型泛發(fā)性膿皰型銀屑病(adult-onset GPP, AGPP)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA制備 本研究獲得山東省皮膚病醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，在獲得知情同意的前提下，抽取107例GPP患者外周靜脈血5 mL,乙二胺四乙酸二鉀(EDTAK2)抗凝，用TGuide大體積血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取外周全血DNA，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取后的DNA用全波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)ND-8000(NanoDrop公司)測(cè)定其純度及含量，要求A260/A280>1.8，根據(jù)DNA原液濃度將DNA原液標(biāo)化為30 ng/μL的DNA模板至96孔板內(nèi)。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 擬擴(kuò)增AP1S3基因(參考號(hào)NR_110905.1)的1、2、3、4、5五個(gè)外顯子的引物設(shè)計(jì)序列見(jiàn)表1[7]，由北京華大基因研究中心合成。PCR反應(yīng)在便攜式PCR擴(kuò)增試劑盒(2×Taq PCR MasterMix)中進(jìn)行。反應(yīng)體系12.5 μL:Taq Mix(為dNTP、Taq酶和緩沖液的混合物)6.5 μL,滅活的去離子水ddH2O 5 μL,引物(F+R)0.5 μL，模板DNA 0.7μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min,進(jìn)行以下35個(gè)循環(huán):95℃變性40 s,退火(退火溫度見(jiàn)表1)，72℃延伸1 min,最后72℃延伸10 min。12 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。GelRed染色攝片。

1.2.3 DNA測(cè)序 將所有陽(yáng)性擴(kuò)增條帶的樣本采用乙醇醋酸鈉純化法純化。分離純化后的DNA采用雙脫氧鏈終止法(Sanger 測(cè)序法)，在ABI 3500XL DNA測(cè)序分析儀(美國(guó)Applied Biosystem 公司)上進(jìn)行基因測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI下載的參考序列同時(shí)輸入NCBI Nucleotide BLAST中進(jìn)行比對(duì)分析。測(cè)序引物采用各外顯子的上游引物。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用非參數(shù)檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)等方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 PCR擴(kuò)增AP1S3基因外顯子引物序列和退火溫度及產(chǎn)物片段

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 107例GPP患者中包括無(wú)PV癥狀的GPP 31例，男13例，女18例，年齡(31.19±21)歲，發(fā)病年齡(23.32±20.43)歲；合并PV癥狀的GPP 76例，男46例，女30例，年齡(36.99±16.57)歲，發(fā)病年齡(34.79±16.87)歲。無(wú)PV癥狀的GPP及合并PV癥狀的GPP性別構(gòu)成比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.028，P=0.876)，GPP alone及GPP with PV發(fā)病年齡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.773,P=0.004)。PGPP 31例，男20例，女11例，年齡(15.06±8.77)歲；AGPP 76例，男28例，女36例，年齡(43.57±13.84)歲。PGPP及AGPP性別構(gòu)成比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.603，P=0.058)，見(jiàn)表2。

表2 107例GPP患者的基本臨床資料

2.2 AP1S3測(cè)序結(jié)果 107例GPP患者AP1S3基因所有外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段與所設(shè)計(jì)的片段大小一致，無(wú)非特異性擴(kuò)增帶。其產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，107例GPP患者AP1S3基因5個(gè)外顯子中均未發(fā)現(xiàn)任何少見(jiàn)突變、低頻突變及SNP位點(diǎn)。

3 討論

GPP是一種少見(jiàn)的危及生命的系統(tǒng)性炎癥性疾病，臨床以突然發(fā)生并反復(fù)出現(xiàn)的紅斑基礎(chǔ)上粟粒大的無(wú)菌性膿皰為特點(diǎn)，可泛發(fā)全身，并伴有高熱及全身不適。1910年，Zumbusch首次對(duì)該病進(jìn)行了描述。統(tǒng)計(jì)顯示GPP在歐洲及日本國(guó)家的發(fā)病率為0.6/100萬(wàn)～0.7/100萬(wàn)，但中國(guó)僅有病例報(bào)道，尚無(wú)相關(guān)數(shù)據(jù)[9]。在臨床上，根據(jù)有無(wú)尋常型銀屑病(psoriasis vulgaris, PV)癥狀，GPP分為單純性GPP(GPP without PV, GPP alone)及伴隨PV癥狀的GPP(GPP with preceding, later or accompanied by PV, GPP with PV)。根據(jù)GPP的發(fā)病年齡，18周歲之前發(fā)病的患者歸為兒童型GPP(pediatric-onset GPP, PGPP)，18周歲之后發(fā)病的患者歸為成人型GPP(adult-onset GPP, AGPP)[2]。我們的研究包括107例中國(guó)GPP患者，其中包括31例無(wú)PV癥狀的GPP(GPP alone)及76例伴隨PV癥狀的GPP患者(GPP with PV)，包括31例PGPP及76例AGPP，不同組別之間性別構(gòu)成比無(wú)差異；少數(shù)的無(wú)PV癥狀的GPP(GPP alone)患者的發(fā)病年齡明顯低于大多數(shù)的伴隨PV癥狀的GPP(GPP with PV)患者，與之前的研究結(jié)果[10]相符,提示無(wú)PV癥狀的GPP可能是GPP的獨(dú)特亞型，不同于伴隨PV癥狀的GPP。

GPP的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，研究已經(jīng)證實(shí)患者的遺傳因素在疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[2]，IL36RN、CARD14基因先后在歐洲種群與中國(guó)種群中被證實(shí)與GPP發(fā)病相關(guān)，只有少部分GPP患者攜帶IL36RN或CARD14基因突變，提示該病具有遺傳異質(zhì)性。最近在2014年，Setta-Kaffetzi等[7]通過(guò)對(duì)7例Hallopeau連續(xù)性肢端皮炎進(jìn)行外顯子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)AP1S3基因突變，同時(shí)他們對(duì)256例膿皰型銀屑病(包括72例亞洲GPP患者)進(jìn)行了直接測(cè)序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)AP1S3基因2個(gè)有害的少見(jiàn)突變，分別為c.11T>G(p.Phe4Cys)、c.97C>T(p.Arg33Trp)，基因突變頻率達(dá)到5.9%，與3388例正常對(duì)照的突變率1.4%相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=2.5×10-7)，但在72例亞洲患者中亦未發(fā)現(xiàn)任何突變。隨后，Capon團(tuán)隊(duì)[11-13]對(duì)99例亞洲GPP患者(絕大多數(shù)為馬來(lái)西亞人，具體不詳)AP1S3基因進(jìn)行了直接測(cè)序，未發(fā)現(xiàn)突變。2017年M?ssner等[14]研究發(fā)現(xiàn)32 864例非法國(guó)籍歐洲正常對(duì)照AP1S3基因的少見(jiàn)突變等位基因頻率2.3%與51例歐洲GPP患者AP1S3基因的少見(jiàn)突變等位基因頻率2.0%相比無(wú)差異。因此對(duì)于GPP與AP1S3基因相關(guān)性的認(rèn)識(shí)存在諸多爭(zhēng)議。AP1S3基因編碼AP-1蛋白的σ1亞單位的一種異構(gòu)體σ1C，Sugiura等[11]通過(guò)構(gòu)建三維蛋白模型發(fā)現(xiàn)報(bào)道的兩處突變可嚴(yán)重破壞AP1的穩(wěn)定性，作者發(fā)現(xiàn)敲除AP1S3基因的HaCaT細(xì)胞，轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)吞體的先天性模式識(shí)別受體Toll樣受體3 (TLR-3)明顯減少，導(dǎo)致TLR-3介導(dǎo)信號(hào)通路中IFN-β表達(dá)顯著下降。IFN-β不僅本身具有抗炎功能還能下調(diào)抗炎因子IL-1的表達(dá)，從而抑制皮膚炎癥的發(fā)生。因此AP1S3基因缺陷干擾TLR-3在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而抑制其下游IFN-β表達(dá)下降，IL-1及IL36Tα細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致皮膚炎癥的發(fā)生。本研究中我們對(duì)107例中國(guó)漢族GPP患者AP1S3基因進(jìn)行了Sanger直接測(cè)序，亦未發(fā)現(xiàn)任何少見(jiàn)突變、低頻突變及SNP位點(diǎn)，結(jié)合既往研究推測(cè)AP1S3基因可能與亞洲GPP患者疾病的發(fā)生并無(wú)相關(guān)性。

我們的研究提供了中國(guó)人群GPP患者AP1S3基因測(cè)序的結(jié)果，但未發(fā)現(xiàn)AP1S3基因突變與中國(guó)人群GPP的發(fā)病相關(guān)。結(jié)合 Setta-Kaffetzi等[7]、Mahil等[13]及M?ssner等[14]的研究結(jié)果，AP1S3基因突變導(dǎo)致TLR-3穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)障礙從而發(fā)生膿皰性皮膚病，但其在各族人群中的發(fā)病率及其相關(guān)的疾病譜仍需大量的樣本數(shù)據(jù)支持。膿皰型銀屑病作為一種多基因遺傳疾病，其遺傳模式尚不確定，仍需要開(kāi)展深入的遺傳學(xué)研究，以便為進(jìn)一步遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷和靶向治療藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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