負載黃酮類藥物細菌纖維素的抑菌效果的研究

許云華 ，陳菁鈺 ，羅 寧 ，姚文穎

（1.江蘇師范大學連云港校區(qū)生命科學系，江蘇連云港222006；2.連云港師范高等?？茖W校生命科學系，江蘇連云港222006）

細菌纖維素（Bacterial cellulose，BC）是指在不同條件下，由醋酸菌屬（Acetobacter）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、根瘤菌屬（Rhizobium）和八疊球菌屬（Sarcina）等中的某種微生物合成的纖維素的統(tǒng)稱［1-5］。由于其具有空間三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，能有效阻止微生物的侵入，因此可應用于醫(yī)用敷料，與現(xiàn)有的人工皮膚和傷口輔料相比，該膜具有機械強度高、與皮膚相容性好、無刺激性，能有效緩解疼痛，防止細菌感染，促進傷口快速愈合，有利于皮膚組織生長等優(yōu)點，此膜還可作為緩釋藥物的載體攜帶各種藥物，利于皮膚表面給藥，促使創(chuàng)面的愈合和康復［6］。

黃酮類化合物（Flavonoids）（亦稱類黃酮）是廣泛存在于自然界中的多酚類植物次級代謝產(chǎn)物，其數(shù)量種類繁多,結(jié)構(gòu)類型復雜多樣，具有許多潛在的藥用價值和生物活性，特別是抗氧化及抗自由基作用和防腐抑菌等生理作用，其中抑菌活性是研究熱點之一［7］。黃酮類化合物的生理活性與獨特的化學結(jié)構(gòu)密不可分，眾多研究表明，類黃酮的抑菌活性主要與黃酮芳環(huán)上羥基多少和羥基的位置有關。張金桐等［8］在黃酮類化合物的生物活性與電子結(jié)構(gòu)關系的量子化學研究中得出結(jié)論，黃酮分子中C4=O，C5－OH和 C7－OH 是抗菌活性的首要基團；其次為 C3－OH 基團；C’3－OH，C’4－OH 也具備一定的抗菌活性。

由于黃酮類化合物具有良好的抑菌效果，可以抑制炎性生物酶的滲出，促進傷口愈合和止痛，所以對進行負載黃酮類藥物的細菌纖維素抑菌效果的研究有著一定的理論依據(jù)。而且現(xiàn)國內(nèi)關于細菌纖維素醫(yī)用敷料的研究大多數(shù)是負載銀離子，殼聚糖等，目前對負載黃酮類藥物的細菌纖維素的抑菌效果及促進傷口愈合和止痛的研究少見報道。因此本文重點對黃酮類似物如槲皮素、桑色素以及黃芩素負載在細菌纖維素上進行的抑菌研究，以期為細菌纖維素醫(yī)用敷料關于黃酮類化合物的利用及進一步開發(fā)提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 實驗菌種

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌（連云港師范高等?？茖W校微生物實驗室冷凍保藏）。

1.1.2 實驗材料

直徑為1 cm的細菌纖維素膜（南京理工大學化學生物功能材料研究所提供，1 cm打孔器打孔）。

1.1.3 實驗藥品

槲皮素，桑色素，冰醋酸，牛肉膏，蛋白胨，瓊脂粉，氯化鈉，氫氧化鈉（國藥集團化學試劑有限公司）黃芩素（合肥博美生物科技有限責任公司）。

1.1.4 實驗器材

高壓蒸汽滅菌鍋、超凈臺、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、水浴鍋等。

1.2 實驗方法

1.2.1 配置牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（固體、液體培養(yǎng)基）

牛肉膏 3 g、蛋白胨 10 g、氯化鈉 5 g、瓊脂 15 g、水 1 000 ml、PH7.2-7.4。

1.2.2 菌種的活化與提純

將配制好的培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿以及其他有關器皿放進高壓蒸汽滅菌鍋中進行滅菌，將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌從斜面培養(yǎng)基上用平板劃線法接種到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，放入37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后的兩種菌取2-3環(huán)單菌落接種到滅菌后的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h。最后用涂布平板法接種到固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h。

1.2.3 配置不同濃度的黃酮類藥物（槲皮素、桑色素、黃芩素）

稱取不同質(zhì)量的黃酮類藥物（槲皮素、桑色素、黃芩素），溶于冰醋酸中，配制得不同濃度的槲皮素溶液（大腸桿菌 1，2，3，4，5 mmol·L-1，金黃色葡萄球菌 1，2，3，4，5 mmo·/L-1）、桑色素溶液（大腸桿菌0.673 mg·mL-1、0.683 mg·mL-1、0.690 mg·mL-1、0.693 mg·mL-1，金黃色葡萄球菌 0.350 mg·mL-1、0.370 mg·mL-1、0.380 mg·mL-1、0.400 mg·mL-1）、黃芩素（大腸桿菌 0.20 mg·mL-1、0.36 mg·mL-1、0.52 mg·mL-1、0.60 mg·mL-1、0.76 mg·mL-1、0.90 mg·mL-1，金黃色葡萄球菌 0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.35 mg·ml-1、0.45 mg·mL-1）。

同時用直徑1 cm打孔器將BC膜處理好后，浸泡于配制好的黃酮類藥物溶液中，浸泡24小時。

1.2.4 抗菌活性檢測（定性方法：抑菌圈法）

參照GB/T 20944.1-2007《紡織品抗菌性能的評價第1部分：瓊脂擴散法》。

將制備好的負載不同濃度黃酮類藥物的BC膜平鋪在平板中央，37℃恒溫倒置培養(yǎng)48 h。設置純細菌纖維素（BC膜只浸泡于冰醋酸中）作為對照組。每個濃度用3-4個培養(yǎng)皿作為平行實驗。

檢查是否有抑菌圈，有抑菌圈出現(xiàn)則測量抑菌圈與負載黃酮類藥物細菌纖維素材料膜半徑之差，每個試樣至少測量三處，按下式計算試樣的抑菌帶寬度。

抑菌帶寬度H=D-d

H—抑菌帶寬度（mm）；D—抑菌帶外半徑的平均值（mm）；d—BC膜的半徑（mm）

細菌在培養(yǎng)皿中，能夠迅速生長，但由于材料具有抗菌能力，細菌在樣品的周圍會產(chǎn)生一個明顯的細菌阻滯圈，即抑菌圈。樣品的抗菌性能由抑菌圈的抑菌帶寬度大小來評價，抑菌圈的抑菌帶寬度越大，表明該材料的抗菌效果越好；反之，則表明該材料的抗菌效果越差。

2 結(jié)果與討論

2.1 負載不同濃度槲皮素的BC膜對革蘭氏菌的抑菌效果

2.1.1 通過負載不同濃度槲皮素的BC膜對大腸桿菌的抑菌效果的實驗，得到如下表2.1.1實驗數(shù)據(jù)及圖2.1.1關系曲線。

表2 .1.1 不同濃度的槲皮素對大腸桿菌的抑菌效果

圖2 .1.1 槲皮素濃度對大腸桿菌的抑菌效果曲線

結(jié)果分析：由圖2.1.1槲皮素濃度對大腸桿菌的抑菌效果曲線可以直觀的看出，隨著槲皮素濃度的不斷增大抑菌帶寬度也隨之增大，表明負載槲皮素的BC膜對大腸桿菌的抑菌效果越好；當濃度為3 mmol/L時，抑菌帶的寬度達到最大值，即抑菌效果最好；當濃度大于3 mmol/L時，抑菌效果緩慢下降達到一定的平衡。

根據(jù)表2.1.1發(fā)現(xiàn)，對照組中出現(xiàn)抑菌圈，而且對照組抑菌帶寬度值比實驗組的值要大得多，其實細菌纖維素本身不具有抗菌性能，但是實驗所用的溶劑為冰醋酸，本身具有一定的抑菌效果，所以對照組中出現(xiàn)抑菌圈。同時本次實驗中出現(xiàn)雙抑菌圈，上述表中數(shù)據(jù)（除對照組外）均采用小抑菌圈的數(shù)值原因是，貼BC膜時未將膜上多余的冰醋酸溶液濾干，導致培養(yǎng)時，多余的冰醋酸擴散較快先發(fā)揮較弱抑菌作用產(chǎn)生大抑菌圈，而負載在BC膜上的黃酮類藥物后發(fā)揮抑菌作用產(chǎn)生小抑菌圈，所以對照組的抑菌圈是冰醋酸擴散導致的大圈，數(shù)值肯定比實驗組的值要大。

2.1.2 通過負載不同濃度槲皮素的BC膜對金黃色葡萄球菌的抑菌效果的實驗，得到如下表2.1.2實驗數(shù)據(jù)及圖2.1.2。

表2 .1.2 不同濃度的槲皮素對金黃色葡萄球菌抑菌效果

圖2 .1.2 槲皮素濃度對金黃色葡萄球菌的抑菌效果曲線

結(jié)果分析：由圖2.1.2槲皮素濃度對金黃色葡萄球菌的抑菌效果曲線可以直觀的看出，隨著槲皮素濃度的不斷增大抑菌帶寬度也隨之增大，表明負載槲皮素的BC膜對金黃色葡萄球菌的抑菌效果越好；當濃度為4 mmol/L時，抑菌帶的寬度達到最大值，即抑菌效果最好；當濃度大于4 mmol/L時，抑菌效果迅速下降。

2.2 負載不同濃度桑色素的BC膜對革蘭氏菌的抑菌效果

2.2.1 通過負載不同濃度桑色素的BC膜對大腸桿菌的抑菌效果的實驗，得到如下表2.2.1實驗數(shù)據(jù)及圖2.2.1。

表2 .2.1 不同濃度的桑色素對大腸桿菌的抑菌效果

圖2 .2.1 桑色素濃度對大腸桿菌的抑菌效果曲線

結(jié)果分析：由圖2.2.1桑色素濃度對大腸桿菌的抑菌效果曲線可以看出，有一個最小峰和一個最大峰，在桑色素溶液濃度為0.690 mg/ml時，此時抑菌圈最大，可得出桑色素對大腸桿菌的最適抑菌濃度為0.690 mg/ml。

2.2.2 通過負載不同濃度桑色素的BC膜對金黃色葡萄球菌的抑菌效果的實驗，得到如下表2.2.2實驗數(shù)據(jù)及圖2.2.2關系曲線。

表2 .2.2 不同濃度的桑色素對金黃色葡萄球菌的抑菌效果

圖2 .2.2 桑色素濃度對金黃色葡萄球菌的抑菌效果曲線

由關系圖2.2.2中可以看出，在濃度為0.38 mg/ml之前隨著濃度的升高，抑菌圈也隨之增大，但當濃度大于0.38 mg/ml時，抑菌圈變小，所以可以得出桑色素對金黃色葡萄球菌的最適抑菌濃度為0.38 mg/ml。

2.3 負載不同濃度黃芩素的BC膜對革蘭氏菌的抑菌效果

2.3.1 通過負載不同濃度黃芩素的BC膜對大腸桿菌的抑菌效果的實驗，得到如下表2.3.1實驗數(shù)據(jù)及圖2.3.1關系曲線。

表2 .3.1 不同濃度的黃芩素抑制大腸桿菌的效果

圖2 .3.1 黃芩素濃度對大腸桿菌的抑菌效果曲線

結(jié)果分析：Chinnam等研究證實黃芩素對大腸桿菌抑制作用的半數(shù)有效濃度（IC50）約為0.078黃芩素濃度（mg/ml）［9］。根據(jù)IC50的值制取六個濃度的黃芩素溶液，研究抑制大腸桿菌生長的最佳濃度。從圖2.3.1可知當黃芩素濃度為0.36 mg/ml時，抑菌圈平均值最大，為1.73 cm，即為最佳濃度。

2.3.2 通過負載不同濃度黃芩素的BC膜對金黃色葡萄球菌的抑菌效果的實驗，得到如下表2.3.2實驗數(shù)據(jù)及2.3.2曲線圖。

表2 .3.2 不同濃度的黃芩素抑制金黃色葡萄球菌的效果

圖2 .3.2 黃芩素濃度對金黃色葡萄球菌的抑菌效果曲線

結(jié)果分析：根據(jù)以往研究可知，黃芩素可抑制金黃色葡萄球菌的生長，其最低抑菌濃度為0.04 mmol/L［10］，黃芩素的分子量為270.24，即0.010 8 mg/ml，依據(jù)此數(shù)據(jù)，配制五個不同濃度的黃芩素溶液來研究抑制金黃色葡萄球菌的最佳濃度。從實驗數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知，當黃芩素濃度為0.1 mg/ml時，抑菌圈平均值最大為1.71 cm；當黃芩素濃度＞0.35 mg/ml時，雖然抑菌效果呈上升趨勢，但會使用更多的黃芩素；當濃度更小時，則會超出分析天平的量程或者需要更多的溶劑。綜合考慮，抑制金黃色葡萄球菌生長的黃芩素最佳濃度為0.1 mg/ml。

文章所做關于負載不同濃度黃酮類藥物的BC膜對革蘭氏菌的抑菌效果的實驗中，出現(xiàn)雙抑菌圈的現(xiàn)象，在培養(yǎng)抑菌24 h后，出現(xiàn)一個較大的抑菌圈，抑菌效果不明顯仍有較多菌落，48 h后再次觀察，出現(xiàn)較小的抑菌圈，小抑菌圈中的菌落較少抑菌效果較好，同時大抑菌圈未消失。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能由于實驗所用的溶劑為冰醋酸，本身具有一定的抑菌效果，而且貼BC膜時未將膜上多余的冰醋酸溶液濾干，導致培養(yǎng)時，多余的冰醋酸擴散較快先發(fā)揮較弱抑菌作用，而負載在BC膜上的黃酮類藥物后發(fā)揮抑菌作用，因此，實驗分析所用全部數(shù)據(jù)為抑菌圈的小圈（內(nèi)圈）數(shù)值。

3 結(jié)論

經(jīng)過負載黃酮類藥物BC膜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果的實驗，可以得出負載槲皮素的BC膜對大腸桿菌的最適抑菌濃度為3 mmol/L，抑菌圈的半徑為1.31 cm，對金黃色葡萄球菌對的最適抑菌濃度為4 mmol/L，抑菌圈的半徑為1.23 cm；負載桑色素的BC膜對大腸桿菌的最適抑菌濃度為0.690 mg/ml，抑菌圈的半徑為1.22 cm，對金黃色葡萄球菌對的最適抑菌濃度為0.380 mg/ml，抑菌圈的半徑為1.9 cm；負載黃芩素的BC膜對大腸桿菌的最適抑菌濃度為0.36 mg/ml，抑菌圈的半徑為1.73 cm，對金黃色葡萄球菌對的最適抑菌濃度為0.1 mg/ml，抑菌圈的半徑為1.71 cm。

細菌纖維素功能材料是當今生物技術和材料科學發(fā)展的前沿之一，其功能化研究日益重要，受到了各國科學家的高度關注。同時天然藥物中黃酮類化合物的抑菌作用也正在不斷的挖掘中，將植物中提取的黃酮類化合物運用到臨床上還需要進一步深人研究。［11］但目前對負載黃酮類藥物的細菌纖維素的抑菌效果及促進傷口愈合和止痛的研究仍少見報道。文章進行的負載黃酮類藥物細菌纖維素的抑菌研究，其制備過程簡便、環(huán)保、生產(chǎn)成本低，有望為醫(yī)療業(yè)藥業(yè)拓開新的思路，實現(xiàn)以后敷料產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)。

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