試驗方法和接種物來源對苯甲酸鈉快速生物降解率的影響

鄧桂榮，劉洪英，梅承芳，張宏濤，柳燕貞，曾國驅(qū),*

1. 廣東省微生物分析檢測中心, 生態(tài)毒理與環(huán)境安全實驗室，廣州 510070 2. 廣東省微生物研究所, 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣州 510070 3. 省部共建華南應用微生物國家重點實驗室, 廣州 510070 4. 環(huán)境保護部固體廢物與化學品管理技術(shù)中心, 北京 100029

隨著科學技術(shù)的飛速發(fā)展和經(jīng)濟水平的快速提高，新化學物質(zhì)的種類和數(shù)量增加的速度越來越快。據(jù)悉，全球每年有1 000～2 000種新化學物質(zhì)問世[1]，以商業(yè)目的在我國出現(xiàn)的現(xiàn)有化學物質(zhì)近4.6萬種[2]。這些化學品在提高人們生活質(zhì)量的同時，進入環(huán)境后對人類健康和生態(tài)系統(tǒng)都存在著不同程度的安全隱患。因此，通過各種技術(shù)手段了解化學品在環(huán)境中的歸趨非常重要。而在這些化學品的生態(tài)毒理風險評估中，快速生物降解性測試扮演著不可或缺的角色。

早在2008年，歐盟實施的《關(guān)于化學品注冊、評估、許可與限制(REACH)法規(guī)》和EC 440 2008法規(guī)已將國際上普遍采用的經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)的6種經(jīng)典快速生物降解性測試方法[3]寫入技術(shù)法規(guī)，要求進口到歐盟成員國的化學品提交這些測試數(shù)據(jù)[4]。而為了保障化學品對生態(tài)環(huán)境的安全，我國新化學物質(zhì)登記制度規(guī)定在我國境內(nèi)從事研究、生產(chǎn)、進口和加工使用的新化學物質(zhì)必須提交基于這6種方法的快速生物降解性數(shù)據(jù)[5-6]。由此可見化學品快速生物降解性測試在生態(tài)毒理測試中的重要地位。

然而，在實踐中發(fā)現(xiàn)，采用同一來源接種物、不同快速生物降解性試驗方法對同一受試物進行測試時，所得結(jié)果可能存在較大差異。李斯穎[7]認為是接種物濃度和分析方法不同所致。而采用同一試驗方法、不同來源接種物測試同一受試物時，也出現(xiàn)重現(xiàn)性和可比性差的情況。Ginkel等[8]、Vázquez-Rodríguez等[9]、Dechrugsa等[10]和Mezzanott等[11]指出這是由于不同來源的接種物的組分尤其是微生物種群差異較大。重現(xiàn)性和可比性的不足嚴重影響了測試數(shù)據(jù)和結(jié)果的可靠性，容易延誤新化學物質(zhì)的正常申報，增加了新化學物質(zhì)進入環(huán)境后潛在風險的不確定性。因此，探究試驗方法、接種物來源以及兩者的交互效應對受試化學品生物降解率的影響具有重要的實用價值。

本文以廣州地區(qū)2個主要處理生活污水的污水處理廠為接種物來源，以《化學品測試方法》[12]推薦的陽性參照物苯甲酸鈉為受試物，從2013年至2015年，分別采用OECD快速生物降解性301系列試驗方法[13]中較為廣泛應用的方法(301B：CO2產(chǎn)生試驗[14]、301D：密閉瓶法試驗[15]和301F：測壓呼吸計量法試驗[16])，測試苯甲酸鈉14 d生物降解情況，共獲得89個標準化測試數(shù)據(jù)。采用SPSS軟件進行分析，考察了試驗方法、接種物來源以及兩者的交互效應對苯甲酸鈉生物降解率的影響，以期為測試機構(gòu)開展可快速生物降解類新化學物質(zhì)試驗時選擇試驗方法和接種物來源提供有益的參考。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1　受試物

苯甲酸鈉(≥99.5%)，分析純，購自廣州化學試劑廠。

1.2　儀器

數(shù)顯滴定儀(Titrette，德國，BRAND GMBH + CO KG)，溶解氧測定儀(Multi 3430，德國，WTW)，測試系統(tǒng)(OxiTop?Control，德國，WTW)，生化培養(yǎng)箱(SHP-350，中國，上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。

1.3　接種物

根據(jù)測試標準，接種物取自廣州地區(qū)2家主要處理生活污水且運行狀況良好的污水處理廠(DTS和LD)。301B和301F試驗取用位于曝氣池末端的活性污泥，經(jīng)過清洗、混合液懸浮固體濃度(Mixed Liquor Suspended Solids，MLSS)[17]測定、重新懸浮等一系列處理后，得到活性污泥濃度為4.0 g·L-1(以干重計)的接種物。301D試驗則直接取用二級出水為接種物。

1.4　試驗條件

301B：(22±2) ℃；301D：(20±1) ℃；301F：(22±1) ℃。試驗過程中均保持黑暗。

1.5　方法

按照我國化學品測試導則[12]和《化學品測試方法》[3,13]中的標準條件進行試驗，每組試驗方法均包括了空白對照組、受試物處理組?？瞻讓φ战M僅含接種物，受試物處理組包含苯甲酸鈉和接種物。由于已知苯甲酸鈉不會對接種物中的微生物產(chǎn)生毒性效應，因此不設(shè)置毒性對照組。按照不同方法的要求設(shè)置每個處理組的平行數(shù)。

所有試驗均遵循GLP規(guī)范的要求[18-19]，操作步驟按照標準操作程序(SOP)的規(guī)定實施。

1.6　數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Microsoft Office Excel 2007統(tǒng)計苯甲酸鈉的生物降解率后，應用SPSS Statistics 17.0軟件對各組試驗數(shù)據(jù)進行方差分析和多重比較檢驗(LSD法)，統(tǒng)計顯著水平設(shè)為P=0.05。

2　結(jié)果與分析(Results and analysis)

2種接種物來源進行3種試驗方法的快速生物降解性測試共計89個，測試數(shù)量及分布如表1所示。

以苯甲酸鈉生物降解率為自變量，分別以試驗方法和接種物來源為因變量進行方差齊性檢驗，計算得Sig.依次為0.850和0.557，大于0.05，因此認為各試驗方法和各接種物來源對應的苯甲酸鈉生物降解率方差相等。

表1　試驗數(shù)量匯總表Table 1　Summary of test number

2.1　同一試驗方法不同來源的接種物對苯甲酸鈉生物降解率的影響

由表2可知，以不同來源的接種物，采用同一試驗方法測試苯甲酸鈉生物降解率時，兩者差異并不明顯。使用這2種接種物的301B試驗，對苯甲酸鈉的生物降解率邊際均值分別為74.3%和75.2%，301D試驗相應的均值為78.7%和78.8%，301F試驗相應的均值則為87.1%和82.0%。表3主效應方差分析結(jié)果顯示，來自這2個生活污水處理廠的接種物對苯甲酸鈉生物降解率影響的顯著性概率Sig.為0.472，遠大于顯著性水平(P>0.05)，由此可以推斷接種物來源對苯甲酸鈉生物降解率無顯著影響。

2.2　不同試驗方法同一接種物來源對苯甲酸鈉生物降解率的影響

由表3可知，選擇不同的試驗方法對苯甲酸鈉的生物降解率影響的Sig.為0.000，說明當使用同一來源的接種物，采用不同的試驗方法進行測試時，苯甲酸鈉的生物降解率數(shù)據(jù)差異顯著。但各試驗之間的差異情況有別。表4表明，采用DTS接種物進行試驗，301B和301D，301B和301F，301D和301F的Sig.依次為0.291、0.002和0.035。在顯著性水平P=0.05下，可以認為301B和301D這2種不同試驗方法對苯甲酸鈉生物降解率影響的差異較小，而301B和301F，301D和301F之間確實存在顯著的差異。當采用LD接種物進行試驗時，301B和301D，301B和301F，301D和301F的Sig.依次為0.163、0.002和0.122，在顯著性水平P=0.05下，僅301B和301F之間出現(xiàn)了顯著性差異。而301B和301D，301D和301F之間的Sig.均大于顯著性水平，可認為兩者的苯甲酸鈉生物降解率的差異不明顯。

2.3　試驗方法和接種物來源的交互效應對苯甲酸鈉生物降解率的影響

圖1橫坐標代表3種試驗方法，縱坐標代表苯甲酸鈉的生物降解率邊際均值估計，2條折線反映試驗方法與接種物來源的交互效應下，苯甲酸鈉的生物降解率邊際均值的增減交叉變動情況。圖中折線存在交叉現(xiàn)象，表明試驗方法和接種物來源具有交互效應。通過兩者關(guān)系的進一步分析可知(見表3)，其F值為1.205，Sig.為0.305，大于0.05，說明試驗方法和接種物來源的交互效應并不顯著。

表2　試驗方法和接種物來源的邊際均值估計Table 2　Estimated marginal means of inoculum sources and test methods

表3　主效應方差分析表Table 3　Tests of between-subjects effects

注：a表示R2= 0.231(經(jīng)調(diào)整的R2= 0.184)。

Note: a. R Squared =0.231 (Adjusted R squared =0.184).

表4　試驗方法多重比較分析表Table 4　Multiple comparisons of test methods

注：*表示均差差值在0.05水平上顯著。

Note:*The mean difference is significant at the 0.05 level.

圖1　苯甲酸鈉生物降解率估計邊際均值折線圖Fig. 1　Line chart of estimated marginal means of sodium benzoate biodegradation rate

3　討論(Discussion)

隨著人們對生活的要求日益提高，環(huán)保部門對化學品污染問題越來越重視，快速生物降解性測試的應用越來越廣泛，實驗室之間甚至實驗室內(nèi)部同一受試物生物降解率的重復性和可比性差的問題急需解決，已引起化學品管理部門和測試機構(gòu)的高度關(guān)注。一般認為，造成這一現(xiàn)象主要有三大原因：一是接種物未能統(tǒng)一、規(guī)范化。楊倩等[20-21]研究指出，接種物易受到污水處理廠本身運行工藝、區(qū)域性的自然經(jīng)濟環(huán)境以及人們生活習慣等因素影響，微生物群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)差異性，進而影響到試驗的重復性及結(jié)果間的可比性。這點在本文中未得到印證，根據(jù)長期的實踐經(jīng)驗，推測可能是因為苯甲酸鈉本身就具有快速生物降解性，在環(huán)境中可迅速降解，被列為"易生物降解"類物質(zhì)，該類物質(zhì)受到接種物來源的影響較小，容易獲得一致的結(jié)果。而當受試物僅具有中等快速生物降解性，特別是10 d觀察期內(nèi)生物降解率在60%上下浮動時，接種物來源的影響效應更加明顯。二是試驗方法本身的影響。同樣是快速生物降解性試驗，但采用不同的試驗方法，可能得到截然不同的結(jié)果。梅承芳等[22]通過4,4’-二氨基二苯甲烷(4,4’-diaminodiphenylmethane，MDA)的301A、B、D和F的快速生物降解性測試發(fā)現(xiàn)，301F的生物降解率最高，為100%，而最低的301D為0%，兩者差異高達100%。出現(xiàn)此類情況的原因是多方面的，例如接種物濃度、試驗系統(tǒng)構(gòu)成和評價方法等。因此，選擇試驗方法時，在滿足受試物的水溶性、揮發(fā)性和吸附性的條件下，盡量選擇可能得到高生物降解率的方法，可能更能表征受試物在實際環(huán)境中的快速生物降解性能。三是目標受試物分子結(jié)構(gòu)影響。有觀點認為，有機化學品的分子結(jié)構(gòu)參數(shù)可能影響其快速生物降解性[23-24]。不可否認，化學品生物降解是一個極其復雜的過程。比如，有些化學品在水體中會產(chǎn)生新的中間產(chǎn)物，直到試驗結(jié)束，該中間產(chǎn)物并沒有最終降解，導致以試驗開始和結(jié)束時試驗系統(tǒng)中的母體受試物計算的生物降解率與以生物需氧量(biochemical oxygen demand, BOD)計算的生物降解率有較大差別。這需要在日常的工作實踐中認真觀察，善于總結(jié)，才能更好地甄別。

測試結(jié)果重復性和可比性差，直接制約著新化學物質(zhì)潛在環(huán)境風險的準確預判。本研究中，僅選擇3種快速生物降解性試驗方法，所用接種物僅來自2個城市生活污水處理廠，來源相對單一，區(qū)域性較強，而且僅以具有快速生物降解性的苯甲酸鈉為研究對象，存在一定的局限性。為了進一步系統(tǒng)地探明試驗方法、接種物來源以及兩者的交互效應對受試物最終快速生物降解性的影響情況，有必要在此基礎(chǔ)上選擇不同降解特性的受試物，同時選用另外3種快速生物降解性經(jīng)典測試方法，并且在滿足測試方法要求的前提下，取自全國不同地區(qū)不同性質(zhì)的接種物，深入研究不同試驗方法和不同來源的接種物對化學品快速生物降解測試結(jié)果的作用機制，無論是對于新化學物質(zhì)測試機構(gòu)正確選擇試驗方法和接種物來源，還是對于政府管理部門準確管控新化學物質(zhì)的環(huán)境風險，都具有重要的指導意義。

本研究結(jié)果表明，當受試物為易生物降解時，接種物來源、試驗方法和接種物來源的交互效應對該受試物的生物降解率無顯著的影響，但在同一條件下，選擇不同的試驗方法往往會導致最終生物降解率出現(xiàn)明顯差異。

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