人溶菌酶基因密碼子優(yōu)化及其在小鼠乳腺中的表達(dá)

楊雪珍，葉亞瓊，何蘭花，張綺瓊，王 曄，劉 燊*

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物科學(xué)系，廣東佛山528000）

溶菌酶（lysozyme），又稱胞壁質(zhì)酶，根據(jù)其來源可分為動物型、植物型、細(xì)菌型和T4噬菌體型，其中動物型又分為C型、G型和I型。與蛋清溶菌酶類似，人溶菌酶（human lysozyme,hLZ）屬于動物型的C型。在人體內(nèi)，人溶菌酶作為一種非特異性免疫因子，是免疫系統(tǒng)和乳汁構(gòu)成（0.4 mg/mL）的重要成員之一，發(fā)揮著殺菌消炎、免疫調(diào)節(jié)、改善胃腸道菌群等作用。然而，溶菌酶在其它動物乳汁中的表達(dá)卻很低，如牛乳 0.13 μg/mL、山羊乳 0.25 μg/mL、豬乳 0.065 μg/mL［1-2］，且其生物活性也明顯低于人溶菌酶，如蛋清溶菌酶活性只有人溶菌酶的1/3［3］，其中的原因值得進(jìn)一步探究。人溶菌酶由130個氨基酸組成，分子量為14.7 kD，等電點(diǎn)為11。人溶菌酶基因位于12號染色體長臂上（12q15），序列全長6 807 bp（GenBank序列號：X14008），含有4個外顯子和3個內(nèi)含子。人溶菌酶作用機(jī)理主要為水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖N-乙酰葡萄糖胺與N-乙酰氨基葡萄糖乳酸之間的β-1，4糖苷鍵，從而破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁。同時，人溶菌酶還能螯合脂多糖和脂磷壁酸從而抑制炎癥反應(yīng)［4］，以及對中性粒細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，減少促炎癥因子的產(chǎn)生［5］。

利用轉(zhuǎn)基因動物，以動物乳腺為“生產(chǎn)車間”表達(dá)外源蛋白，是新一代的動物乳腺生物反應(yīng)器技術(shù)。與微生物發(fā)酵和動物細(xì)胞培養(yǎng)相比，它具有生物活性高、易分離提純、產(chǎn)量高等突出特點(diǎn)。人溶菌酶乳腺生物反應(yīng)器的嘗試最早為美國加州大學(xué)戴維斯分校Murray實(shí)驗室，他們使用20 kb αS1酪蛋白啟動子和人溶菌酶cDNA序列構(gòu)建了乳腺表達(dá)載體，表達(dá)量在250～710 μg/mL間［6］，之后使用該表達(dá)載體獲得了轉(zhuǎn)基因羊，表達(dá)量為270 μg/mL［7］。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)研究人員利用商業(yè)化載體pBC1（4.1 kb山羊β-酪蛋白啟動子）和人溶菌酶基因組DNA構(gòu)建了表達(dá)載體，獲得轉(zhuǎn)基因小鼠的最高表達(dá)量為1.4 mg/mL［8］，但轉(zhuǎn)基因牛的表達(dá)量卻低至25.96 μg/mL［9］。之后，改造和利用人乳鐵蛋白基因座作為控制元件，調(diào)控人溶菌酶基因組DNA，獲得轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁的表達(dá)量為1.76 mg/mL［10］，獲得了轉(zhuǎn)基因牛乳的表達(dá)量為3.1 mg/mL［11］，實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。但是，伴隨著轉(zhuǎn)基因輿論壓力的增大和基因編輯技術(shù)（zinc-finger nucleases，ZFN；transcription activator like effector nucleases，TALENs 和 clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR/Cas）日益成熟的情況下，原有的人溶菌酶乳腺生物反應(yīng)器獲得生物安全證書審批通過的可能性益加漫長，需要整合新的生物技術(shù)，制備外源基因定點(diǎn)整合、重組蛋白高效表達(dá)的人溶菌酶轉(zhuǎn)基因動物［12］。為此，西北農(nóng)林科技大學(xué)研究人員設(shè)計了鋅指核糖核酸酶（ZFN）打靶體系，利用內(nèi)源的αS2酪蛋白調(diào)控序列，指導(dǎo)人溶菌酶基因cDNA的表達(dá)，表現(xiàn)為微量表達(dá)（23～31 μg/mL）［13］，需要繼續(xù)提高表達(dá)量才有產(chǎn)業(yè)化價值，而密碼子優(yōu)化策略是提高外源基因表達(dá)量的方法之一，目前尚沒有關(guān)于人溶菌酶優(yōu)化密碼子乳腺表達(dá)研究的報道。

基于不同物種或同一物種的不同器官/組織對密碼子的使用頻率不同，密碼子優(yōu)化策略可以顯著提高其表達(dá)量［14］。本研究根據(jù)牛乳主要蛋白的密碼子使用偏好，優(yōu)化了人溶菌酶基因cDNA序列，連入已驗證好的乳腺表達(dá)載體中（pMWAP-Zeo，包含8.5 kb 5’和 8.0 kb 3’小鼠乳清酸蛋白基因座調(diào)控序列）［15］，制備了轉(zhuǎn)基因小鼠，并驗證了優(yōu)化的人溶菌酶密碼子表達(dá)效率，以為外源基因定點(diǎn)整合的人溶菌酶轉(zhuǎn)基因動物的高效表達(dá)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

乳腺表達(dá)載體pMWAP-Zeo：由本實(shí)驗室構(gòu)建和保存；密碼子優(yōu)化設(shè)計的hLZ cDNA序列、PCR引物：由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；實(shí)驗動物：昆明白小鼠購自國家計劃生育研究所動物部；分子生物學(xué)試劑（包括：pMD19-T載體、各種DNA內(nèi)切酶、連接酶、聚合酶等；以及dNTP混合物、DNA分子量標(biāo)記、感受態(tài)細(xì)胞等）：購于大連TaKaRa公司；標(biāo)準(zhǔn)人溶菌酶純品：購自Sigma-Aldrich公司；人溶菌酶多克隆抗體：購自US Biological Inc.公司。

1.2 pMWAP-hLZ-OP乳腺表達(dá)載體的構(gòu)建

經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人溶菌酶cDNA序列（hLZ-OP）由全基因合成獲得，并且在序列兩端各加上一個NotⅠ酶切位點(diǎn)，以及在5′端的酶切位點(diǎn)與ATG之間加上ACC堿基以使起始序列符合Kozak規(guī)則［16］。pMWAP-Zeo由本實(shí)驗室構(gòu)建和保存，含有小鼠乳清酸蛋白（mWAP）基因座的8.5 kb 5’端，8.0 kb 3’端調(diào)控序列，以及新霉素（Zeocin）基因（替代mWAP基因）及其兩端的NotⅠ酶切位點(diǎn)。通過NotⅠ酶切位點(diǎn)，將hLZ-OP DNA序列與pMWAP-Zeo載體相連，構(gòu)建pMWAP-hLZ-OP乳腺表達(dá)載體。

1.3 轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR檢測

表達(dá)載體pMWAP-hLZ-OP經(jīng)PvuI和SalI酶切后，去除了原核序列骨架，回收得到線性化的目標(biāo)片段。通過顯微注射，將回收片段注射到受精卵的雄原核內(nèi)，并將此受精卵移植到假孕受體鼠的輸卵管內(nèi)，出生小鼠。

取2～3周齡小鼠的尾巴組織樣，提取DNA，使用3對引物鑒定小鼠的轉(zhuǎn)基因陽性和插入基因的完整性（圖 3A）。P1 引物，F(xiàn)：5′GAT CCA CAG GAC GGG TGT 3′，R:5′CTC CAG CCC ACT ATT TAG ACA 3′，產(chǎn)物長度 538 bp；PcDNA 引物，F(xiàn)：5′ACC ATG AAG GCC CTG ATC GTG 3′，R：5′TTA CAC TCC ACA TCC CTG CAC 3′，產(chǎn)物長度 450 bp；P2 引物，F(xiàn)：5′CCG AGT GAA TAA ATT AGA CA 3′，R：5′ACG GAA ATG TTG AAT ACT CAT 3′，產(chǎn)物長度 568 bp。

1.4 轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁的Western blot檢測

在轉(zhuǎn)基因小鼠生出仔鼠后的第7 d，按照文獻(xiàn)方法采集轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁［14］。將乳汁離心去除乳脂，調(diào)節(jié)pH值至4.0左右去除酪蛋白，再將pH值調(diào)至8.0，終稀釋濃度為1∶10。之后進(jìn)行蛋白電泳，乳清上樣量為10 μL，轉(zhuǎn)移至纖維素膜，然后用兔抗人溶菌酶多克隆抗體和羊抗兔二抗進(jìn)行Western blot檢測重組溶菌酶的表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 人溶菌酶密碼子優(yōu)化

對牛乳主要的蛋白質(zhì)（α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、以及5種酪蛋白等）密碼子的使用偏好性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)牛乳蛋白質(zhì)基因偏好以CG結(jié)尾（未發(fā)表數(shù)據(jù)），而野生型（WT）人溶菌酶基因偏好以CT結(jié)尾。基于密碼子使用規(guī)則，在不改變編碼氨基酸序列的基礎(chǔ)上對447 bp的人溶菌酶基因密碼子進(jìn)行了偏好CG結(jié)尾的優(yōu)化設(shè)計（圖1）。相比野生型（WT），優(yōu)化后的hLZ基因（hLZ-OP）共改變了95個堿基，約占hLZ基因堿基總數(shù)的21.3%，G+C含量由46.9%上升至57.9%。

圖1 人溶菌酶基因的密碼子優(yōu)化

2.2 乳腺表達(dá)載體pMWAP-hLZ-OP構(gòu)建

全基因合成的447 bp hLZ-OP首先連入pMD 19-T載體，測序驗證cDNA序列和酶切位點(diǎn)正確后，命名為pMD19-hLZ-OP載體。乳腺表達(dá)載體pMWAP-Zeo由本實(shí)驗室構(gòu)建和保存，含有mWAP基因座的8.5 kb 5’端調(diào)控序列，兩端為NotⅠ酶切位點(diǎn)的Zeocin基因和8.0 kb 3’端調(diào)控序列。使用NotⅠ內(nèi)切酶分別酶切pMD19-hLZ-OP和pMWAP-Zeo載體，膠回收hLZ-OP和pMWAP目標(biāo)片段。將兩段回收的目標(biāo)片段通過NotⅠ酶切位點(diǎn)連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選單克隆菌落測序并驗證出正確的插入方向后，即構(gòu)建完pMWAP-hLZ-OP乳腺表達(dá)載體（圖2）。

圖2 人溶菌酶基因的密碼子優(yōu)化

2.3 轉(zhuǎn)基因小鼠制備和PCR鑒定

乳腺表達(dá)載體pMWAP-hLZ-OP經(jīng)PvuI和SalI酶切線性化后，去除原核骨架序列，再通過顯微注射技術(shù)，注入小鼠受精卵的雄原核內(nèi)。移植約500枚受精卵到12只受體鼠的輸卵管內(nèi)，共出生21只仔鼠。

采集鼠尾組織，提取基因組，進(jìn)行PCR鑒定。使用3對引物鑒定轉(zhuǎn)基因陽性和插入載體的完整性。引物P1位于表達(dá)載體的5′端，產(chǎn)物長度538 bp；引物P2位于表達(dá)載體的3′端，產(chǎn)物長度568 bp；引物PcDNA擴(kuò)增的是hLZ cDNA序列，產(chǎn)物長度450 bp（圖3A）。結(jié)果顯示，共有4只仔鼠（編號為：4、6、9和19）為轉(zhuǎn)基因陽性小鼠，陽性率19.04%，且插入的表達(dá)載體均具備完整性（圖3B）。

圖3 人溶菌酶轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR鑒定

2.4 重組人溶菌酶在乳腺中的表達(dá)

轉(zhuǎn)基因小鼠配種并生出仔鼠后，采集乳汁，進(jìn)行Western blot檢測重組人溶菌酶在乳汁中的表達(dá)。結(jié)果如圖4所示，4只轉(zhuǎn)基因小鼠的乳清樣品均獲得了陽性雜交信號，但又明顯低于陽性對照（PC，30 ng/mL的人溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品）信號。因此，4、6、9、19轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中均有微量的重組人溶菌酶表達(dá)。

圖4 Western blot檢測鼠乳中rhLZ的表達(dá)

2.5 外源基因的遺傳檢測

4只原代轉(zhuǎn)基因小鼠與非轉(zhuǎn)基因公鼠配種后，共出生42只后代，其中20只經(jīng)PCR鑒定為轉(zhuǎn)基因陽性后代，陽性率為47.6%，基本符合孟德爾遺傳規(guī)律。這表明，轉(zhuǎn)基因小鼠的外源基因均可以穩(wěn)定遺傳給下一代。

表1 表達(dá)載體pMWAP-hLZ-OP獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠情況

3 討論

利用動物乳腺生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)藥用/保健蛋白，已是一項技術(shù)成熟且正在產(chǎn)業(yè)化的生物技術(shù)，且越來越表現(xiàn)獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢［17］。人溶菌酶是人乳蛋白的主要成分之一，在醫(yī)藥保健產(chǎn)品市場，特別是在嬰幼兒奶粉方面，具有巨大的潛在價值。傳統(tǒng)的細(xì)菌、酵母和細(xì)胞發(fā)酵等方法表達(dá)重組人溶菌酶存在著許多缺陷，無法進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。而市場上銷售的雞蛋清溶菌酶，因為致敏性也極少能夠應(yīng)用于人類的保健產(chǎn)品。因此，利用動物乳腺生物反應(yīng)器來生產(chǎn)重組人溶菌酶，制備“人乳化”牛奶一直是科學(xué)家的夢想［18］。

目前，美國加州大學(xué)戴維斯分校和中國農(nóng)業(yè)大學(xué)已分別獲得了具備產(chǎn)業(yè)化潛能的人溶菌酶轉(zhuǎn)基因羊和轉(zhuǎn)基因奶牛［6，10］，西北農(nóng)林科技大學(xué)研究人員利用內(nèi)源的αS2酪蛋白啟動子，指導(dǎo)人溶菌酶基因cDNA的表達(dá)，但是只有微量表達(dá)13，密碼子優(yōu)化策略是提高外源基因表達(dá)量的方法之一。

本研究主要根據(jù)牛乳主要蛋白偏好以CG結(jié)尾的特征，對野生型人溶菌酶基因進(jìn)行了偏好CG結(jié)尾的優(yōu)化設(shè)計，使用經(jīng)驗證過的乳腺表達(dá)載體pMWAP-Zeo，來驗證密碼子優(yōu)化后的人溶菌酶基因的乳腺表達(dá)效率。原核注射后獲得4只轉(zhuǎn)基因小鼠，能按照孟德爾遺傳規(guī)律將將外源基因傳遞給下一代，Western blot檢測顯示小鼠乳汁中有微量重組人溶菌酶的表達(dá)。因此，密碼子優(yōu)化后的人溶菌酶基因可以在小鼠乳腺中獲得有效表達(dá)。由于影響外源基因表達(dá)的因素很多，諸如“位置效應(yīng)”［20］、啟動子的強(qiáng)弱、使用基因組DNA或cNDA、起始位點(diǎn)序列［16］等，這需要進(jìn)一步的研究才能得到最優(yōu)的結(jié)果。本研究可為外源基因定點(diǎn)整合的人溶菌酶轉(zhuǎn)基因動物的高效表達(dá)研究奠定基礎(chǔ)。

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