雙菌株接種順序?qū)︶u油發(fā)酵的影響

楊俊

廣東美味鮮調(diào)味食品公司，廣東中山，528400

引言

醬油是我國的傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，由于其濃烈的鮮味、色澤以及豐富的營養(yǎng)價(jià)值，廣泛應(yīng)用于人民飲食生活中不可或缺的調(diào)味品。根據(jù)原料可以區(qū)分兩種醬油：我國生產(chǎn)的醬油以大豆為主，日式醬油以等量的大豆和小麥制成。中國式醬油在中國，印度尼西亞，馬來西亞，菲律賓，新加坡，泰國等亞洲地區(qū)占主導(dǎo)地位，而日本式在日本和西方國家更受歡迎[1]。

醬油生產(chǎn)分為兩步發(fā)酵過程：制曲和發(fā)酵，在日式中，通過在等量的熟大豆和小麥粉混合物上生長米曲霉等米曲霉，然后通過將所得曲與含有18-22%NaCl的鹽水溶液混合進(jìn)行發(fā)酵來制備日本式。我國醬油的生產(chǎn)普遍采用米曲霉滬釀3.042純菌種制曲，并且高鹽稀態(tài)發(fā)酵相對(duì)于低鹽固態(tài)發(fā)酵，能夠在工藝上提高醬油品質(zhì)，采用單菌種制曲或者多菌制曲[2]。香氣作為一種體現(xiàn)醬油風(fēng)味特征的重要元素，盡管在醬油組分中的含量甚微，但其成分極為復(fù)雜，對(duì)醬油風(fēng)味的影響極大。傳統(tǒng)發(fā)酵過程中的階段是非常關(guān)鍵的，因?yàn)樵谶@個(gè)階段產(chǎn)生了關(guān)鍵的揮發(fā)性化合物，味道活潑的氨基酸和肽，以及有助于最終調(diào)味醬的糖。乳酸菌嗜鹽四聯(lián)球菌和酵母魯氏接合酵母構(gòu)成驅(qū)動(dòng)發(fā)酵的核心微生物復(fù)合物，不管醬油的來源和生產(chǎn)過程如何，因此微生物種類的增殖順序和它們的平衡非常重要[3]。通過乳酸和酒精發(fā)酵分別產(chǎn)生了豐富的由嗜鹽乳桿菌和魯氏乳桿菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，它們負(fù)責(zé)最終產(chǎn)品的風(fēng)味[4]。醬油中重要的芳香化合物，如乙酸，甲酸，苯甲醛，乙酸甲酯，2-羥基丙酸乙酯，2-羥基-3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮和4-羥基-3-甲氧基苯甲醛是由T. halophilus產(chǎn)生。此外，Z.rouxii在乙醇，高級(jí)醇和4-羥基-2（或5）-乙基-5（或2）-甲基-3（2H）-呋喃酮的形成中起重要作用（HEMF），這對(duì)于最終產(chǎn)品的特征風(fēng)味是必不可少的[5][6][7][8]。

本研究采用米曲霉制曲，以嗜鹽四聯(lián)球菌9477和魯氏接合酵母1682不同次順接種發(fā)酵考察對(duì)醬油風(fēng)味的影響。

1. 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種

米曲霉制曲，以嗜鹽四聯(lián)球菌9477(T.haloophilus)和魯氏接合酵母1682(Z.rouxii)

1.2 試驗(yàn)原料

大豆粉，小麥粉和氯化鈉（NaCl，超純），

1.3 制曲

將大豆粉和小麥粉在121℃下滅菌15分鐘。 將100克大豆粉與120毫升無菌蒸餾水混合，維持大豆粉的水分。將煮熟的大豆粉冷卻至室溫，然后與小麥粉徹底混合（1：1w/w）。用米曲霉孢子接種混合物至終濃度為105個(gè)孢子/g底物。

1.4 豆醬發(fā)酵

作為對(duì)照，（ii）用嗜鹽假單胞菌接種，（iii）用Z.rouxii接種，（iv）與T.haloophilus和Z.rouxii共接種，和（v）用T.haloophilus接種，當(dāng)pH下降到5.0時(shí)，然后依次接種Z.rouxii。接種后，將發(fā)酵液用渦旋勻漿并在30℃溫育30天。在第0、5、10、15、20、25和30天采集樣品。在補(bǔ)充有7%（w/v）NaCl和那他霉素的BHI瓊脂上培養(yǎng)嗜鹽粒細(xì)胞，同時(shí)完成Z.rouxii的細(xì)胞計(jì)數(shù)在YM瓊脂上加入5%（w/v）NaCl和100mg/L氯霉素。

1.5 理化分析

在分析之前，將大豆發(fā)酵液樣品在100℃處理2分鐘，以防止發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶的測(cè)定干擾。 然后將樣品在4℃以10000g離心10分鐘。將視為生醬油的上清液轉(zhuǎn)移至微管并保持在-20℃直至分析。使用酶分析試劑盒（Megazyme，International Ireland Ltd.，Inc。）分析總還原糖（葡萄糖和D-果糖），總?cè)樗幔↙-乳酸和D-乳酸），乙酸和乙醇。使用pH計(jì)監(jiān)測(cè)pH的變化。

1.6 風(fēng)味測(cè)定

對(duì)四種接種發(fā)酵的醬油30天結(jié)束后，利用氣質(zhì)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定風(fēng)味變化。

色譜條件：

色譜柱：DB-17MS毛細(xì)管色譜柱（30m×0.25mm，0.25μm），采用自動(dòng)進(jìn)樣。

進(jìn)樣口溫度：250℃，載氣為He，流速為 1.8mL/min，不分流進(jìn)樣。

程序升溫：起始溫度為40℃，保持3min后以4℃/min的速度升溫至120℃，再以6℃/min的速度升溫至240℃，保持9min。

質(zhì)譜條件：

電子轟擊電離（EI），電子能量為70eV，離子源溫度為230℃，接口溫度為230℃，質(zhì)量掃描范圍為m/z=35～500。

2. 結(jié)果與分析

2.1 還原糖含量變化

對(duì)醬油發(fā)酵過程中，單獨(dú)使用嗜鹽四聯(lián)球菌，單獨(dú)接種魯氏接合酵母，以及兩者共同接種，先后接種對(duì)還原糖的影響如圖1所示。

圖1 還原糖含量變化圖

在接種后5天，含Z.rouxii的所有模型中的還原糖含量下降到檢測(cè)不到的水平，這種還原糖的消耗是由于酵母用于繁殖以及乙醇轉(zhuǎn)化的糖利用，由于在發(fā)酵開始之前，醬醪中的米曲霉熱滅活，所以霉菌不能再進(jìn)行淀粉水解，導(dǎo)致Z. rouxii的還原糖的可用性降低。相比之下，在整個(gè)孵化期間，嗜酸乳桿菌的對(duì)照和單一培養(yǎng)物中還原糖的量仍然很高。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，分別在對(duì)照和單一培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)了10.39g/L和10.42g/L的還原糖，分別比初始量高。這種增加可能是由米曲霉產(chǎn)生的淀粉酶的水解活性引起的，米曲霉在發(fā)酵期間保持活性[9][10]。用嗜鹽菌處理的樣品中更高量的還原糖也表明嗜鹽菌屬利用D-葡萄糖和D-果糖的能力有限。

2.2 乙醇含量變化

對(duì)醬油發(fā)酵過程中，單獨(dú)使用嗜鹽四聯(lián)球菌，單獨(dú)接種魯氏接合酵母，以及兩者共同接種，先后接種對(duì)乙醇的影響如圖2所示。

圖2 乙醇變化量

變化的還原糖含量與醬醪發(fā)酵過程中的乙醇產(chǎn)量有關(guān)，由于它是Z.rouxii生產(chǎn)的主要醇之一，所以監(jiān)測(cè)乙醇在通過糖轉(zhuǎn)化的鹽水發(fā)酵過程中。在接種Z.rouxii后5天，所有含Z. rouxii的樣品中的減少糖消耗與最大乙醇產(chǎn)量同時(shí)發(fā)生。正如預(yù)期的那樣，在用單一的嗜鹽菌和對(duì)照培養(yǎng)物處理的樣品中未檢測(cè)到乙醇[11][12][13]。因?yàn)檫€原糖含量保持穩(wěn)定。一旦所有含Z. rouxii的樣品中的糖耗盡，乙醇含量降至檢測(cè)水平以下。

2.3 總?cè)樗帷⒁宜岷孔兓?/h3>

對(duì)醬油發(fā)酵過程中，單獨(dú)使用嗜鹽四聯(lián)球菌，單獨(dú)接種魯氏接合酵母，以及兩者共同接種，先后接種對(duì)總?cè)樗岬挠绊懭鐖D3所示。

圖3 乳酸變化量

正如預(yù)期的那樣，發(fā)現(xiàn)T.halophilus在乳酸和醋酸生產(chǎn)中起主要作用，令人驚訝的是，盡管T.halophilus生長得到增強(qiáng)，但當(dāng)Z.rouxii存在時(shí)，兩種酸的產(chǎn)生都受到抑制。在單一培養(yǎng)中，嗜酸乳桿菌能夠產(chǎn)生乳酸和乙酸，最高水平分別為0.58g/L和0.26g/L，是所有樣品中最高的。在整個(gè)發(fā)酵過程中，所有醬油樣品中的氨基氮含量通常是恒定的并且有一些波動(dòng)。氨基氮的變化可能是由于嗜鹽嗜熱菌或美拉德反應(yīng)的代謝活性造成的，在醬油中形成深褐色的顏色。該反應(yīng)涉及羰基化合物（例如還原糖和醛）與具有游離氨基的化合物的縮合。

圖4 乙酸含量變化圖

2.4 揮發(fā)性物質(zhì)成分

對(duì)醬油發(fā)酵過程中，單獨(dú)使用嗜鹽四聯(lián)球菌，單獨(dú)接種魯氏接合酵母，以及兩者共同接種，先后接種發(fā)酵后，30天結(jié)束利用氣相色譜質(zhì)譜對(duì)其揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表1。

表1揮發(fā)性物質(zhì)成分表(μg/ml)

在醬醪樣品中共鑒定出23種主要的揮發(fā)性化合物，包括八種醇，三種酸，五種醛，兩種酯，兩種吡嗪，一種呋喃和兩種酮，發(fā)現(xiàn)醇是所有醬油樣品中檢測(cè)到的最豐富的化合物，這與以前在高鹽和低鹽濃度下進(jìn)行的研究一致。用Z.rouxii處理的醬醪中檢測(cè)到總量較高的總醇化合物，作為單一或混合培養(yǎng)物，表明Z.rouxii主要負(fù)責(zé)醇形成。發(fā)現(xiàn)雜醇如苯乙醇（花香，甜味），3-甲基-1-丁醇（麥芽，酸敗和辛辣）和2-甲基-1-丙醇（苦味）是最終的主要醇組分醪。還報(bào)道了通過添加在傳統(tǒng)醬醪發(fā)酵期間從不同階段分離的本地酵母，在還原鹽醬醪中報(bào)道了高產(chǎn)量的上述雜醇。這些雜醇可能是由它們相應(yīng)產(chǎn)生的[14]。

氨基酸通過Z. rouxii通過Ehrlich途徑。醬醪發(fā)酵過程中存在的胞外氨基酸可通過Ehrlich途徑發(fā)生脫氨基或轉(zhuǎn)氨基，產(chǎn)生α-酮酸。α-酮酸作為形成雜醇的主要中間體。雜醇通過脫羧并隨后還原相應(yīng)的α-酮酸而形成[15][16]。與單一培養(yǎng)物相比，Z. rouxii和T. halophilus的組合顯著增加3-辛醇（蘑菇樣）生產(chǎn)。與單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)相比，用連續(xù)接種處理的培養(yǎng)物中乙醇的獲得量顯得更低（p <0.05）。乙醇通常由葡萄糖通過糖酵解途徑和厭氧發(fā)酵由Z.rouxii產(chǎn)生。在發(fā)酵開始之前，所有樣品中都檢測(cè)到其他醇類如2-呋喃甲醇（糖燃燒）和甲醇。所有樣品都含有1-辛烯-3-醇（蘑菇樣），但由于發(fā)酵期間的微生物活性，其量減少。盡管醬油中的大部分醇來源于糖和氨基酸的代謝，但酵母通過代謝相關(guān)的醛化合物也會(huì)產(chǎn)生少量的醇。醛類（糠醛，苯甲醛，2-甲基丙醛，3-甲基丙醛，3甲基丁醛和2-甲基丁醛）是大豆飼料中發(fā)現(xiàn)的第二大香味化合物。從發(fā)酵開始，它們就存在于大豆飼料中。然而，由于Z. rouxii的活性，其數(shù)量顯著減少，尤其是混合培養(yǎng)[17]。這一假設(shè)得到了以下事實(shí)的支持：

Z.rouxii處理的樣品比T. halophilus的對(duì)照和單一培養(yǎng)物高。這些醛對(duì)醬油麥芽和堅(jiān)果香氣影響較大。發(fā)現(xiàn)乙酸是嗜鹽菌的單一培養(yǎng)物中的主要揮發(fā)物。與其他樣品相比，其量顯得（p <0.05），因?yàn)橐阎塞}菌已知產(chǎn)生乙酸。醋酸會(huì)給最終產(chǎn)品帶來酸味。 生產(chǎn)3-甲基丁酸有利于嗜鹽菌和魯氏假單胞菌的單一培養(yǎng)。 據(jù)報(bào)道，它是我國醬油中的主要香味化合物，并且對(duì)強(qiáng)烈的刺激性，出汗和類似奶酪的氣味產(chǎn)生影響。這種支鏈酸可能由Z. rouxii通過Ehrlich途徑從大豆中所含的支鏈氨基酸生產(chǎn)。 混合培養(yǎng)物的存在似乎抑制了3-甲基丁酸的產(chǎn)生。在用Z.rouxii發(fā)酵的醬油樣品中檢測(cè)到包含乙酸異戊酯（香蕉香料）和乙酸2-苯基乙酯（蜂蜜，玫瑰色）的乙酸酯?；旌吓囵B(yǎng)物顯著增加乙酸異戊酯的產(chǎn)量（p <0.05）。