醛類應(yīng)激介導(dǎo)ω-3魚油脂肪乳劑預(yù)處理減輕大鼠腦局灶性缺血再灌注損傷的機(jī)制研究

朱斌斌 高 彬 趙清振 徐義國 吳 祥 桂 煜

隨著近幾年人口老齡化速度的加快以及人們生活方式的改變，缺血性腦血管疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢，該病具有較高的致殘率和病死率，對患者的生命健康造成了嚴(yán)重的威脅［1］。目前，臨床上對于缺血性腦血管疾病的治療手段相對較少，效果也較為有限，其治療的原則為盡早恢復(fù)缺血區(qū)的血液灌流，但部分患者再灌注后組織功能并未得到恢復(fù)，反而使結(jié)構(gòu)和功能障礙進(jìn)一步加重，造成了缺血再灌注損傷［2］。研究證實(shí)，大腦缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展與醛類應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及炎癥應(yīng)激等具有密切的關(guān)系，其成為治療缺血性腦血管疾病的重要靶點(diǎn)［3］。ω-3魚油脂肪乳劑具有一定的抗氧化、抗炎癥以及減少血栓形成的作用，國外有報(bào)道稱其對大鼠的腸缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用，但對腦缺血性再灌注損傷是否有保護(hù)作用尚缺乏研究［4］。因此，本研究觀察了ω-3魚油脂肪乳劑對大鼠腦局灶性缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并探討了其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物分組以及藥物干預(yù) SPF級Sprague-Dawley雄性大鼠40只，體重150～200g，購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心。置于溫度（22±1）℃，濕度（60±10）%，光照（12h照明，12h黑暗交替）環(huán)境下飼養(yǎng)1周，自由飲水、普通顆粒飼料喂養(yǎng)。將40只大鼠隨機(jī)分成5組，每組各8只：正常組（C組）、模型組（M組）、ω-3魚油脂肪乳劑5d組（FOFE-5組）、ω-3魚油脂肪乳劑10d組（FOFE -10組）、ω-3魚油脂肪乳劑10d組（FOFE -15組）。C組和M組大鼠不做任何藥物干預(yù)處理，F(xiàn)OFE-5組、FOFE -10以及FOFE -15組分別在手術(shù)前5d、10d、15d開始給予ω-3魚油脂肪乳劑尾靜脈注入，劑量為2ml/（kg·次·d）。

1.2 動物模型建立與評價(jià) M組、FOFE-5、FOFE-10、FOFE -15組采用 Zea Longa線栓方法［5］建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）：術(shù)前12h大鼠禁食，自由飲水。采用10%水合氯醛腹腔麻醉，取仰臥位，頸部正中作以切口逐層切開，暴露右頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，結(jié)扎頸總動脈在頸總動脈與頸外動脈中間備線（不扎緊），動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈遠(yuǎn)心端，在頸總動脈近分叉處切口，插入與血管直徑相適應(yīng)的線栓，收緊備線，打開動脈夾，栓線進(jìn)入頸內(nèi)動脈，將 4-0 單絲尼龍線在頸動脈分叉處插入頸內(nèi)動脈，當(dāng)進(jìn)入深度約18mm時(shí)，可感到輕微阻力感，可認(rèn)為栓線已阻斷大腦中動脈，停止進(jìn)線，扎緊備線，縫合筋膜和皮膚，術(shù)后給予滴慶大霉素注射液預(yù)防感染，注意保溫使體溫恒定。假手術(shù)組只分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，不結(jié)扎。24h后進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分，剔除死亡以及神經(jīng)行為學(xué)評分為0分老鼠。

1.3 樣本采集和檢測 （1）神經(jīng)行為評分：手術(shù)后24h，在動物處死前采用 Longa評分改良方法進(jìn)行神經(jīng)行為檢測：未觀察到神經(jīng)損傷癥狀，為0分；懸尾試驗(yàn)中大鼠不能完全伸展對側(cè)前爪為1分；大鼠的前肢抵抗對側(cè)推力能力下降為2分；大鼠稍微向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為3分；明顯向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為4分；行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒為5分。（2）腦梗死體積：手術(shù)后24h，將大鼠斷頭處死，獲取腦組織后進(jìn)行TCCA染色，觀察腦組織的梗死體積。（3）丙二醛（MDA）、乳酸脫氫酶（LHD）水平檢測：將腦組織用PBS均漿制成10%的勻漿液，離心處理取上層清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），嚴(yán)格按照說明書要求測定腦組織中MDA、LHD水平，所用試劑盒購自南京建成生物工程研究所。（4）RTPCR方法檢測腦組織中Nrf2、HO-1mRNA表達(dá)：將分離出的腦組織按照Trizol RNA 提取試劑盒說明書提取總 RNA，采用紫外吸收法測定A260nm/A280nm的比值，在1.8～2.0之間認(rèn)為RNA純度合格。使用TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA（濃度為 50ng/μl）。加樣后采用定量 PCR 儀進(jìn)行反應(yīng)擴(kuò)增。采用Primer Premier5.0及Oligo6 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)Nrf2 上游 引 物 ：5'-ATCCTTTGGAGGCAAGACAT-3'， 下 游引 物 ：5'-TCCTGTTCCTTCTGGAGTTG-3'；HO-1 上游引物：5'-CAGAGTTTCTTCGCCAGAGG-3'，下游引物 ：5'-TGAGTGTGAGGACCCATCG-3'；β-actin 上游引物：5'-GCCATGATCGTAGCCATCCA-3'，下游引物5'-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3。PCR反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性 10min，95℃變性 30s，60℃ 30s，72℃延伸1min，共40個(gè)循環(huán)。所有目的基因的閾值是與內(nèi)參相比較，通過計(jì)算2-ΔΔCt表示基因相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用方差（Analysis of variance，ANOVA）法；計(jì)數(shù)資料采用百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為評分和大腦梗死面積 C組大鼠的神經(jīng)行為評分和大腦梗死面積均為0，M組大鼠出現(xiàn)不能完全伸展對側(cè)前爪，或向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈或向?qū)?cè)傾倒等的運(yùn)動障礙，大腦的梗死面積可達(dá)（52.31±9.24）%。FOFE-5組、FOFE-10組以及FOFE-15組大鼠的神經(jīng)行為評分和大腦梗死面積較M組顯著降低，且FOFE-5組明顯高于FOFE-10組和FOFE-15組，差異具有顯著性（P＜0.05）；FOFE-10組和FOFE-15組比較無顯著差異（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠手術(shù)后的神經(jīng)行為評分和大腦梗死體積比較（±s）

表1 各組大鼠手術(shù)后的神經(jīng)行為評分和大腦梗死體積比較（±s）

注：與C組比較，*P＜0.05；與M組比較，#P＜0.05；與FOFE-5組比較，△P＜0.05

組別 神經(jīng)行為評分（分） 大腦梗死體積（%）C組 0.00±0.00 0 M組 4.21±0.82* 52.31±9.24*FOFE-5組 2.81±0.93*# 37.23±8.12*#FOFE-10組 2.32±0.77*#△ 31.21±9.21*#△FOFE-15組 2.27±0.84*#△ 30.44±8.67*#△

2.2 MDA和LHD水平 M組大鼠的MDA、LHD水平較C組顯著升高，F(xiàn)OFE-5預(yù)處理使MDA水平顯著降低，且FOFE-10組和FOFE-15組明顯低于FOFE-5組，差異具有顯著性（P＜0.05）；FOFE-10組和FOFE-15組比較無顯著差異（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠手術(shù)后腦組織中的MDA和LHD水平比較（±s）

表2 各組大鼠手術(shù)后腦組織中的MDA和LHD水平比較（±s）

注：與C比較，*P＜0.05；與M組比較，#P＜0.05；與FOFE-5組比較，△P＜0.05

組別 MDA（U/g） LHD（mmol/g）C組 1.79±0.08 613.27±131.27 M組 3.47±0.81* 924.23±108.12*FOFE-5組 2.53±0.77*# 752.73±114.81*#FOFE-10組 2.32±0.88*#△ 711.27±115.81*#△FOFE-15組 2.28±0.84*#△ 706.44±120.78*#△

2.3 Nrf2和HO-1 mRNA相對表達(dá)量 與C組比較，M組的大鼠腦組織中Nrf2和HO-1 mRNA相對表達(dá)量明顯升高，F(xiàn)OFE-5預(yù)處理組的Nrf2和HO-1 mRNA相對表達(dá)量較M組明顯升高，差異具有顯著性（P＜0.05）；FOFE-10組和FOFE-15組比較無顯著差異（P＞0.05），見表 3。

表3 各組大鼠腦組織中Nrf2和HO-1 mRNA相對表達(dá)量（±s）

表3 各組大鼠腦組織中Nrf2和HO-1 mRNA相對表達(dá)量（±s）

注：與C比較，*P＜0.05；與M組比較，#P＜0.05

組別 Nrf2 HO-1 C組 0.392±0.017 0.132±0.053 M組 0.537±0.048* 0.271±0.056*FOFE-5組 0.582±0.052*# 0.424±0.046*#FOFE-10組 0.608±0.021*# 0.463±0.057*#FOFE-15組 0.621±0.0754*# 0.462±0.051*#

3 討論

Zea-Longa線栓法是通過線栓將腦動脈的絕大部分血流阻斷，并通過定位栓線定向閉塞與基底節(jié)區(qū)皮質(zhì)層血流，病理過程與缺血性腦卒中具有較好的相似性，且該方法操作簡單，重復(fù)性好，在腦缺血疾病的動物實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛的應(yīng)用［6］。為探究ω-3魚油脂肪乳劑預(yù)處理對缺血性腦卒中的治療作用，本研究以此法建立了MCAO模型，探究了不同處理時(shí)間對大鼠神經(jīng)行為以及大腦梗死面積等的影響，分析了其相關(guān)機(jī)制。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M組大鼠的神經(jīng)行為平均評分為（4.21±0.82）分，大腦梗死面積為（52.31±9.24）%，與C組具有顯著差異，說明作者已成功建立MCAO模型。采用ω-3魚油脂肪乳劑預(yù)處理后，大鼠的神經(jīng)行為評分和梗死面積均顯著的降低，提示ω-3魚油脂肪乳劑預(yù)對大腦局灶性缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。而FOFE-5組明顯高于FOFE-10組和FOFE-15組，且FOFE-10組和FOFE-15組比較無顯著差異，說明對大鼠進(jìn)行預(yù)處理10d即可達(dá)到最佳效果。

大量的研究已經(jīng)證實(shí)，氧化應(yīng)激在大鼠腦缺血灌注損傷的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。在大鼠發(fā)生血流再灌注時(shí)，會促使體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生，對缺血損傷區(qū)的不飽和脂肪酸雙鏈結(jié)構(gòu)的生物膜造成破壞，從而損傷周圍細(xì)胞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能的完整性，誘導(dǎo)或引發(fā)腦組織缺氧。MDA是一種醛類物質(zhì)，是脂質(zhì)過氧化最終產(chǎn)物，其可以間接的反映氧自由基的代謝能力以及組織氧化性損傷程度［7］。LDH是神經(jīng)細(xì)胞在受到氧自由基攻擊后發(fā)生脂質(zhì)過氧化損傷而產(chǎn)生的，是評價(jià)氧自由基損傷程度的敏感指標(biāo)［8］。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M組大鼠的MDA、LHD水平較C組顯著升高，F(xiàn)OFE-5組預(yù)處理使MDA、LHD水平顯著降低。作者認(rèn)為，ω-3魚油脂肪乳劑預(yù)處理通過醛類應(yīng)激介導(dǎo)降低對腦組織的氧化性損傷，對大腦局灶性缺血再灌注起到保護(hù)作用。因此，ω-3魚油脂肪乳劑預(yù)處理對腦局灶性缺血再灌注的保護(hù)作用與氧化應(yīng)激具有密切關(guān)系，這與目前大部分的研究結(jié)果是一致的。

Nrf2是一種重要的氧化應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，激活其可以上調(diào)HO-1等蛋白的表達(dá)，減少氧化性損傷［9］。Nrf2/HO-1是調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要信號通路，在正常機(jī)體中，Nrf2多存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，處于失活狀態(tài)，半衰期較短，一旦激活可迅速經(jīng)泛素蛋白酶體途徑降解。當(dāng)機(jī)體遭受氧化應(yīng)激損傷時(shí)，Nrf2會迅速被激活，并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進(jìn)入細(xì)胞核，形成半衰期較長的穩(wěn)態(tài) Nrf2，抵抗機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)；HO-1 作為誘導(dǎo)型酶，廣泛表達(dá)于腦組織中，在腦缺血時(shí)呈高表達(dá)狀態(tài)，可增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，減輕缺血再灌注損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M組大鼠的Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA的表達(dá)量明顯高于M組，而 FOFE-5組預(yù)處理后進(jìn)一步使Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA的表達(dá)量升高。在腦組織發(fā)生局灶缺血性再灌注損傷時(shí)，為適應(yīng)缺血缺氧等應(yīng)激刺激，Nrf2/HO-1通路被激活，啟動了抗氧化蛋白 HO-1的表達(dá)，對抗缺血缺氧引起的腦組織損傷［10］。而ω-3魚油脂肪乳劑預(yù)處理進(jìn)一步促進(jìn)了Nrf2蛋白的合成，進(jìn)一步激活Nrf2/HO-1通路，發(fā)揮抗氧化作用。因此，ω-3魚油脂肪乳劑預(yù)處理對腦局灶性缺血再灌注的保護(hù)作用可能與Nrf2/HO-1通路有關(guān)。

綜上所述，ω-3魚油脂肪乳劑預(yù)處理通過調(diào)節(jié)醛類應(yīng)激介導(dǎo)的氧化應(yīng)激以及Nrf2/HO-1信號通路，對大鼠大腦局灶性缺血再灌注損傷起到了保護(hù)作用，其為臨床缺血性腦卒的治療提供了一種新思路。

［1］ Huang J,Kodithuwakku ND,He W,et al．The neuroprotective effect of a novel agent N2 on rat cerebral ischemia associated with the activation of PI3K/Akt signaling pathway．Neuropharmacolo gy,2015,95:12-21．

［2］ Yaidikar L,Thakur S．Arjunolic acid,a pentacyclic triterpenoidal saponin of Terminalia arjuna bark protects neurons from oxidative stress associated damage in focal cerebral ischemia and reperfusion．Pharmacol Rep,2015,67(5):890-895．

［3］ 張秀俠．水飛薊賓對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠保護(hù)作用的研究．安徽醫(yī)藥,2016,20(3):445-449．

［4］ 何林秀,孫明立,邊競,等．ω-3魚油脂肪乳對環(huán)磷酰胺所致小鼠胃黏膜損傷的保護(hù)作用．中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015,44(12):1090-1093．

［5］ Vakili A,Einali MR,Bandegi AR．Protective effect of crocin against cerebral ischemia in a dose-dependent manner in a rat model of ischemic stroke．J Stroke Cerebrovasc Dis,2014,23(1):106-113．

［6］ Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats．Stroke, 1989,20(1):84-89．

［7］ Shang A,Yang Y,Wang H,et al．Upregulation of neuroglobin expression and changes in serum redox indices in a rat model of middle cerebral artery occlusion．Mol Med Rep,2015,12(2):1693-1698．

［8］ 陳鵬,丁志杰．熊果酸對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2015,21(12):129-133．

［9］ 張雯,宋俊科,閆蓉,等．丹酚酸A通過Nrf2/HO-1途徑減輕大鼠腦缺血再灌注損傷．藥學(xué)學(xué)報(bào),2016,51(11):1717-1723．

［10］ 楊靜,吳鳳芝,李瑜霞,等．銀杏葉提取物緩釋劑穴位埋藥線對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織損傷及Nrf2/HO-1信號通路的影響．天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2017,29(1):27-33．