高效液相色譜法測定人體外周血丙戊酸鈉濃度

孫玉花 葉延芬（通訊作者） 袁會成 趙良存

（甘肅省武威腫瘤醫(yī)院 甘肅 武威733000）

丙戊酸鈉為廣譜抗癲癇藥，其抗癇譜廣、療效高，是較理想的抗癲癇藥物。近年來，臨床用于治療偏頭痛、原發(fā)性三叉神經(jīng)痛、遲發(fā)性運(yùn)動障礙等也有較好療效[1-2]，但其在臨床上的治療指數(shù)低，安全有效血藥濃度范圍較窄，而且服藥周期長，容易發(fā)生不良反應(yīng)[3]?；颊唛L期服用丙戊酸鈉治療的過程中，密切注意影響丙戊酸鈉血藥濃度波動的因素，必須綜合考慮各方面的因素，實(shí)行個體化給藥，以血藥濃度為依據(jù)，而確?；颊叩挠盟幇踩１痉ㄍㄟ^優(yōu)化血漿中丙戊酸鈉提取方法，減少干擾因素，通過HPLC法測定腫瘤患者血漿中丙戊酸鈉的含量，其專屬性強(qiáng)、結(jié)果可靠，為臨床使用丙戊酸鈉做好藥學(xué)監(jiān)護(hù)提供了依據(jù)。

1.儀器與試藥

LC100高效液相色譜儀（上海伍豐科學(xué)儀器有限公司）；BSM電子天平（上海卓精電子科技有限公司），HX-03超聲波清洗器（武漢恒信世紀(jì)科技有限公司）。

丙戊酸鈉對照品由中國食品藥品生物制品檢定研究所提供（批號：100963-201302）；乙腈為色譜純；水為娃哈哈純凈水；正己烷、甲醇、三乙胺均為分析純；空白血漿由血庫供應(yīng)。

2.試驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：PronaosEP-C18柱（4.6mm×250mm）；流動相：乙腈-水（75:25）[1]，流速：1.0mL?min-1，柱溫：35℃，檢測波長：248nm；理論板數(shù)應(yīng)不低于3000。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取105℃干燥至恒重的丙戊酸鈉對照品57.5mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得1.15mg?mL-1丙戊酸鈉對照品溶液，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血清樣品處理方法

精密吸取待測血清樣品180μL于10mL試管中，加20μL甲醇，振搖混勻，加入1mol/L硫酸200μL，再加入正己烷5mL，旋渦振蕩2min，取上清液至試管中，加入10g/L α-溴苯乙酮200μL，10%三乙胺50μL，超聲2min，置55℃水浴中衍生化反應(yīng)15min，揮干有機(jī)溶劑，殘渣用乙腈200μL溶解，0.45μm濾膜濾過，取20μL進(jìn)樣。

2.4 對照樣品處理

取健康人血清180μL于10mL小試管中，加入丙戊酸鈉對照品溶液20μL，振搖混勻，加入1mol/L硫酸200μL，按照“2.3”項(xiàng)下處理，取20μL進(jìn)樣。

3.結(jié)果

3.1 色譜行為

空白血清、空白血清加丙戊酸鈉對照品、待測血清樣品色譜圖見圖1。由圖可見在此色譜條件下丙戊酸鈉的色譜峰能夠完全分離，峰形對稱，無雜質(zhì)峰干擾，丙戊酸鈉對照品的保留時間為12.86min，樣品保留時間為12.76min。

3.2 線性關(guān)系考察

精密量取對照品貯備液1、2、4、6、8、10mL，分別加入10mL量瓶中，加流動相稀釋制成0.115、0.230、0.46、0.69、0.92、1.15mg?mL-1對照品溶液，搖勻，分別精密量取20μL加入6只5mL具塞試管中，加健康人血清150μL。按照“2.3”項(xiàng)下處理，取20μL進(jìn)樣，以丙戊酸鈉濃度（X）與丙戊酸鈉峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸得回歸方程：Y=12.4235X-1.2536(r=0.9999)。結(jié)果表明：丙戊酸鈉濃度（X）為11.5～115μg?mL-1間呈良好線性關(guān)系。

3.3 精密度考察

分別配制11.5、46、115μg/mL 3種濃度的對照品+血清各5份，置于5mL具塞試管中，按照“2.3”項(xiàng)下處理，分別于1d內(nèi)連續(xù)檢測5次及5d內(nèi)每天檢測1次，記錄峰面積。計算日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果見表1。

表1 血清中丙戊酸鈉的精密度（n=5，±s）

表1 血清中丙戊酸鈉的精密度（n=5，±s）

樣品中丙戊酸鈉含量（μg/mL）日內(nèi)精密度 日間精密度檢測值（μg/mL）RSD（%） 檢測值（μg/mL） RSD（%）11.511.44±0.0712.4211.38±0.142.71 46.045.86±0.841.0846.12±0.981.42 115.0115.5±0.680.61114.97±1.261.05

3.4 回收率考察

分別配制11.5、46、115μg/mL3種濃度的對照品血清樣品各5份，按照“2.3”項(xiàng)下處理，測定色譜峰面積，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=5，±s）

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=5，±s）

加入丙戊酸鈉對照品量（μg/mL） 檢出量（μg/mL） 相對回收率（%）RSD（%）11.511.55±0.1698.262.62 4645.68±0.8599.351.12 115113.68±1.2199.471.34

3.5 穩(wěn)定性考察

取丙戊酸鈉貯備液，用流動相分別配制成11.5、46、115μg/mL3種濃度的對照品血清樣品溶液，于4℃冰箱保存，分別在0、1、3、5d進(jìn)樣，記錄峰面積，三種不同濃度丙戊酸鈉的照片峰面積的RSD分別為1.05%、1.84%、2.21%，n=4。表明丙戊酸鈉對照品溶液在5天內(nèi)穩(wěn)定。

4.討論

4.1 丙戊酸鈉為一種不含氮有機(jī)酸鹽，有效血藥濃度為50～100μg/mL，血藥濃度超過100μg/mL，毒副作用增加療效無明顯增加[4]，主要引起血清堿性磷酸酶和氨基轉(zhuǎn)移酶升高，倦睡、眩暈、疲乏、頭痛、共濟(jì)失調(diào)、輕微震顫、異常興奮、不安和煩躁等反應(yīng)[5]，因此在用藥過程中檢查血藥濃度來為臨床治療提供依據(jù)。

4.2 目前，有關(guān)丙戊酸鈉在人體血漿中濃度檢測方法主要采用熒光偏振免疫分析法（FPIA），其精密度與準(zhǔn)確度均較高，在臨床抗癲癇治療中，可有效的指導(dǎo)臨床合理用藥，但FPIA法儀器設(shè)備昂貴，各醫(yī)療機(jī)構(gòu)FPIA不能普遍使用，部分欠發(fā)達(dá)地區(qū)的用藥人群不能提供藥學(xué)監(jiān)護(hù)，本文丙戊酸鈉藥物濃度測定方法為有關(guān)資料[6-7]報道的高效液相色譜法，用α-溴苯乙酮柱前衍生化反應(yīng)，丙戊酸鈉的保留時間和分離效果比較理想。

4.3 丙戊酸鈉經(jīng)柱前衍生化后與血漿中其他成分分離效果好，其他成分對測定無干擾，有文獻(xiàn)報道[8]，HPLC法檢測結(jié)果略高于FPIA法，我們采用HPLC法和FPIA法進(jìn)行檢測比較，兩種方法無顯著差異，本文HPLC法樣品處理步驟簡便、方法簡單、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于丙戊酸鈉的血藥濃度測定及臨床藥代動力學(xué)研究。

【參考文獻(xiàn)】

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[5]何思陸.丙戊酸鈉致不良反應(yīng)39例文獻(xiàn)分析[J].中國藥房，2010,21:40.

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[8]張浩，李金德.FPIA法與HPLC法監(jiān)測癲癇患兒外周血丙戊酸鈉濃度差異的比較[J].中國生化藥物雜志，2017,1:37.