芋螺毒素lt1c的重組表達及鎮(zhèn)痛功能*

王磊，曾夏蕓，強媛媛，任政華

(1.華南農(nóng)業(yè)大學材料與能源學院制藥工程系，廣東 廣州 510642;2.南海海洋生物技術(shù)國家工程研究中心，廣東 廣州 510642)

芋螺毒素由于能高度特異的識別和結(jié)合不同亞型的離子通道及受體，因此成為神經(jīng)藥理學研究不可多得的探針和工具，而且對神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有潛在的藥用價值[1]。目前已有1種芋螺毒素作為鎮(zhèn)痛藥在臨床使用，至少10種芋螺毒素進入了臨床研究[2]。A超家族是研究較多的芋螺毒素超家族之一，目前發(fā)現(xiàn)的A超家族芋螺毒素主要包括含有兩對二硫鍵的α芋螺毒素和含有3對二硫鍵的αA和κA芋螺毒素[3]。α和αA芋螺毒素主要作用于乙酰膽堿受體家族，κA芋螺毒素作用于電壓門控鉀離子通道[4-6]。α芋螺毒素占目前已發(fā)現(xiàn)的A超家族芋螺毒素的大多數(shù)，具有CC-C-C 骨架結(jié)構(gòu), 其二硫鍵以1-3，2-4的配對方式形成loop環(huán)框架，根據(jù)loop環(huán)中的氨基酸數(shù)量的不同又可將α芋螺毒素分為α3/5、α4/7和α4/3等多個亞家族[7]。αA- 和κA-芋螺毒素具有完全不同的二硫鍵骨架，結(jié)構(gòu)為CC-C-C-C-C，這些結(jié)構(gòu)上的差異也直接導致了他們在生理功能上也有明顯的分化和不同。作為nAChR受體的競爭性拮抗劑，α和αA芋螺毒素可以選擇性作用于nAChR，而kA- 芋螺毒素則主要作為阻斷劑作用于電壓敏感型鉀離子通道。

對α-家族芋螺毒素研究最多的是其鎮(zhèn)痛功能，如α-家族芋螺毒素家族成員vc1.1通過阻斷外周初級傳入神經(jīng)元的nAChRs而發(fā)揮止痛作用[8- 9]。具有比嗎啡和Ziconotide 藥效更強和持續(xù)時間更長的鎮(zhèn)痛效果，且無嗎啡和 Ziconotide 引起的副反應(yīng)(如便秘、呼吸抑制等)，極有望開發(fā)成為高效止痛藥物。此外 α 芋螺毒素因能選擇性阻斷nAChRs的某種亞型，除有止痛效果外，也有望開發(fā)成用于治療帕金森氏病、焦慮癥和高血壓等病癥的藥物。中樞神經(jīng)系統(tǒng)谷氨酸能神經(jīng)傳導失調(diào)造成癲癇，α芋螺毒素Conantokins能特異阻斷NMDA受體亞型，可開發(fā)成抗驚厥、抗癲癇藥物[10-11]。

本文在前期的研究中，從信號芋螺cDNA文庫中，發(fā)現(xiàn)一條A超家族芋螺毒素lt1c，其序列為：GMWDECCDDPPCRQNNMEHCPAS，具有與α芋螺毒素相同的CC-C-C骨架結(jié)構(gòu)，推測其可能具有鎮(zhèn)痛活性。由于lt1c由23個氨基酸組成，屬于小肽，可通過化學固相合成的方法獲得多肽，但前期研究結(jié)果表明(未發(fā)表數(shù)據(jù))，多肽合成過程中氨基酸的偶聯(lián)效率很低。因此，本研究采用了以硫氧還蛋白為融合伴體的pTRX載體，在大腸桿菌中對該毒素進行了成功的重組表達，并對其毒性、鎮(zhèn)痛活性進行了初步研究，為進一步的應(yīng)用開發(fā)打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

原核融合表達載體質(zhì)粒pTRX-Neu5由彭立勝博士構(gòu)建，本實驗室保存[12]。大腸桿菌DH5α購自Invitrogen公司，由本實驗室保存。大腸桿菌表達宿主菌BL21(DE3)購自Stratagene公司，由本實驗室保存。

1.2 試劑與耗材

限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、NotⅠ及T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；LA Taq酶購自大連寶生物公司； dNTP購自上海生工生物工程公司；10×PCR Buffer 購自鼎國公司；Gel Extraction Kit和Plasmid Miniprep Kit 為OMEGA BIOTEK 公司產(chǎn)品；PCR Clean-Up Kit為Axygen Biosciences公司產(chǎn)品；DNA ladder 購自Tiangen公司；低相對分子質(zhì)量標準蛋白(14 400 000～108 000 000)購自凱基生物公司；Pro-3C蛋白酶為本實驗室自產(chǎn)；色譜級TFA(三氟乙酸)為Sigma公司產(chǎn)品； Tryptone 和Yeast Extract 為Oxoid公司產(chǎn)品；T7 promoter sequencing primer(T7)，T7 terminator primer(T7T)，lt1c基因的寡聚核苷酸引物由invitrogen公司合成；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司；Trypton和Yeast Extract為Oxoid公司產(chǎn)品；其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 主要儀器

PCR儀為美國MJ Research公司，型號PTC-200；DNA測序儀為Applied Biosystems 公司產(chǎn)品，型號3730 DNA Analyzer；電泳系統(tǒng)為Bio-RAD公司產(chǎn)品，型號Mini Protein Ⅲ；超聲波細胞粉碎機為寧波新芝科器研究所產(chǎn)品，型號JY92-Ⅱ；Biologic LP 層析系統(tǒng)為BIO-RAD 公司產(chǎn)品；AKTA explorer 層析系統(tǒng)為Amersham Pharmacia Biotech 公司產(chǎn)品；色譜柱為上海錦華儀器設(shè)備廠和Pharmacia 公司產(chǎn)品；層析柱料Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow, Sephadex G25(Fine), Sephadex G50(Fine) 均為Pharmacia 公司產(chǎn)品；激光飛行質(zhì)譜儀型號為REFLEXⅢ(Germany Brucker公司產(chǎn)品)。分光光度計Biophotometer為Effendorf公司產(chǎn)品；肌肉張力換能器為成都儀器廠產(chǎn)品，型號JZJ01；電刺激器，型號JL-B，為成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品；熱板儀，型號RB-200，為成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品。

1.4 芋螺毒素基因的制備和表達載體的構(gòu)建

根據(jù)lt1c基因編碼序列和大腸桿菌密碼子的偏好性，結(jié)合pTRX兩端的KpnⅠ和NotⅠ酶切位點設(shè)計合成4段Oligo(Oligo 1：5′CCTG GAA GTT CTG TTC CAG GGG CCC GGC ATG TGG GAT GAA TGC TGT 3′；Oligo 2：3′CATGG GAC CTT CAA GAC AAG GTC CCC GGG CCG TAC ACC CTA CTT ACG ACA CTG CTA 5′；Oligo 3：5′ GAC GAT CCG CCG TGT CGC CAA AAT AAT ATG GAG CAT TGT CCG GCA AGT TAA TAAGC 3′；Oligo 4：3′GGC GGCACA GCG GTT TTA TTA TAC CTC GTA ACA GGC CGT TCA ATT ATTCGCCGG 5′)，在目的基因的5′端加入KpnⅠ酶切位點和蛋白酶Pro-3C的識別位點，3′端加入NotⅠ酶切位點和兩個終止密碼子。4個oligo片段分別進行磷酸化，并分為互補配對的兩組進行退火。質(zhì)粒pTRX用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和NotⅠ進行酶切線性化。用T4 DNA連接酶將兩組oligo片斷和線性化的pTRX載體連接。連接產(chǎn)物pTRX-lt1c轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，挑取單克隆培養(yǎng)提取質(zhì)粒，經(jīng)純化后用T7和T7T引物進行雙向核酸測序，對重組表達質(zhì)粒進行鑒定。

1.5 重組蛋白TRX-lt1c在大腸桿菌中的誘導表達

將測序正確的重組表達質(zhì)粒pTRX-lt1c轉(zhuǎn)化表達宿主菌BL21(DE3)，構(gòu)建工程菌株。挑取工程菌株單菌落接種于Amp+的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃劇烈振蕩培養(yǎng)過夜，作為種子菌。取種子菌按1∶100體積比接種于新鮮的Amp+LB培養(yǎng)基中，37 ℃劇烈振蕩放大培養(yǎng)至A600nm約為0.8時，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，同時加入w=20%葡萄糖至終質(zhì)量分數(shù)為0.2%，于20 ℃誘導表達10 h。4 ℃、5 000 r/min離心10 min收菌，以300 W的功率，冰浴下超聲30 min～2 h，破碎細菌細胞(時間長短由菌量決定)，4 ℃、12 000 r/min離心30 min 后分別取上清和沉淀進行 SDS-PAGE 分析檢測重組蛋白質(zhì)的表達情況。

1.6 重組蛋白lt1c的純化

融合蛋白采用鎳親和層析柱進行純化。首先用5 倍柱床體積的超聲緩沖液對鎳層析柱進行平衡；將超聲后的離心上清上樣，用超聲緩沖液洗柱至紫外吸收值達到基線；分別用不同濃度咪唑(20、50、100和200 mmol/L)的50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH 8.0緩沖液洗脫，每個濃度的咪唑都洗至平臺期，分別收集洗脫峰進行w=15% SDS-PAGE 檢測。

純化后的TRX-lt1c用Pro-3C酶進行酶切，酶切條件為25 ℃下4 h。酶切產(chǎn)物用G50凝膠過濾層析進行純化, Sephadex G50 Fine分子篩層析柱規(guī)格為Pharmacia XK50(5.0 cm×100 cm)，使用AKTA explorer系統(tǒng)進行中壓層析，流速恒定為2 mL/min。收集紫外吸收峰，SDS-PAGE電泳檢測樣品。

純化的毒素樣品進行真空凍干干燥，凍干粉-80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 重組蛋白lt1c的質(zhì)譜鑒定

純化的重組lt1c凍干樣品用φ=1‰的三氟乙酸溶解，取1 μL進行激光飛行時間質(zhì)譜分析，基質(zhì)為芥子酸(3,5-二甲基-4-羥基肉桂酸)。測定時加速電壓為25 kV，正離子反射檢測，光源為氮激光光源，波長337 nm。

1.8 動物毒性實驗

選取18～22 g的昆明小鼠進行毒性試驗，小鼠的性別不限。稱取純化凍干后的lt1c粉末溶于純水中。對昆明小鼠進行腦室注射，注射體積為10 μL，注射劑量分別為0.2、0.4和0.6 mg/kg。每組注射5只小鼠，注射后將小鼠放入透明觀察筒中進行觀察。并記錄小鼠的行為學表現(xiàn)。

1.9 組織水平活性測定

根據(jù)序列分析推測lt1c屬于α家族毒素，可能作用于乙酰膽堿受體，所以采用了青蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本法來檢測lt1c是否具有阻斷神經(jīng)肌肉傳導的作用[13]。

以連續(xù)單刺激的方式給予坐骨神經(jīng)電刺激，刺激參數(shù)為：延時100 ms，波寬0.5 ms，頻率0.5 Hz，強度5 V，掃描速度為4.00 s/div，記錄腓腸肌收縮的張力大小作為毒素作用前的對照。用無菌脫脂棉給藥，每5 min給予坐骨神經(jīng)電刺激、記錄腓腸肌收縮曲線，每次刺激記錄6～10次，至腓腸肌收縮被完全抑制或作用至60 min。

腓腸肌收縮被完全抑制后，用新鮮任氏液沖洗腓腸肌標本，每5 min給予坐骨神經(jīng)刺激、觀察腓腸肌收縮的恢復情況。

1.10 鎮(zhèn)痛活性測定

實驗采用體質(zhì)量20±2 g的雌性昆明小鼠。實驗前先對小鼠進行篩選，將小鼠放于事先加熱到55 ℃ 的熱板測痛儀上，記錄小鼠自投入熱板至出現(xiàn)舔后足的時間為該鼠的痛閾值，測定2次，挑選出痛閾值不超過30 s的小鼠為合格者進行正式實驗。注射體積為10 μL，注射劑量為12.5、25、50和100 μg/kg，空白對照組給予等體積的生理鹽水。于注射給藥后0.5、2、3、5、7和24 h測定，如痛閾值超過60 s則按60 s計算(以免時間過長燙傷小鼠足部)。實驗結(jié)束后，數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 pTRX-lt1c表達載體的構(gòu)建

4段Oligo磷酸化互補后與線性化的載體pTRX相連，轉(zhuǎn)入DH5α中進行擴增；挑取11個單克隆以及自連對照用T7 promoter sequencing primer和T7 terminator primer引物進行菌落PCR檢測，如圖1所示。其中泳道2、4-7、10-12為陽性克隆，3、9為自連，13為自連對照。

圖1 連接產(chǎn)物菌落PCR鑒定Fig.1 The clony PCR result of ligation product colonies1: DL2000 DNA ladder; 2-12: ligation product colonies; 13: self-ligation colony control

陽性克隆提取質(zhì)粒后，對純化后的pTRX-lt1c重組質(zhì)粒用T7 promoter sequencing primer和T7 terminator primer引物進行雙向測序，其序列與合成的模板序列結(jié)果完全一致，并且讀碼框正確(測序結(jié)果略)，表明表達載體構(gòu)建成功。

2.2 重組蛋白在大腸桿菌中的誘導表達

轉(zhuǎn)入表達質(zhì)粒pTRX-lt1c的工程菌誘導表達選用了較低濃度IPTG，低溫和長時間誘導的策略。當工程菌生長至A600nm=0.8時，添加終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，在20 ℃誘導10 h，離心收取菌體；超聲后，取樣總菌、上清和沉淀，用w=15% SDS-PAGE 檢測蛋白的表達量及可溶性，電泳結(jié)果見圖2a。融合蛋白相對分子質(zhì)量預測約16 600左右，在圖2可以看到誘導后在相對分子質(zhì)量附近有一個明顯的條帶，而且超聲后重組蛋白都在超聲上清中，可溶性較好。

2.3 融合蛋白的純化

由于重組信號芋螺毒素 TRX-lt1c融合蛋白在融合伴侶和目的蛋白之間有6×His 標簽。因此可利用Ni2+金屬離子層析純化融合蛋白。將處理好的鎳親和層析柱，用超聲緩沖液平衡5倍柱床體積。表達TRX-lt1c的大腸桿菌4 ℃離心收菌，稱量，每1 g濕菌中加入10 mL超聲緩沖液重懸菌體，超聲破菌，離心超聲的樣品，取上清液進行Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow 親和層析。在280 nm下紫外檢測同時監(jiān)控電導率。樣品用平衡緩沖液洗脫至基線后，依次用不同咪唑濃度的洗脫液進行洗脫，收集洗脫峰，進行電泳分析。w=15% SDS-PAGE分析(圖2b)結(jié)果表明，重組蛋白對Ni2+-Chelating Sepharose具有較高的親和力，在穿流峰不大于50 mmol/L的咪唑洗脫峰里，TRX-lt1c融合蛋白的含量都極少；大部分重組TRX-lt1c蛋白在100 mmol/L的咪唑濃度下就可以洗脫，在200 mmol/L咪唑的峰中僅可以看到少量的融合蛋白。經(jīng)過咪唑梯度洗過，可獲得純化的融合蛋白。

2.4 融合蛋白的酶切與目的蛋白的純化

融合蛋白TRX-lt1c用Pro-3C酶切將伴體蛋白切除后的電泳結(jié)果(圖2c)表明，融合蛋白被有效切割，因此，相對分子質(zhì)量變小，由于切下的目的蛋白lt1c相對分子質(zhì)量過小，無法在蛋白膠上直接顯示，只能看到硫氧還蛋白TRX條帶。

圖2 重組蛋白的表達和純化的SDS-PAGE檢測Fig.2 SDS-PAGE analyse of expression and purification of recombinant TRX-lt1cM: Protein molecular standard；1：Total bacterial protein before IPTG induction；2：Total bacterial protein after IPTG induction；3：Total soluble bacterial protein induced by IPTG after ultrasonification；4： Precipitation of total bacterial protein induced by IPTG after ultrasonification；5：washed protein from Ni2+ Chelating Sepharose chromatography by 20 mmol/L imidazole；6：washed protein from Ni2+ Chelating Sepharose chromatography by 50 mmol/L imidazole；7：washed protein from Ni2+ Chelating Sepharose chromatography by 100 mmol/L imidazole；8：washed protein from Ni2+ Chelating Sepharose chromatography by 200 mmol/L imidazole；9：purified fusion protein of TRX-lt1c；10：sample of the fusion protein TRX-lt1c digested by Protease3C；11：the first fraction of Sephadex G50 (TRX)；12：the second fraction of Sephadex G50 (purified recombinant conotoxin lt1c)

相對分子質(zhì)量為13 800，兩種蛋白的相對分子質(zhì)量差別較大，因此可采用分子篩效應(yīng)根據(jù)蛋白相對分子質(zhì)量的大小將蛋白分開，得到純化的目的蛋白。Sephadex G50分子篩的分離范圍為1 500～30 000，因此采用Sephadex G50純化酶切后的目的蛋白。電泳結(jié)果(圖2c)顯示G50分子篩層析的第1個峰是TRX伴體，第2個峰在電泳圖上沒有顯示，推測為目的蛋白lt1c，取該峰凍干后進行質(zhì)譜鑒定。

2.5 lt1c的質(zhì)譜鑒定

質(zhì)譜結(jié)果如圖3所示。從質(zhì)譜鑒定結(jié)果(圖3)可知，純化的lt1c二價離子峰m/z為1 394.9，通過計算，lt1c的實際相對分子質(zhì)量為2 787.8，與預期的相符，說明lt1c重組表達純化成功。

2.6 lt1c對青蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌神經(jīng)肌肉傳導的影響

本節(jié)研究采用了蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本法檢測中國南海信號芋螺A超家族毒素lt1c在突觸后膜、運動終板上的阻斷活性和緩解情況。圖4的結(jié)果表明，lt1c在6 μmol/L濃度下，30 min內(nèi)完全抑制肌肉的收縮，在lt1c完全阻斷神經(jīng)傳導后，用新鮮的任氏液反復沖洗腓腸肌標本，能夠恢復60%左右的活性，這說明lt1c對神經(jīng)的阻斷作用是可逆的。

圖3 重組表達純化的lt1c質(zhì)譜分析Fig.3 MS analysis of purified lt1c

2.7 lt1c的鎮(zhèn)痛活性

由熱板法實驗結(jié)果可知，lt1c能夠有效抑制熱刺激引起的小鼠舔后足反應(yīng)，其中以50和100 μg/kg劑量組效果較好，給藥2和3 h的痛閾值與同期空白對照組小鼠的相比，具有顯著性差異，初步提示lt1c樣品具有一定的中樞鎮(zhèn)痛作用，有望用于制備鎮(zhèn)痛藥物。其作用機理可能是通過阻斷外周初級傳入神經(jīng)元的nAChRs而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。

圖4 lt1c對青蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌神經(jīng)肌肉傳導的影響Fig.4 Effect of lt1c on neuromuscular transmission on the frog sciatic/cutaneus pectoris preparation(a) Control of Ren’solution; (b) Effect of 6 μmol/L lt1c on the preparation and partial reconvert after wash-out from total suppression; (c) Response-Time course of control and lt1c on the the frog sciatic/cutaneus pectoris preparation

2.8 lt1c對小鼠的神經(jīng)毒性

由表1小鼠腦室注射的毒性研究結(jié)果可知，注射劑量為0.2 mg/mL時，小鼠表現(xiàn)正常，注射劑量為 0.4 mg/mL時，小鼠出現(xiàn)異常表現(xiàn)，在注射10 min左右，小鼠的表現(xiàn)為不停微點頭、抓撓，并在20 min時出現(xiàn)持續(xù)性的蹦高。注射劑量為0.6 mg/kg時，注射10～15 min時，小鼠表現(xiàn)為亂竄蹦高。表明在注射劑量為0.4 mg/mL以上，lt1c對小鼠有一定的神經(jīng)毒性。

表1 腦室注射lt1c對小鼠行為的影響Table 1 Effect of lt1c on the behavioral of mice

圖5 芋螺毒素lt1c對熱板實驗小鼠痛閾的影響Fig.5 Analgesic assay of lt1c tested by method of hotplate mice*為與注射前比P<0.01，#為與空白對照比P<0.01，n=8

3 結(jié) 論

為深入研究A超家族芋螺毒素lt1c的功能，本研究構(gòu)建了融合表達載體pTRX-lt1c，在大腸桿菌BL21(DE3)中，融合蛋白TRX-lt1c獲得了可溶性的表達，并經(jīng)過鎳親和層析、Pro3C酶切和G50分子篩層析，獲得了高純度的重組芋螺毒素lt1c。該毒素在特定濃度下，在蛙的坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本中表現(xiàn)出了時間依賴性的阻斷神經(jīng)傳導效應(yīng)，而且其阻斷是可逆的。由小鼠熱板鎮(zhèn)痛實驗結(jié)果可知，重組lt1c能夠有效抑制熱刺激引起的小鼠舔足反應(yīng)，推測該毒素具有一定的中樞鎮(zhèn)痛作用。

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