基于PLFA的高山櫟和高山松林松茸菌塘土壤微生物群落特征研究

楊淑嬌,楊永平,石玲玲,畢迎鳳,李建文,楊錦超,楊雪飛,*

1 中國科學(xué)院昆明植物研究所中國西南野生生物種質(zhì)資源庫,昆明 650201 2 中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049 3 中國科學(xué)院昆明植物研究所資源植物與生物技術(shù)重點實驗室,昆明 650201 4 西南林業(yè)大學(xué), 昆明 655024

外生菌根(Ectomycorrhiza,ECM)是由土壤真菌與植物根系形成的互惠共生體[1-2],是森林生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,在維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定和多樣性等方面發(fā)揮著重要作用[3]。松口蘑(Tricholomamatsutake),又名松茸,是一種北半球廣布的典型ECM真菌,主要與松科和殼斗科多種植物共生形成外生菌根,包括日本的赤松(Pinusdensiflora)、偃松(Pinuspumila)、南日本鐵杉(Tsugasiebordii)[4- 10],芬蘭的歐洲赤松(Pinussylvestris)、歐洲云杉(Piceaabies)[11],以及中國的高山松(Pinusdensata)、云南松(Pinusyunnanensis)、高山櫟(Quercussemecarpifolia)和元江錐(Castanopsisorthacantha)等[12, 13]。最新研究還發(fā)現(xiàn),松茸能被成功接種到其他科屬的根系,在試驗條件下產(chǎn)生共生關(guān)系甚至形成菌塘結(jié)構(gòu),例如,薔薇科的Prunusspeciosa[14]、樺木科的Betulaplatyphyllavar. japonica[15]以及楝科的Cedrelaherrerae[16]。這充分說明松茸宿主植物的多樣性和廣譜性。

松茸子實體是名貴的野生食用菌,主要出口日本,在當(dāng)?shù)厥袌錾蟽r格高達1000美元/kg[17]。以日本學(xué)者為主的科學(xué)家對松茸的人工栽培進行了近百年的探索[10-11, 18-19],取得一定成果。目前能實現(xiàn)菌根合成并生成一定的菌塘結(jié)構(gòu),但尚未完全實現(xiàn)人工栽培出菇[20-21]。究其原因,一方面是我們對松茸與其宿主植物之間的相互關(guān)系和作用機制的了解不全面；另一方面,對松茸菌塘及其內(nèi)的微生物群落特征了解較少。

菌塘(Shiro)是由松茸的地下菌絲、宿主根系及周圍的土壤結(jié)合形成的白色海綿狀結(jié)構(gòu)[4],是松茸生長的重要載體和完成主要生活史的具體場所[22]。關(guān)于松茸菌塘內(nèi)的微生物,前人已做了一些探討[23- 26],研究結(jié)果的廣度和深度隨著技術(shù)的發(fā)展不斷提高。日本學(xué)者Ohara等人早在1967年便采用分離培養(yǎng)的方式發(fā)現(xiàn)菌塘中可培養(yǎng)的細菌和放線菌減少[23]。隨著技術(shù)的發(fā)展,Lian[24]、Kataoka[25]、Vaario[26]、馬大龍[27]等人分別通過形態(tài)學(xué)鑒定、ITS(Internal transcribed spacer,ITS)多態(tài)性分析、PCR-變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技術(shù)、磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid,PLFA)生物標記法等手段對松茸菌塘土壤微生物群落特征進行了深入研究。近年來,由于新一代測序技術(shù)的發(fā)展,宏基因組學(xué)方法也運用到松茸菌塘的研究中來[28-29]。盡管如此,前人對松茸菌塘微生物的研究只針對松科某一種宿主森林類型,如Ogawa[4, 7- 9],Lian[24],Ohara[23],Kataoka[25]和Kim[28-29]等人的研究,尚未見殼斗科宿主森林菌塘內(nèi)微生物群落的研究報道。除此之外,還未見不同宿主森林類型內(nèi)松茸菌塘微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的對比分析,缺乏對規(guī)律性的認知。

本研究以松茸典型產(chǎn)區(qū)云南省迪慶州香格里拉縣分布的高山櫟林和高山松林為研究對象,采用磷脂脂肪酸(PLFA)生物標記法[30]對比研究上述兩種松茸宿主森林類型內(nèi)的菌塘和非菌塘的土壤微生物群落特征,分析與其相關(guān)的土壤化學(xué)性質(zhì)。目的是回答松茸菌塘微生物群落特征在不同林型間是否存在異同的科學(xué)問題,為科學(xué)管理具有高附加值的松茸資源,保障其產(chǎn)量和質(zhì)量,以及探索人工栽培條件奠定研究基礎(chǔ)。

1 研究地區(qū)與研究方法

1.1 研究點概況

選擇松茸產(chǎn)量較高且具有高山松和高山櫟分布的云南省迪慶州香格里拉縣建塘鎮(zhèn)吉迪村為研究地點。該村所在的香格里拉縣平均海拔3300m,干濕季分明且晝夜溫差較大。年平均氣溫為7.3℃,年平均最低氣溫為1.9℃,年平均最高氣溫為14.3℃,年平均降水量為38.5mm,年平均相對濕度為61%(中國氣象數(shù)據(jù)網(wǎng)http: //data.cma.cn/site/index.html香格里拉氣象站數(shù)據(jù))。其中高山櫟林研究點(99°37′52.59″E,28°05′38.48″N)平均海拔為3747m,森林建群種為高山櫟(Quercussemecarpifolia),約占45.19%,平均高度為7.71m；高山松林研究點(99°38′28.73″ E,28°04′11.09″N)平均海拔為3452m,森林建群種為高山松(Pinusdensata),約占64.06%,平均高度為6.20m。兩種森林類型下均有杜鵑灌叢分布。

1.2 樣品采集

土樣采集工作于2014年8月上旬完成,該時間段為松茸出菇的活躍期。為使取樣具有代表性,在兩種林型各設(shè)置了5個20m×20m的重復(fù)樣方。為避免假重復(fù),樣方間的距離均大于25m,且每個樣方中至少有3個距離大于2m的松茸菌塘。去除土壤腐殖質(zhì)層后,在每個樣方中,用土鉆采集3個菌塘的礦質(zhì)層0—10cm處的土壤。作為對照,再根據(jù)五點取樣法采集5個非菌塘的礦質(zhì)層0—10cm處的土壤。采集的土樣先過4mm篩,然后用冰袋保鮮及時運回實驗室。所有土樣一部分風(fēng)干用于土壤化學(xué)性質(zhì)測定,另一部分保存在-20℃冰箱用于土壤微生物分析。

本實驗共10個樣方,80份土壤樣品。后期處理中,按樣方將重復(fù)樣品均勻合并,每個樣方有2份土壤樣品：一份菌塘礦質(zhì)層土樣和一份非菌塘礦質(zhì)層土樣。最終共有20份土壤樣品用于后面的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析和土壤化學(xué)性質(zhì)測定。

1.3 土壤化學(xué)性質(zhì)測定

用于化學(xué)性質(zhì)測定的土壤首先過2mm的篩,一部分用碳氮分析儀(Vario MAX CN,Germany)測定土壤全碳和全氮含量,用ICP-AES分析儀測定土壤全磷含量。另一部分經(jīng)研磨再過0.25mm篩后用精密酸度計(PHS- 3C,Shanghai)測定土壤pH值。測定過程交由中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園生物地球化學(xué)實驗室完成。

1.4 土壤微生物群落PLFAs測定

土壤微生物群落組成的測定,采用PLFA生物標記法。PLFA的提取過程參考Bossio和Scow[31]的方法,測定過程由中國科學(xué)院華南植物園退化生態(tài)系統(tǒng)植被恢復(fù)與管理重點實驗室完成。

1.5 數(shù)據(jù)處理

對PLFA原始數(shù)據(jù)進行整理,包括每個樣品中PLFA的組成、百分含量和生物量等信息。其中,單個PLFA的百分含量表示該特征PLFA占總提取的PLFAs量的百分數(shù)[30]。單個PLFA的生物量由內(nèi)標19:0的反應(yīng)值轉(zhuǎn)換而來,單位為nmol/g,表示每克干土中該PLFA的含量,公式如下：

用R軟件包(vegan)進行數(shù)據(jù)分析。測定微生物多樣性的指標,包括Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)、Pielou均勻度指數(shù)(Evenness,J)和PLFAs豐度(Richness,S)。具體計算公式如下：

(1)Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)[30,32]：

式中,S表示樣品中 PLFA生物標記的數(shù)目,即豐度,Pi表示第i個種占總數(shù)的比例。

(2)Pielou均勻度指數(shù)(J)[30, 32]：

用百分含量、生物量和多樣性指數(shù)表征土壤微生物群落組成。根據(jù)各個變量的數(shù)據(jù)分布屬性,分別采用二項分布檢驗(Binomial test,針對百分含量),雙因素方差分析(Two-way ANOVA,針對生物量)和泊松分布檢驗(Poisson test,針對總PLFAs多樣性、均勻度和豐度)進行菌塘、林型及其交互作用對土壤微生物組成影響的顯著性檢驗。用非參數(shù)多元方差分析法(Permutational analysis of variance,PERMANOVA)分析群落結(jié)構(gòu)差異,及其與菌塘和林型的相互關(guān)系,并通過典范對應(yīng)分析(Canonical correspondence analysis,CCA,CANOCO 4.5軟件)偶聯(lián)與之相關(guān)的土壤化學(xué)因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌塘的土壤微生物群落組成

不同的磷脂脂肪酸表征不同的微生物類群[33],表1顯示了所有樣品中出現(xiàn)的PLFAs及其代表的微生物類群。所有樣品中共出現(xiàn)了76種PLFAs,每個樣品中平均有(40±5)種。

菌塘中共計出現(xiàn)63種PLFAs,其中主要的10種PLFAs分別為指代真菌的18:2ω6,9c(8.49%)、18:1ω9c(7.51%)和18:3 w6c (6,9,12)(2.44%),共占18.44%；指代革蘭氏陰性菌的19:0 cyclo w8c,占3.78%；指代革蘭氏陽性菌的15:0 iso,占3.51%；未被鑒定的非特異性脂肪酸16:0(16.96%)、17:1 anteiso B(13.77%)、18:1 w6c(6.85%)、16:1 w6c(4.75%)和18:0(3.16%),共占45.49%。

表1 用于微生物生物標記的磷脂脂肪酸

GNB: 革蘭氏陰性菌 Gram-negative bacteria;GPB: 革蘭氏陽性菌 Gram-positive bacteria;AMF: 叢枝菌根真菌 Arbuscular mycorrhizal fungi;F/B: 真菌/細菌比 Ratio of fungal to bacterial PLFAs;GNB/GPB: 革蘭氏陰性菌/陽性菌比 Ratio of Gram-negative bacterial to Gram-positive bacterial PLFAs

2.2 菌塘和林型對土壤微生物群落組成的影響

總結(jié)土壤微生物群落組成的各個指標在菌塘和林型間的差異(表2),統(tǒng)計檢驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),土壤微生物的百分含量、生物量和多樣性均在不同程度上受菌塘的影響,植被類型對土壤微生物群落的影響僅體現(xiàn)在個別類群的生物量方面。

菌塘內(nèi)真菌百分含量顯著增加(P< 0.001),革蘭氏陰性菌(GNB,P< 0.05)和革蘭氏陽性菌(GPB,P< 0.01)的百分含量顯著降低。例如,真菌百分含量在高山櫟林內(nèi)由12.03±0.25增加為19.98±3.38,在高山松林內(nèi)由13.92±0.39增加到16.89±1.02。菌塘內(nèi)放線菌和叢枝菌根真菌(AMF)的百分含量減少,但不顯著(P> 0.05)。菌塘內(nèi)真菌/細菌生物量比(F/B)顯著高于非菌塘(P< 0.01)?？偟膩碚f,菌塘并不影響土壤微生物總PLFAs多樣性(Shannon多樣性指數(shù))和豐度,及各微生物類群的PLFAs豐度,但菌塘內(nèi)土壤微生物總PLFAs均勻度(Pielou均勻度指數(shù))顯著低于非菌塘(P< 0.05)。

除了真菌和AMF的生物量,林型對大部分表征土壤微生物群落組成指標的影響并不顯著,也不與菌塘產(chǎn)生交互作用。林型對真菌和AMF生物量的影響表現(xiàn)為：真菌和AMF生物量在高山櫟林內(nèi)均顯著高于高山松林(P< 0.05)。

表2 菌塘、林型及其交互作用對土壤微生物百分含量、生物量和多樣性的影響

ns:P> 0.05, *P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001；a: 采用二項分布檢驗;b: 采用雙因素方差分析；c: 采用泊松分布檢驗

2.3 菌塘和林型對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

通過非參數(shù)多元方差分析發(fā)現(xiàn)(表3),菌塘、林型均顯著影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu),其中菌塘(R2=0.263,P< 0.01)的影響大于林型(R2=0.173,P< 0.05)的影響,但兩者的交互作用對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響不顯著(P> 0.05)。

表3 菌塘、林型及其交互作用對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的非參數(shù)多元方差(PERMANOVA)分析

*P< 0.05,**P< 0.01;df：自由度Degree of freedom；Sq：均方Mean Square；F.Model：F檢驗的結(jié)果The result of F-test

2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)與菌塘、林型和土壤化學(xué)性質(zhì)的關(guān)系

對樣品中出現(xiàn)頻率最高的40種磷脂脂肪酸進行典范對應(yīng)分析(Canonical correspondence analysis,CCA),發(fā)現(xiàn)除菌塘和森林類型外,各個土壤化學(xué)指標也在不同程度上與土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)相關(guān)(圖1)。然而進一步分析表明,這些土壤化學(xué)指標主要與林型相關(guān)聯(lián)(表4),表現(xiàn)為高山櫟林的全碳(P< 0.001)、全氮(P< 0.05)、全磷(P< 0.001)和碳氮比(P< 0.001)顯著高于高山松林,而pH值顯著低于高山松林(P< 0.05)。對于菌塘和非菌塘,土壤化學(xué)性質(zhì)間并無顯著差異(表4)。

表4 菌塘、林型及其交互作用對土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

ns:P> 0.05, *P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001

圖1 土壤微生物PLFAs與土壤化學(xué)性質(zhì)的典范對應(yīng)分析 Fig.1 Canonical correspondence analysis of soil microbial PLFAs and soil chemical factorsQs: 高山櫟林 Q. semecarpifolia; Pd: 高山松林 P. densata; Shiro: 菌塘; Non-Shiro: 非菌塘;TC: 全碳 Total carbon; TN: 全氮 Total nitrogen; TP: 全磷 Total phosphorus; C/N: 碳氮比 Ratio of total carbon to total nitrogen

3 討論

掌握菌塘內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)及其與宿主植物的相互關(guān)系,對科學(xué)管理具有高附加值的松茸資源,保障其產(chǎn)量和質(zhì)量、并最終實現(xiàn)人工栽培具有重要意義。在自然界松茸與松科和殼斗科的多個物種產(chǎn)生共生關(guān)系。過去針對赤松(Pinusdensiflora)林[23- 25, 28-29]、偃松(Pinuspumila)林[7]、云杉(Piceaglehnii)林[8]、鐵杉(Tsugasieboldii)林[4]等宿主森林的研究為我們認知松茸菌塘內(nèi)的微生物群落組成奠定了基礎(chǔ)。但這些研究結(jié)果通常相對獨立、缺乏橫向?qū)Ρ?限制了我們對松茸菌塘微生物群落特征的規(guī)律性認知。本研究不僅首次研究了殼斗科高山櫟林內(nèi)的菌塘微生物群落特征,還將其與高山松林進行對比分析,淺析其共性和規(guī)律。

研究主要發(fā)現(xiàn),盡管高山櫟林的真菌和AMF的生物量顯著高于高山松林(表2),且兩種林型在微生物群落結(jié)構(gòu)上存在顯著差異(表3、圖1),但高山櫟林和高山松林間菌塘微生物群落特征的差異并不顯著。此外,非參數(shù)多元方差分析也表明菌塘對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響大于林型(表3),且兩者間不產(chǎn)生交互作用。綜上所述,研究認為本研究涉及的兩種林型間松茸菌塘微生物群落的特征基本相似,具有共性。然而該共性是否普遍存在并具有規(guī)律？有待更加廣泛的取樣和深入的研究來解答。

松茸菌塘具有特定的微生物群落特征。與非菌塘相比,菌塘內(nèi)的真菌含量增加,可能主要由松茸本身為優(yōu)勢類群所決定。無論采用哪種方法,前人已知的研究結(jié)果均表明菌塘內(nèi)細菌減少[23, 25]。本研究再次印證了該觀點,發(fā)現(xiàn)GPB和GNB在菌塘中的百分含量顯著下降。分析其原因,目前存在兩種可能性解釋。首先,根據(jù)最新研究,松茸子實體在實驗室離體條件下會分泌由吡喃糖氧化酶(pyranose oxidase)產(chǎn)生的過氧化氫,可抑制致病菌立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)的生長[42]。本研究中土壤取樣時間恰好是出菇期,如果在野外條件下松茸子實體也能分泌過氧化氫,可能是解釋GPB和GNB減少的原因。其次,Park等人[43]從松茸擔(dān)子果、赤松根尖和菌塘土壤中均分離到一個木霉屬新種Trichodermasongyi,該屬物種通常為植物病原體的生物控制媒介,而Vaario等[26]的文章也提出,木霉屬真菌與松茸總是存在共生關(guān)系,因此另一種可能即是松茸在木霉屬物種的協(xié)助下抑制菌塘內(nèi)細菌生長。

本研究還發(fā)現(xiàn),從PLFAs多樣性看,菌塘與非菌塘并不存在顯著差異,也就是說菌塘也具有豐富的類群多樣性(表2),這與Vaario等[26]的觀點相似。另外,菌塘與非菌塘的總PLFAs生物量也基本等量。有趣的是,針對北方溫帶森林外生菌根菌Piloderma菌絲墊和非菌絲墊(與本文菌塘和非菌塘概念相似)的定量PCR研究也有類似發(fā)現(xiàn)[44]。這可能說明在外生菌根菌主導(dǎo)的土壤菌絲際,微生物總生物量與周邊土壤保持一致。然而,菌塘的PLFAs均勻度顯著下降,說明盡管總生物量和多樣性維持穩(wěn)定,但菌塘內(nèi)各組分間的相對含量較非菌塘發(fā)生了變化,這種變化的結(jié)果使得各組分間的相對含量差異增大。最為典型的代表便是真菌與細菌的相對變化上,菌塘內(nèi)真菌比例增加,細菌比例下降,導(dǎo)致菌塘內(nèi)F/B顯著增加(表2)。

分析發(fā)現(xiàn)盡管兩種林型間的pH、全碳、全氮、全磷和碳氮比存在顯著差異(表4),但菌塘和非菌塘的土壤化學(xué)特征基本相同,說明松茸主導(dǎo)菌塘后并未改變土壤的化學(xué)性質(zhì)。該結(jié)果與Vaario等[26]在的芬蘭的研究結(jié)果相同。最后,值得注意的是,仍有超過一半的PLFAs未能被鑒定(表2),在一定程度上限制了我們對菌塘微生物群落的全面理解,未來可結(jié)合其他研究手段,特別是結(jié)合下一代測序技術(shù)深入解析松茸菌塘的微生物群落特征。

4 結(jié)論

綜上所述,松茸菌塘內(nèi)的土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)特征與非菌塘存在差異,菌塘的真菌含量和F/B增加,細菌含量減少,表明松茸改變了菌塘的土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu),導(dǎo)致菌塘具有特定的微生物群落特征。此外,菌塘和非菌塘微生物群落特征的差異在高山櫟和高山松林內(nèi)表現(xiàn)相似,說明松茸對菌塘微生物群落結(jié)構(gòu)的影響不隨宿主森林類型而改變。

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