不同連作方式馬鈴薯土壤中3種酚酸測定方法研究

熊 湖，鄭順林，，黃 強，龔 靜，梁衍鈴 ，袁繼超

（1.四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室，四川 成都 611130；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部薯類作物遺傳育種重點實驗室/成都久森農(nóng)業(yè)科技有限公司，四川 成都 610500）

【研究意義】隨著2015年馬鈴薯主食化戰(zhàn)略的提出，馬鈴薯在我國的種植面積不斷增長［1］，與其他糧食作物相比，馬鈴薯更加耐寒、耐旱、耐瘠薄、適應(yīng)性廣［2］。然而，受限于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)具有復種指數(shù)高、作物種類單一的特點，馬鈴薯連作現(xiàn)象普遍，長期連作導致其即使在正常栽培管理下也會出現(xiàn)品性退化、品質(zhì)下降、產(chǎn)量降低等情況，即連作障礙［3］。連作障礙的形成是由植物-土壤系統(tǒng)多種因素綜合作用的結(jié)果［4］，其中由于化感物質(zhì)引起的化感現(xiàn)象是引起連作障礙的重要原因，酚酸類物質(zhì)是已經(jīng)被證實的眾多化感物質(zhì)之一［5］。酚酸常用的測定方法有酶法、分光光度法、氣相色譜法、離子色譜法、高效液相色譜法及毛細管電泳法，其中高效液相色譜法是目前較精確、較常用的儀器分析法，而色譜條件直接影響了高效液相色譜法的測定效果，測定不同有機酸其條件也有很大差異［6］?！厩叭搜芯窟M展】江和源等［7］建立了利用高效液相色譜法同時測定茶葉中5種酚酸類化合物的方法，并認為使用不同提取液制備樣品，測定結(jié)果差異較大；運用反相高效液相色譜法可以同時測定馬鈴薯塊莖中的4種酚酸，但流動相對測定效果有很大影響［8］；吳丹等［9］利用高效液相色譜法測定了太子參根際土壤中的酚酸，發(fā)現(xiàn)種植太子參后土壤中的酚酸類自毒物質(zhì)含量升高。香草酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸是與馬鈴薯連作障礙的關(guān)系密切的酚酸類化合物［10-11］，分別澆灌這3種酚酸的溶液及其混合液，對馬鈴薯植株的株高、莖粗、地上分莖數(shù)、匍匐莖數(shù)、根長和生物量均有顯著抑制作用［12］，因此如何快速修復連作障礙的最根本條件是降低土壤中自毒物質(zhì)的數(shù)量和活性。目前，輪作換茬是當前防治連作障礙最經(jīng)濟、最有效、應(yīng)用最廣的方法，而在不同栽培方法下土壤理化性質(zhì)會發(fā)生相應(yīng)改變，酚酸類物質(zhì)的含量與種類也會有所不同，多年連作的西洋參輪作后發(fā)現(xiàn)總酚含量顯著下降，與未種植過西洋參的土地接近，并且病害減少［13］；楊樹人工輪作與連作土壤中酚酸有很大差異，輪作中酚酸降解菌總豐度都有增加［14］?！颈狙芯壳腥朦c】對色譜條件中測定波長、流動相體系、柱溫等參數(shù)進行了優(yōu)化，考察以上條件對分離測定效果的影響，并對馬鈴薯進行3種方式連作（普通連作、玉薯輪作、強化連作）試驗，采用優(yōu)化后的色譜條件，通過高效液相色譜法測定土壤的酚酸含量?！緮M解決的關(guān)鍵問題】建立一種快速、準確利用高效液相色譜法測定土壤中3種酚酸的方法，并分析不同連作方式對馬鈴薯土壤中3種酚酸的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

儀器：安捷倫-1200高效液相色譜儀、高純水制備儀、臺式pH計、超聲波震蕩儀、高速離心機。

試劑：酚酸標準品為Sigma公司生產(chǎn)的香草酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸。乙腈、甲醇、冰醋酸為色譜級，液相色譜采用的水為超純水，鹽酸、氫氧化鈉為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗于2014—2017年在四川農(nóng)業(yè)大學試驗田進行，設(shè)馬鈴薯連作、馬鈴薯/玉米輪作、馬鈴薯強化連作3個處理，以保持土壤未栽培狀態(tài)作對照（CK），供試馬鈴薯品種為川芋117（表1）。

表1 試驗處理Table 1 Experimental treatment

1.2.2 土樣采集 于馬鈴薯連續(xù)種植第4年（2017年）春季的前期、花期、塊莖膨大期、成熟期共4個時期分別采集土樣，采用抖土法收集各處理馬鈴薯根際土壤，室內(nèi)風干后過0.425 mm篩，用塑封袋裝后于4℃保存待用。

1.2.3 土壤酚酸提取 土壤酚酸的提取參考田給林等［15］的方法并有所改動。分別稱取各處理土樣10 g置于離心管中，加入1 mol/L NaOH溶液各20 mL，超聲震30 min后靜置24 h，于210 r/min搖床上震蕩30 min，8 000 g離心力下離心20 min，分離上清液后用12 mol/L鹽酸調(diào)整溶液pH至2.5沉淀出胡敏酸，超聲震蕩10 min后靜置2 h，8 000 g離心力下離心10 min，分離上清液4℃保存待分析。

1.3 測定方法

1.3.1 標準溶液配制 準確稱取香草酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸各20.0 mg分別置于3個100 mL容量瓶中，并準確稱取香草酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸各20.0 mg置于同一容量瓶中，滴加幾滴甲醇溶解后用超純水定容至刻度線，作為單一標樣以及混合標樣的母液，于4℃中保存，使用時稀釋100倍作為工作液。所有樣品進樣前經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。

1.3.2 色譜條件 分離柱采用安捷倫XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測波長為λ=280 nm，柱溫為35℃，進樣量為20 μL，采用A、B雙泵系統(tǒng)，其中流動相組分A為乙腈，B為用色譜純的冰醋酸調(diào)節(jié)pH 2.60的高純水，體積比為A∶B=25∶75，雙泵體積流量SI=0.8 mL/min，調(diào)整兩泵的流速來分離3種酚酸。

試驗數(shù)據(jù)使用Excel、Origin數(shù)據(jù)處理軟件進行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 測定波長 在確定色譜柱的前提下，液相色譜的條件主要有流速和柱溫、紫外檢測波長、流動相的選擇，測定酚酸的最佳波長有260、280、320 nm［8］，結(jié)合測定目標，為保證測定的靈敏度，將280 nm設(shè)為本試驗紫外檢測波長。

2.1.2 流動相 甲醇-醋酸與乙腈-醋酸都是常用的流動相體系，而乙腈吸光度小、柱壓低，測試后選擇乙腈-醋酸水溶液作流動相。酚酸為酸性物質(zhì)，因此，醋酸水溶液pH對峰型和保留時間影響較大。經(jīng)測試，當醋酸水溶液pH=2.60時，峰型較好、無拖尾現(xiàn)象；而隨著乙腈在流動相中所占體積比的增大，各酚酸的保留時間縮短、分離度隨之下降，經(jīng)測試乙腈∶醋酸水溶液=20∶80、25∶75、30∶70、35∶75、40∶60的效果，同時綜合分離效果與分離時間，選擇乙腈∶醋酸水溶液=25∶75。

2.1.3 柱溫 色譜柱溫度能影響其柱效、分離選擇性、檢測靈敏度和穩(wěn)定性。一般來說，提高柱溫可以縮短各酚酸的保留時間，因此分離度也會下降，但柱溫過高會影響色譜柱本身。由圖1可知，當其他色譜條件確定時，柱溫分別為25、30、35℃的測定效果表明，柱溫為35℃時測定時間短且保證了分離度。

圖1 3種酚酸混合標準樣品的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of standard sample of mixture of 3 phenolic acids

2.2 色譜條件的分析考察

2.2.1 線性關(guān)系 將制備的不同濃度標準樣品按照2.1條件依次進樣，計算回歸方程與相關(guān)系數(shù)，并以3倍信噪比確定檢出限，結(jié)果（表2）表明在該條件下，各酚酸的紫外吸收值與濃度間的線性關(guān)系良好。

2.2.2 重現(xiàn)性 將3種酚酸的混合樣品按照上述建立的液相色譜條件進行重復進樣6次，比較色譜峰相對保留時間，結(jié)果見表3，表3表明在該條件下5次平行試驗中各酚酸保留時間變化較小，具有良好的穩(wěn)定性，其RSD值在0.05%～0.18%。

表2 3種酚酸組分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限Table 2 Regression equations, correlation coefficients, linear ranges and detection limits of 3 phenolic acids

表3 3種酚酸的保留時間和相對標準偏差Table 3 Retention time and relative standard deviation of 3 phenolic acids

2.2.3 回收率 將混合標準樣品稀釋10倍后，與待測土壤提取液等體積混合，按照上述條件進樣，重復6次，測定回收率，結(jié)果見表4，在本試驗條件下各酚酸回收率較高，相對標準偏差均低于2%，能達到定量分析要求。

表4 3種酚酸的回收率和相對標準偏差Table 4 Recovery rate and relative standard deviation of 3 phenolic acids

2.3 不同連作方式對土壤酚酸含量的影響

不同連作方式條件下成熟期馬鈴薯土壤酚酸含量的色譜圖見圖2，對不同連作方式中同類酚酸進行多重比較分析結(jié)果見表5。結(jié)果表明，3種酚酸均能在不同連作方式和對照土壤中檢測出，但是含量與變化都有所差異。在馬鈴薯整個生育期，未栽培（CK）、輪作、普通連作土壤中3種酚酸含量整體上均表現(xiàn)為先增后減，而強化連作土壤3種酚酸含量一直呈下降趨勢，但均在花期達到最大值；成熟期與前期相較，未栽培（CK）土壤中對羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸變化分別為3.28%、-7.83%、-6.27%，3種酚酸前后變化較小且差異不顯著，輪作土壤分別下降19.65%、17.98%、39.88%，普通連作土壤分別下降5.36%、16.85%、16.31%，強化連作土壤分別下降45.13%、59.52%、49.15%。3種種植方法中的3種酚酸整體均呈下降且達到顯著差異，說明馬鈴薯在整個生育期中對土壤酚酸含量產(chǎn)生了影響，且不同栽培方式對不同種類的酚酸影響不同。在前期，強化連作土壤3種酚酸均高于其他處理且差異顯著，這3種酚酸含量分別比其他連作方式高出48.26%～56.17%、71.26%～149.60%、29.64%～58.90%，其中玉薯輪作均為最低；至成熟期時，玉薯輪作土壤中3種酚酸含量均為最低，未栽培（CK）土壤的3種酚酸含量均為最高。

3 討論

3.1 HPLC同時測定馬鈴薯土壤中3種酚酸的方法

圖2 成熟期不同連作方式與對照土壤提取液中酚酸色譜圖Fig. 2 Chromatogram of phenolic acids in soil extracts from different continuous cropping patterns and CK at mature stage

表5 不同連作方式下各生育期土壤酚酸含量（μg/g）Table 5 Content of soil phenolic acids in different growth stages under different continuous cropping patterns

利用高效液相色譜法測定酚酸類自毒化感物質(zhì)是目前運用最廣泛、最便捷的方法之一［16］。在使用高效液相色譜法測定時，色譜條件直接影響測定結(jié)果，測定不同化合物所需的溶劑各不相同，主要與目標化合物的溶解性與解離度相關(guān)，測定酚酸常用的有機溶劑有甲醇、乙腈、石油醚等［17］，流動體系對分離度的影響較大，通過調(diào)整有機相與水相的比例可以有效分離多種酚酸，改變柱溫可以影響出峰時間，對分離度也有一定影響。本研究在前人基礎(chǔ)上，同時對色譜溶劑、流動體系、柱溫和波長進行了試驗，篩選出能夠快速分離測定馬鈴薯土壤中3種酚酸（對羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸）含量的方法，且該方法重復性高、精確度較好、檢出限低，各酚酸均有顯著的線性關(guān)系。

3.2 不同種植方式對馬鈴薯土壤中3種酚酸含量的影響

改變種植制度、合理更換栽培方式被認為是有效克服連作障礙的方法之一。符建國等［18］通過分離與鑒定煙田根際土壤酸性有機組分，發(fā)現(xiàn)輪作與連作土壤中的酸性成分發(fā)生了種類與數(shù)量上的變化，說明更改種植制度可以有效影響土壤中酚酸成分的組成。本試驗中，各個時期的土壤中均能檢測出對羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸。馬鈴薯屬于塊莖類作物，在前期主要為地上部分生長發(fā)育，而后期則相反，這可能是土壤酚酸出現(xiàn)先增后減的原因，整體來看，各種植方式中3種酚酸含量均逐漸下降，且隨著生育期推進與未栽培土壤（CK）差異逐漸不顯著，這與葉發(fā)茂等［19］研究結(jié)果相似。植株殘體會產(chǎn)生自毒物質(zhì)［20］，作物殘體的腐解與降解［21］會導致土壤中酚酸積累，強化連作距離上一茬較近，導致在前期強化連作3種酚酸含量均為最高；而玉薯輪作豐富了作物與土壤交換模式，改善了土壤理化環(huán)境，使得馬鈴薯不需要分泌自毒物質(zhì)來抑制其他植物生長發(fā)育［22］，并且馬鈴薯與玉米對土壤養(yǎng)分需求有一定差異［23］，這可能導致玉薯輪作中前期與成熟期3種酚酸含量均為最低，證明玉薯輪作可以減少土壤中3種酚酸含量，但土壤中的酚酸并不是單一作用的，不同酚酸之間存在協(xié)同作用和拮抗作用，對作物的影響程度也有一定差異［24］，不能僅以含量來評估其對連作障礙的影響，因此酚酸對連作障礙的作用機理還有待進一步探究。

4 結(jié)論

在安捷倫XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測波長為λ=280 nm，柱溫為35℃，進樣量20 μL，采用等度洗脫，流動相為75%A液（以冰醋酸調(diào)節(jié)pH=2.60）∶25%B液（乙腈），雙泵體積流量SI=0.8 mL/min的色譜條件下，能夠準確、快速地同時測定土壤中香草酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸等3種酚酸。測定結(jié)果顯示，空白對照土壤中3種酚酸在前后差異較小，3種酚酸在不同連作方式下成熟期均低于前期，其中玉薯輪作土壤中3種酚酸均為最低，表明通過玉薯輪作可以降低土壤中酚酸含量，緩解連作障礙。