生物聚合物納米微粒對(duì)人肺癌細(xì)胞凋亡的作用

孫倩 楊麗君 周歡琴★

雙氫青蒿素（DHA）是青蒿素的衍生物，是從天然藥物青篙中提取的。DHA是一類臨床奏效快，治愈率高且毒性低的抗瘧疾藥物，尤其對(duì)易耐藥的腦型瘧、惡性瘧有效。研究表明，DHA對(duì)于各種腫瘤細(xì)胞系的癌癥，還具有抗腫瘤活性，能促使腫瘤細(xì)胞凋亡［1-2］。然而，DHA治療惡性腫瘤方面也存在一些問(wèn)題，例如在溶液中或血液中溶解度差，生物利用度低，口服活性不佳，血漿半衰期短，從而導(dǎo)致在治療過(guò)程中使用劑量和次數(shù)的增加［3-4］?？梢酝ㄟ^(guò)制備DHA納米微粒來(lái)增加DHA體外溶出度，延長(zhǎng)釋放時(shí)間，提高其生物利用率，解決DHA單獨(dú)給藥時(shí)存在的問(wèn)題。在前期研究中，作者開(kāi)發(fā)了靜電場(chǎng)系統(tǒng)制備生物聚合物納米顆粒的方法［5］。本實(shí)驗(yàn)采用的肺腺癌A549細(xì)胞是目前肺癌研究常用的一種肺腺癌細(xì)胞系，通過(guò)制備納米微粒作為載體來(lái)包覆DHA，探討DHA的生物聚合物納米微粒的理化性質(zhì)以及對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 人肺腺癌A549細(xì)胞株由臺(tái)灣義守大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系提供，雙氰青蒿素購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，其他化學(xué)試劑包括海藻酸鈉、明膠、胎牛血清和二甲基亞砜等均購(gòu)自Gibco生命科技有限公司。實(shí)驗(yàn)涉及的溶液均由去離子水配制。采用透射電鏡（G2 20 S-Twin，Tecnai，USA）觀察納米微粒的形貌，測(cè)算納米微粒的粒徑；采用高效液相色譜儀（1100series，Agilent，USA）檢測(cè)DHA濃度，使用C-18色譜柱（4.6×250mm，5μm），流動(dòng)相為40%的乙腈和60%的去離子水，流速設(shè)定為1ml/min，柱溫為35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。

1.2 納米微粒的制備 （1）生物聚合物納米微粒的制備：采用靜電場(chǎng)系統(tǒng)制備四種生物聚合物納米微粒（Chitosan-alginate，Chitosan-NaOH，Gelatin和 HA納米微粒）。（2）包覆DHA的生物聚合物納米微粒的制備：在996 μl的四種生物聚合物溶液中加入4 μl配制好的25mg/ml DHA溶液，使得DHA的最終濃度為100μg/ml，采用靜電場(chǎng)系統(tǒng)制備包覆DHA的納米微粒。

1.3 細(xì)胞活性測(cè)試 （1）納米微粒的體積和種類的篩選：分別置放10μl、20μl、30μl和40μl四種未包覆DHA的納米微粒與已培養(yǎng)1d的A549細(xì)胞共同培養(yǎng)1d后，加入20μl MTT，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定吸光值，篩選納米微粒的體積和種類。（2）HA-DHA納米微粒細(xì)胞活性測(cè)試：設(shè)置HA-DHA納米微粒、DHA、HA納米微粒和DMSO四個(gè)組別，分別與已培養(yǎng)1d的A549細(xì)胞培養(yǎng)1d、2d、3d后，加入MTT試劑檢測(cè)其吸光值。

1.4 細(xì)胞凋亡測(cè)試 設(shè)置HA-DHA納米微粒、DHA、HA納米微粒和DMSO四個(gè)組別，與已培養(yǎng)1d的A549細(xì)胞爬片共同培養(yǎng)2d后，按照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒提供的方法進(jìn)行染色并在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 透射電子顯微鏡（TEM） 圖通過(guò)TEM觀測(cè)其形貌，圖1分別是Chitosan-Alginate、Chitosan-NaOH、Gelatin和HA四種納米微粒的TEM圖。Chitosan-Alginate，Gelatin和HA納米微粒分布均勻，大小均一且球形規(guī)律；Chitosan-NaOH粒徑大小均一性較差。圖2是生物聚合物包覆DHA形成的納米微粒TEM圖。Chitosan-Alginate-DHA和 Chitosan-NaOH-DHA納米微粒分布均勻且大小均一；Gelatin-DHA和HADHA納米微粒則出現(xiàn)了顆粒團(tuán)聚現(xiàn)象。表1為四種納米微粒包裹前后的粒徑大小。Chitosan納米微粒在包覆DHA前后粒徑大小并無(wú)明顯區(qū)別，粒徑大小都在3～10nm之間，而HA和Gelatin在包覆DHA前后粒徑大小相差較多，Gelatin和HA 納米微粒粒徑分別為（4.3±0.98）nm和（17.7±5.5）nm；包覆DHA后，粒徑分別變?yōu)椋?9.4±6.9）nm和（29.5±9.8）nm。

圖1 四種生物聚合物納米微粒的TEM圖［（a）Chitosan納米微粒（交聯(lián)劑為Alginate）；（b）Chitosan納米微粒（交聯(lián)劑為NaOH）；（c）Gelatin納米微粒；（d）HA納米微粒］

表1 四種納米微粒包裹前后的粒徑大?。ā纒）

表1 四種納米微粒包裹前后的粒徑大?。ā纒）

Chitosan-alginate Chitosan-NaOH Gelatin HA納米微粒粒徑大?。╪m）包覆DHA前 6.24±1.12 7.51±2.18 4.3±0.98 17.7±5.5包覆DHA后 4.24±0.92 6.27±1.34 39.4±6.9 29.5±9.8

2.2 包覆率測(cè)試 DHA的含量可由HPLC測(cè)定，根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算實(shí)驗(yàn)中DHA的含量。表2是不同的生物聚合物納米微粒對(duì)DHA包覆率。四種納米微粒的包覆率的大小順序?yàn)椋篐A-DHA（35%）＞Chitosan-NaOH-DHA（21%）＞Chitosan-Alginate-DHA（18%）＞Gelatin-DHA（13%）。

圖2 包裹DHA的納米微粒的TEM圖［（a）Chitosa- Alginate-DHA；（b）Chitosan-NaOH-DHA；（c）Gelatin-DHA納米微粒；（d）HA-DHA納米微粒］

表2 納米微粒包覆DHA的包覆效率（±s）

表2 納米微粒包覆DHA的包覆效率（±s）

包覆DHA納米微粒組 包覆率（%）Chitosan-alginate-DHA 18.227±1.262 Chitosan-NaOH-DHA 20.904±1.275 Gelatin-DHA 12.915±2.410 HA-DHA 35.320±5.827

2.3 細(xì)胞活性檢測(cè) （1）納米微粒放置濃度篩選：納米微粒包覆DHA的抗癌藥性是通過(guò)將包覆DHA的納米微粒與人肺腺癌A549細(xì)胞共同培養(yǎng)，加入MTT試劑后通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)其OD值來(lái)反應(yīng)DHA對(duì)A549細(xì)胞的毒殺作用。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)加入不同體積的納米微粒懸浮液（10μl，20μl，30μl和 40μl）與 A549 細(xì)胞共同培養(yǎng)，來(lái)檢測(cè)四種納米微粒對(duì)人類細(xì)胞無(wú)毒殺作用。加入10 μl兩組Chitosan納米微粒懸浮液與A549細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，與對(duì)照組比較，A549細(xì)胞的存活率明顯降低；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其與比較控制組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。20μl的Gelatin納米微粒懸浮液即可引起細(xì)胞活性降低；而HA納米微粒在加入40 μl時(shí)才會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其與比較控制組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此，選擇加入10 μl體積的HA納米微粒懸浮液與細(xì)胞作用進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。（2）包覆DHA納米微粒的細(xì)胞活性測(cè)試：選擇HA納米微粒進(jìn)行細(xì)胞活性測(cè)試，DHA對(duì)照組的濃度是最小致細(xì)胞凋亡的濃度為10μg/ml。與A549細(xì)胞作用后，HA-DHA納米微粒明顯降低了A549細(xì)胞活性，而且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，A549細(xì)胞活性的降低程度越大。HA-DHA納米微粒比直接加入DHA更有效地引起細(xì)胞凋亡，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 細(xì)胞凋亡測(cè)試 為了研究納米微粒包覆DHA前后對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的凋亡作用，將細(xì)胞處理作用2d后，將細(xì)胞爬片進(jìn)行Annexin V-FITC染色以及PI染色，在光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。DHA與A549細(xì)胞共培養(yǎng)2d后，出現(xiàn)細(xì)胞收縮、偽足萎縮、細(xì)胞膜皺縮、細(xì)胞從爬片上脫落的現(xiàn)象，這是細(xì)胞凋亡的典型形態(tài)學(xué)改變。在細(xì)胞中加入HA-DHA納米微粒共培養(yǎng)時(shí)也出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色和紅色熒光信號(hào)，表明細(xì)胞出現(xiàn)了早期凋亡和死亡。然而HA納米微粒組細(xì)胞仍與控制組保持相似的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并且細(xì)胞良好地貼覆在玻片上。染色結(jié)果證實(shí)了DHA和HA-DHA對(duì)A549細(xì)胞的凋亡作用，綠色的熒光信號(hào)表示細(xì)胞早期凋亡，紅色的熒光信號(hào)表示細(xì)胞晚期凋亡或者死亡。

3 討論

DHA是ART的一個(gè)衍生產(chǎn)物，對(duì)人類癌癥細(xì)胞表現(xiàn)出抑制作用。已有研究表明DHA能夠誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡［6］，本研究采用生物聚合物納米微粒，將DHA包覆于其中，從而改善DHA應(yīng)用上的弊端。選用的Chitosan，Gelatin，HA作為納米微粒的主要材料，是因?yàn)槠渚哂辛己玫纳锵嗳菪?，生物降解性和水溶性，在制備過(guò)程中不需要加入任何有機(jī)溶劑，從而夠改善DHA在水相中難以溶解均勻分布的特點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，包覆DHA后，Chitosan-Alginate-DHA和Chitosan-NaOH-DHA納米微粒分布均勻且大小均一，未出現(xiàn)顆粒團(tuán)聚現(xiàn)象，推測(cè)是納米微粒具備雙極性的特征：Chitosan帶正電荷，而Alginate帶負(fù)電荷，NaOH在酸性條件下有較多的氫氧根。在這種雙極性的條件下，生物聚合物溶液的乳化作用較強(qiáng)，即能有效地分散油溶性DHA，但由于受到配制條件的限制而呈酸性，與細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，降低了細(xì)胞活性導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Gelatin-DHA和HA-DHA納米微粒由于DHA屬于油溶性藥物，與水溶性Gelatin和HA的連接性不強(qiáng)，出現(xiàn)了顆粒團(tuán)聚現(xiàn)象。MTT細(xì)胞活性測(cè)試和熒光染色結(jié)果顯示，HA-DHA納米微粒中比單純加入DHA更能增強(qiáng)DHA的生物利用度和A549細(xì)胞凋亡的作用。

細(xì)胞膜是防止細(xì)胞外物質(zhì)自由進(jìn)入細(xì)胞的屏障，其主要通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞［7］作用包括胞飲作用、細(xì)胞吞噬作用與外界物質(zhì)交流。內(nèi)吞作用有四個(gè)基本機(jī)制：網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，小穴蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，不依賴網(wǎng)格蛋白和小穴蛋白的內(nèi)吞作用，巨胞飲［8］，納米微粒也是經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，此次研究中并未探討DHA進(jìn)入A549細(xì)胞的方式。

綜上所述，納米微粒包覆DHA的方式比單純加入DHA更能誘導(dǎo)A549細(xì)胞進(jìn)入凋亡的途徑。

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