血細(xì)胞微粒制備方法的建立及評(píng)價(jià)

趙睿婷，周菊，詹達(dá)強(qiáng)，田野，張建寧，2，袁恒杰，2

(1天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津300052；2天津市神經(jīng)病學(xué)研究所)

微粒是細(xì)胞受到刺激活化或凋亡過程中產(chǎn)生的直徑為0.1～1.0 μm的囊泡狀結(jié)構(gòu)[1]。微粒具有細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及一定量的細(xì)胞質(zhì)，會(huì)攜帶來源細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物[2]。1967年Wolf等[3]首次發(fā)現(xiàn)血小板來源的微粒，同時(shí)證明血小板來源的微粒富含磷脂，具有促進(jìn)凝血的作用。隨后越來越多的研究表明，血液中的血小板、白細(xì)胞和紅細(xì)胞等受到活化或凋亡刺激時(shí)均可釋放微粒，不同來源微粒參與細(xì)胞的黏附、凋亡、免疫應(yīng)答、血管重塑、血管生成、止血及血栓生成等過程，與機(jī)體生理狀態(tài)的維持及多種疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[4]。不同血液細(xì)胞來源的微粒具有各自特定的功能與作用，微粒的準(zhǔn)確測(cè)定及不同來源微粒的分離和獲取一直是微粒研究中的難點(diǎn)。本研究擬建立血細(xì)胞微粒的制備方法并對(duì)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，為不同來源的血細(xì)胞微粒后續(xù)的基礎(chǔ)功能相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備與試劑 流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。透射電鏡購自日本Hitachi公司。常溫離心機(jī)購自美國Beckman Coulter公司。超速離心機(jī)購自美國Beckman公司。Megamix標(biāo)準(zhǔn)微粒購自法國Biocyte公司。熒光標(biāo)準(zhǔn)品SPHEROTM Accurate Count Ultra Rainbow Fluorescent Particles(直徑3.8 μm)購自美國spherotech公司。抗體藻紅蛋白(PE)-鈣離子依賴性磷酯結(jié)合蛋白V(Annexin V)和細(xì)胞表面標(biāo)記物抗體異硫氰酸熒光素(FITC)-血型糖蛋白A(CD235a)、FITC-白細(xì)胞共同抗原(CD45)和FITC-血小板糖蛋白(CD42b)購自美國BD公司。紅細(xì)胞裂解液購自中國碧云天試劑公司。

1.2 血細(xì)胞微粒的制備方法

1.2.1 血細(xì)胞的提取 ①紅細(xì)胞的提?。喝? mL枸櫞酸鈉抗凝處理的新鮮健康人全血4 ℃ 150 g離心20 min，取最下層；以無菌PBS溶液重懸，4 ℃ 150 g離心20 min，取最下層，重復(fù)此過程3次，洗滌紅細(xì)胞，置于-80 ℃冰箱保存，備用。②白細(xì)胞的提?。喝? mL枸櫞酸鈉抗凝處理的新鮮健康人全血，按1 mL全血中加入10 mL紅細(xì)胞裂解液的比例加入37 ℃預(yù)熱的紅細(xì)胞裂解液，渦旋混勻；室溫孵育10～15 min，400 g離心5 min；去除上清液，加入10 mL無菌PBS溶液洗滌一次白細(xì)胞，如仍有大量紅細(xì)胞殘留，重復(fù)以上步驟；將所得白細(xì)胞置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。③血小板的提?。喝? mL枸櫞酸鈉抗凝處理的新鮮健康人全血，4 ℃ 150 g離心20 min，取上層富含血小板血漿(PRP)；將PRP于4 ℃ 1 500 g離心20 min，沉淀即為血小板，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 不同血細(xì)胞來源微粒的制備 取紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板于室溫融化后，加入1 mL無菌PBS溶液，置于組織勻漿器中充分研磨。于4 ℃ 1 500 g離心20 min，取上清。上清液于4 ℃ 13 000 g離心2 min，取上清。上清液置于超高速離心機(jī)中，于4 ℃ 10 0000 g離心1 h，沉淀即為紅細(xì)胞微粒、白細(xì)胞微粒和血小板微粒，用500 μL的無菌PBS溶液重懸。血細(xì)胞微粒制備完成后，需用流式細(xì)胞儀對(duì)微粒的表面標(biāo)志物及濃度進(jìn)行測(cè)定，以確認(rèn)微粒是否成功制備。根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，依需調(diào)整微粒的濃度。

1.3 血細(xì)胞微粒形態(tài)觀察 采用透射電鏡觀察。將紅細(xì)胞微粒、白細(xì)胞微粒、血小板微粒的重懸液加入到碳膜/Fomvar膜包被的微柵中，室溫孵育10 min。用濾紙吸掉多余的液體，加入磷鎢酸(pH 6.8)染色5 min以增強(qiáng)膜的可視性。經(jīng)無水乙醇脫水后，置于烘箱烤干，將制好的標(biāo)本置于透射電鏡下觀察。

1.4 血細(xì)胞微粒制備方法的評(píng)價(jià)

1.4.1 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)方法構(gòu)建及精密度考察 ①確定不同來源血細(xì)胞微粒區(qū)域：在流式細(xì)胞儀前向散射光(FSC)/側(cè)向散射光(SSC)散點(diǎn)圖中，應(yīng)用Megamix標(biāo)準(zhǔn)微粒(直徑分別為0.5、0.9、3 μm)確定不同大小微粒的位置；根據(jù)不同大小微粒的位置，圈定直徑小于0.9 μm的區(qū)域?yàn)槲⒘^(qū)域。②血細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)：向制備的紅細(xì)胞微粒、白細(xì)胞微粒、血小板微粒標(biāo)本中加入抗體PE-Annexin V(終濃度為50 ng/μL)，低速震蕩，充分混勻，避光孵育15 min；然后分別向制備的紅細(xì)胞微粒、白細(xì)胞微粒、血小板微粒標(biāo)本中依次加入抗體FITC-CD235a、FITC-CD45、FITC-CD42b(終濃度均為10 ng/μL)，混勻后室溫避光孵育30 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)；以圈定的微粒區(qū)域進(jìn)入下一個(gè)散點(diǎn)圖，分析微粒表面磷脂酰絲氨酸和其來源細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)情況，其中磷脂酰絲氨酸表達(dá)以磷脂結(jié)合蛋白Annexin V表達(dá)來體現(xiàn)；Annexin V的表達(dá)以Annexin V+EDTA作為對(duì)照管，紅細(xì)胞標(biāo)志物CD235a、白細(xì)胞標(biāo)志物CD45、血小板標(biāo)志物CD42b在紅細(xì)胞微粒、白細(xì)胞微粒、血小板微粒表面的表達(dá)分別以CD235a、CD45、CD42b的IgG同型對(duì)照管作為對(duì)照，以此來確定Annexin V、CD235a、CD45、CD42b陽性表達(dá)區(qū)域；對(duì)雙染抗體樣本檢測(cè)前，用對(duì)應(yīng)抗體的單染樣本調(diào)整流式細(xì)胞儀通道間的熒光補(bǔ)償。③血細(xì)胞微粒濃度測(cè)定：在一定體積的微粒樣本中加入50 μL的熒光標(biāo)準(zhǔn)品(直徑3.8 μm)，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。圈定熒光標(biāo)準(zhǔn)品的區(qū)域，用上述Megamix標(biāo)準(zhǔn)微粒確定樣本微粒區(qū)域。本文50 μL熒光標(biāo)準(zhǔn)品(直徑3.8 μm)中微粒的數(shù)量為50 600個(gè)，故樣本的血細(xì)胞微粒濃度為：(50 600×樣本微粒區(qū)域的微粒個(gè)數(shù))/(熒光標(biāo)準(zhǔn)品區(qū)域微粒個(gè)數(shù)×流式檢測(cè)所加樣本的體積)。④流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法精密度考察：日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(簡(jiǎn)稱日內(nèi)差)：取3份熒光標(biāo)準(zhǔn)品，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，連續(xù)測(cè)定5次，每隔4 h用流式細(xì)胞儀檢測(cè)1次，計(jì)算日內(nèi)差。日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(簡(jiǎn)稱日間差)：取3份熒光標(biāo)準(zhǔn)品，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光標(biāo)準(zhǔn)品濃度，連續(xù)測(cè)定5 d，每隔1 d用流式細(xì)胞儀檢測(cè)1次，計(jì)算其日間差。

1.4.2 血細(xì)胞微粒制備方法的重復(fù)性及重現(xiàn)性考察 同一天內(nèi)，分5次制備5批不同來源的血細(xì)胞微粒，每批制備6個(gè)樣本，用流式細(xì)胞儀在一天中連續(xù)檢測(cè)其表面標(biāo)志物。隨機(jī)抽選30位實(shí)驗(yàn)室工作人員于不同時(shí)間按本方法制備血細(xì)胞微粒，流式細(xì)胞儀觀察血細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。以血細(xì)胞微粒表面標(biāo)志物表達(dá)的變異度來評(píng)估該制備方法的重復(fù)性與重現(xiàn)性。

2 結(jié)果

2.1 血細(xì)胞微粒形態(tài) 在透射電鏡下可以看到，所得紅細(xì)胞微粒、白細(xì)胞微粒、血小板微粒均為直徑0.1～1.0 μm的不規(guī)則圓形結(jié)構(gòu)，有清晰可見的細(xì)胞膜，可看到少許胞質(zhì)的存在。詳見圖1。

注：A為紅細(xì)胞微粒；B為白細(xì)胞微粒；C為血小板微粒。

圖1血液細(xì)胞微粒形態(tài)

2.2 血細(xì)胞微粒表面標(biāo)志物表達(dá)及微粒濃度 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，紅細(xì)胞微粒、白細(xì)胞微粒和血小板微粒均具有較強(qiáng)的來源細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)，表達(dá)陽性率均在90%左右。紅細(xì)胞微粒、白細(xì)胞微粒和血小板微粒均部分表達(dá)磷脂酰絲氨酸(見圖2)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，紅細(xì)胞微粒、白細(xì)胞微粒、血小板微粒濃度分別為(2.2±0.29)×106個(gè)/μL、(1.4±0.21)×106個(gè)/μL、(1.8±0.31)×106個(gè)/μL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為13.2%、15.0%、17.2%。換算至全血來計(jì)算，1 mL全血所制得的紅細(xì)胞微粒、白細(xì)胞微粒和血小板微粒均大于1×108個(gè)。

注：A為紅細(xì)胞微粒；B為白細(xì)胞微粒；C為血小板微粒。

圖2血細(xì)胞微粒表面標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法精密度 3個(gè)樣本數(shù)據(jù)的平均日內(nèi)差為4.7%，符合《中國藥典》規(guī)定的對(duì)生物樣品檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于15.0%的要求，見表1。3個(gè)樣本數(shù)據(jù)的平均日間差為4.9%，符合《中國藥典》規(guī)定的對(duì)生物樣品檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于15.0%的要求，見表2。

表1 同日內(nèi)5次流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得的血細(xì)胞微粒熒光標(biāo)準(zhǔn)品濃度及日內(nèi)差

表2 5 d內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得的血細(xì)胞微粒熒光標(biāo)準(zhǔn)品濃度及日間差

2.4 血細(xì)胞微粒制備方法的重復(fù)性及重現(xiàn)性 重復(fù)性：同一天內(nèi)，分5次制備5批不同的血細(xì)胞微粒，每批制備6個(gè)樣本，共30個(gè)樣本，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，同日內(nèi)制備的不同批次血細(xì)胞微粒表面標(biāo)志物陽性表達(dá)率差異較小(見表3)。重現(xiàn)性：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，不同實(shí)驗(yàn)室工作人員于不同時(shí)間制備的血細(xì)胞微粒表面標(biāo)志物表達(dá)陽性率差異較小(見表4)。

表3 同日內(nèi)不同批次制備的血細(xì)胞微粒表面標(biāo)志物陽性表達(dá)率

3 討論

雖然細(xì)胞微粒起初被認(rèn)為是細(xì)胞代謝廢物，但自20世紀(jì)90年代末，其生物學(xué)功能逐漸受到學(xué)者們的重視。細(xì)胞微粒帶有特異性脂類物質(zhì)，富含來源細(xì)胞蛋白質(zhì)并可能攜帶RNA等生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞間的信號(hào)通訊過程中發(fā)揮十分重要的作用[5]。細(xì)胞微?？梢詤⑴c細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、血管生成和血栓形成過程，與生理狀態(tài)的維持及多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4,6,7]。

表4 不同實(shí)驗(yàn)人員制備于不同時(shí)間制備的血細(xì)胞微粒表面標(biāo)志物陽性表達(dá)率

血細(xì)胞來源微粒包括紅細(xì)胞微粒、白細(xì)胞微粒和血小板微粒。外周血中血小板微粒是血小板活化的標(biāo)志[8]，在生理性和病理性止血過程中起著重要的作用。血小板微粒的生成極大地?cái)U(kuò)大了血小板的磷脂表面，提供凝血活化因子Ⅴ的主要結(jié)合位點(diǎn)，為凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟柑峁┝私佑|反應(yīng)表面[9]。血小板微粒不僅標(biāo)志著血小板的活化，其自身也有明顯的活化血小板作用。血小板微粒可促進(jìn)血小板聚集和血栓形成，其數(shù)量及表型變化與心絞痛、心肌梗死等多種疾病密切相關(guān)[10]；同時(shí)與血管內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞及黏附分子間有著橋聯(lián)關(guān)系，影響人白細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，參與炎癥中的血管損傷過程[11]。研究[12,13]表明，紅細(xì)胞來源微粒能促使聚集的趨化因子配體Ⅰ與血小板相互作用，進(jìn)而刺激血小板釋放α-糖蛋白碎片，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。白細(xì)胞微粒有促炎、促凝和促進(jìn)血栓生成等多種功能，可與內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附分子相互作用，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞促炎和促凝活性增強(qiáng)[14]。白細(xì)胞微粒也可被活化的血小板所捕捉，通過P-選擇素/P-選擇素糖蛋白配體-1依賴機(jī)制，導(dǎo)致組織因子蓄積，促進(jìn)血栓蔓延。因此，白細(xì)胞微粒黏附于血小板成為白細(xì)胞微粒參與血栓形成的一個(gè)重要機(jī)制[15]。雖然大量研究已經(jīng)證明，血細(xì)胞微粒水平及生物學(xué)特征變化與多種疾病密切相關(guān)，影響疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，但其作用機(jī)制尚不清楚。

本研究采用凍融、研磨的方式產(chǎn)生血細(xì)胞微粒，將細(xì)胞在-80 ℃條件下冰凍，室溫融解，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和細(xì)胞內(nèi)液濃度增高、引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。而研磨不僅加劇了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破碎程度，也可以使破碎的細(xì)胞膜隨機(jī)成囊，形成微粒。隨后，在不同的離心條件下梯度除去細(xì)胞及較大的碎片；4 ℃ 100 000 g超高速離心，得到血細(xì)胞微粒。本方法穩(wěn)定可靠、簡(jiǎn)便易行，為后期研究病生理狀態(tài)下機(jī)體微粒生成和變化及微粒功能學(xué)與作用機(jī)制研究提供了方法學(xué)依據(jù)。我們利用由0.5、0.9、3 μm組成的混合標(biāo)準(zhǔn)微粒區(qū)分微粒大小，將微粒直徑小于0.9 μm作為細(xì)胞微粒判定標(biāo)準(zhǔn)，并用絕對(duì)計(jì)數(shù)微球計(jì)算微粒數(shù)量，提高了微粒定量檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。所制備的細(xì)胞微粒形態(tài)學(xué)和表型檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法制備出微粒具有細(xì)胞微粒典型的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，其來源細(xì)胞表面的特異性標(biāo)志物表達(dá)水平較強(qiáng)，部分微粒表達(dá)磷脂酰絲氨酸。

迄今為止，細(xì)胞微粒的檢測(cè)方法主要包括流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法[16,17]、電子顯微鏡檢測(cè)法[16]、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法[18]及蛋白印記法[7]等。其中，流式細(xì)胞術(shù)由于具有分析速度快、可同時(shí)對(duì)檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行定性及定量分析等特點(diǎn)，已經(jīng)成為細(xì)胞微粒最常用的檢測(cè)方法。微粒在形成過程中，膜內(nèi)側(cè)帶有負(fù)電荷的磷脂酰絲氨酸翻轉(zhuǎn)暴露于膜外[19]，且?guī)в衼碓醇?xì)胞的表面特異性蛋白[20]，故我們選擇磷脂酰絲氨酸和其來源細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)來鑒定血細(xì)胞微粒。然而并非所有細(xì)胞微粒表面都帶有磷脂酰絲氨酸，即不是所有細(xì)胞微粒都呈Annexin V陽性，Annexin V陽性僅僅表現(xiàn)為一種血細(xì)胞來源微粒的表型特征。本研究中，流式細(xì)胞術(shù)對(duì)熒光標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)量結(jié)果所得的日內(nèi)差、日間差均符合《中國藥典》對(duì)生物樣品檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求，表明流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法有著較高的精密度，適合用于血細(xì)胞微粒的檢測(cè)。

此外，制備方法的重復(fù)性和重現(xiàn)性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，同日內(nèi)制備的不同批次血細(xì)胞微粒表面標(biāo)志物陽性表達(dá)率差異較小，不同實(shí)驗(yàn)室工作人員于不同時(shí)間制備的血細(xì)胞微粒表面標(biāo)志物表達(dá)陽性率差異也較小，說明本血細(xì)胞微粒制備方法的重復(fù)性和重現(xiàn)性均較好。本文所采用的血細(xì)胞微粒檢測(cè)方法不僅僅適用于本文所制備的血細(xì)胞微粒檢測(cè)，也可以作為一種通用的細(xì)胞微粒檢測(cè)方法，用于不同組織細(xì)胞來源微粒的檢測(cè)，為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供了便利。

參考文獻(xiàn)：

[1] Breen KA, Sanchez K, Kirkman N, et al. Endothelial and platelet microparticles in patients with antiphospholipid antibodies[J]. Thromb Res, 2015,135(2):368-374.

[2] Nomura S, Shimizu M. Clinical significance of procoagulant microparticles[J]. J Intensive Care, 2015,3(1):2.

[3] Wolf P. The nature and significance of platelet products in human plasma[J]. Br J Haematol, 1967,13(3):269-288.

[4] Wu ZH, Ji CL, Li H, et al. Membrane microparticles and diseases[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2013,17(18):2420-2427.

[5] Lynch SF, Ludlam CA. Plasma microparticles and vascular disorders[J]. Br J Haematol, 2007,137(1):36-48.

[6] Mooberry MJ, Key NS. Microparticle analysis in disorders of hemostasis and thrombosis[J]. Cytometry A, 2016,89(2):111-122.

[7] Kriebardis A, Antonelou M, Stamoulis K, et al. Cell-derived microparticles in stored blood products: innocent-bystanders or effective mediators of post-transfusion reactions?[J]. Blood Transfus, 2012,10 (Suppl 2) 25-38.

[8] Ponomareva AA, Nevzorova TA, Mordakhanova ER, et al. Structural Characterization of Platelets and Platelet-Derived Microvesicles [J]. Tsitologiia, 2016,58(2):105-114.

[9] Owens AP 3rd, Mackman N. Microparticles in hemostasis and thrombosis[J]. Circ Res, 2011,108(10):1284-1297.

[10] Jung C, Sorensson P, Saleh N, et al. Circulating endothelial and platelet derived microparticles reflect the size of myocardium at risk in patients with ST-elevation myocardial infarction[J]. Atherosclerosis, 2012,221(1):226-231.

[11] Ogura H, Kawasaki T, Tanaka H, et al. Activated platelets enhance microparticle formation and platelet-leukocyte interaction in severe trauma and sepsis[J]. J Trauma, 2001,50(5):801-809.

[12] Xiong Z, Cavaretta J, Qu L, et al. Red blood cell microparticles show altered inflammatory chemokine binding and release ligand upon interaction with platelets[J]. Transfusion, 2011,51(3):610-621.

[13] Piccin A, Van Schilfgaarde M, Smith O. The importance of studying red blood cells microparticles[J]. Blood Transfus, 2015,13(2):172-173.

[14] Diehl P, Aleker M, Helbing T, et al. Enhanced microparticles in ventricular assist device patients predict platelet, leukocyte and endothelial cell activation[J]. Interact Cardiovasc Thorac Surg, 2010,11(2):133-137.

[15] Falati S, Liu Q, Gross P, et al. Accumulation of tissue factor into developing thrombi in vivo is dependent upon microparticle P-selectin glycoprotein ligand 1 and platelet P-selectin[J]. Interact Cardiovasc Thorac Surg, 2003,197(11):1585-1598.

[16] Tian Y, Salsbery B, Wang M, et al. Brain-derived microparticles induce systemic coagulation in a murine model of traumatic brain injury[J]. Blood, 2015,125(13):2151-2159.

[17] Nantakomol D, Imwong M, Soontarawirat I, et al. The absolute counting of red cell-derived microparticles with red cell bead by flow rate based assay[J]. Cytometry B Clin Cytom, 2009,76(3):191-198.

[18] Baron M, Boulanger CM, Staels B, et al. Cell-derived microparticles in atherosclerosis: biomarkers and targets for pharmacological modulation?[J]. J Cell Mol Med, 2012,16(7):1365-1376.

[19] Burnier L, Fontana P, Kwak BR, et al. Cell-derived microparticles in haemostasis and vascular medicine[J]. Thromb Haemost, 2009,101(3):439-451.

[20] Morel O, Jesel L, Freyssinet JM, et al. Cellular mechanisms underlying the formation of circulating microparticles[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2011,31(1):15-26.