對(duì)EDTA-K2依賴性假性血小板減少不同檢測(cè)方法結(jié)果的比較

郭　謙1,2，王曉健1,2，曹　榮2，張愛愛2，張文平

(1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原　030001；2.山西省汾陽(yáng)醫(yī)院，山西 汾陽(yáng)　032200)

國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)自1993年起就將EDTA-K2抗凝劑推薦為全血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的首選抗凝劑[1]。隨著各種全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀的普及，EDTA-K2抗凝劑的使用也越來(lái)越廣泛，但是在用EDTA-K2抗凝劑進(jìn)行血常規(guī)檢驗(yàn)時(shí)部分患者會(huì)出現(xiàn)EDTA-K2誘導(dǎo)血小板聚集的現(xiàn)象，聚集以后的血小板體積變大，使得傳統(tǒng)的電阻抗檢測(cè)法無(wú)法檢出聚集以后的血小板，而使血小板計(jì)數(shù)假性減低，造成臨床誤診[2]，找出解決此問題的解決辦法是十分必要的。本研究對(duì)20例由EDTA-K2抗凝劑誘導(dǎo)血小板假性減少的患者用不同的方法進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，然后對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行比較，從而找出可以準(zhǔn)確計(jì)數(shù)EDTA-K2依賴性血小板假性減少患者血小板的方法。

1　資料與方法

1.1　一般資料

收集2016年7月～2017年4月EDTA-K2抗凝靜脈血在Sysmex XE-2100全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀上首次檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)結(jié)果低于100×109/L(血小板低于100×109/L應(yīng)復(fù)檢),推片復(fù)檢發(fā)現(xiàn)血小板聚集，且無(wú)可以導(dǎo)致血小板減少的疾病及病史，無(wú)出血癥狀的20例患者的血液標(biāo)本。

1.2　儀器與試劑

Sysmex XE-2100全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀和Sysmex KX-21血液分析儀及原廠家提供的配套試劑；靜脈血EDTA-K2真空抗凝管、枸櫞酸鈉真空抗凝管由蘇州碧迪醫(yī)療器械有限公司提供；Olympus雙目顯微鏡；20μL微量采血管由天津市薊縣興達(dá)公司提供；一次性靜脈采血針由湖北仙明醫(yī)療器械有限公司；0.2 g/2 mL阿米卡星注射液由珠海貝索醫(yī)藥公司生產(chǎn)；瑞氏-吉姆薩復(fù)合染液嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程配置[1]。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1EDTA-K2抗凝靜脈血電阻抗法及光學(xué)法檢測(cè)使用Sysmex XE-2100全自動(dòng)血液分析儀對(duì)患者的EDTA-K2抗凝靜脈血進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，電阻抗法通過儀器第3通道(CBC+DIFF)進(jìn)行檢測(cè)，光學(xué)法通過儀器第4通道(CBC+DIFF+RET)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)觀察血小板直方圖形態(tài)。每個(gè)患者分別作3次平行測(cè)試取平均值，并且推片觀察血小板的分布情況。

1.3.2EDTA-K2抗凝靜脈血加入阿米卡星后檢測(cè)取1 000μLEDTA-K2抗凝靜脈血于試管中，向其中加入 0.2g/2 mL的阿米卡星60μL(預(yù)實(shí)驗(yàn)效果最佳)，混勻，靜置30 min后在Sysmex XE-2100全自動(dòng)血液分析儀的電阻抗通道進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)觀察血小板直方圖形態(tài)。每個(gè)患者做3次平行測(cè)試取平均值，并且推片觀察血小板分布情況。

1.3.3枸櫞酸鈉抗凝靜脈血檢測(cè)使用Sysmex XE-2100全自動(dòng)血液分析儀的電阻抗通道對(duì)患者的枸櫞酸鈉抗凝靜脈血進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，每個(gè)患者作3次平行測(cè)試取平均值，同時(shí)觀察血小板直方圖形態(tài)并推片觀察血小板的分布情況。

1.3.4末梢血檢測(cè)取一潔凈試管加入500μL稀釋液，取患者20μL末梢血液加入稀釋液中，混勻，使用Sysmex KX-21三分類儀進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)患者做2次平行測(cè)試取平均值并觀察血小板直方圖形態(tài)。同時(shí)用末梢血立即推片，觀察血小板分布情況。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　血小板計(jì)數(shù)結(jié)果比較

對(duì)于EDTA-K2依賴性假性血小板減少的患者，EDTA-K2抗凝靜脈血光學(xué)法與電阻抗法血小板計(jì)數(shù)結(jié)果均較低，小于100×109/L，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；枸櫞酸鈉抗凝靜脈血、末梢血、加入阿米卡星的EDTA-K2抗凝靜脈血的血小板計(jì)數(shù)結(jié)果均在100×109/L以上，與EDTA-K2抗凝靜脈血的血小板計(jì)數(shù)結(jié)果，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1～4。

表1　EDTA-K2抗凝靜脈血電阻抗法與光學(xué)法血小板檢測(cè)結(jié)果比較　×109/L

表2　不同抗凝劑抗凝靜脈血血小板檢測(cè)結(jié)果比較　×109/L

表3　不同類型血液標(biāo)本血小板檢測(cè)結(jié)果比較　×109/L

表4　EDTA-K2抗凝靜脈血加入阿米卡星前后血小板計(jì)數(shù)結(jié)果比較　×109/L

2.2　血涂片血小板分布情況比較

對(duì)于EDTA-K2依賴性假性血小板減少的患者，EDTA-K2抗凝靜脈血血涂片顯示血小板聚集；末梢血、枸櫞酸鈉抗凝靜脈血、加入阿米卡星的EDTA-K2抗凝靜脈血的血涂片顯示血小板散在分布或3～5個(gè)成簇分布。見圖1、2。

2.3　血小板直方圖形態(tài)比較

對(duì)于EDTA-K2依賴性假性血小板減少的患者，EDTA-K2抗凝靜脈血(電阻抗法和光學(xué)法)于Sysmex XE-2100儀器上檢測(cè)時(shí)，血小板直方圖峰值下降并出現(xiàn)翹尾現(xiàn)象；枸櫞酸鈉抗凝靜脈血、末梢血、加入阿米卡星的EDTA-K2抗凝靜脈血于相同儀器檢測(cè)時(shí)峰值正常并無(wú)翹尾現(xiàn)象發(fā)生。見圖3～5。

圖1EDTA-K2抗凝靜脈血血涂片的血小板分布情況

圖2枸櫞酸鈉抗凝靜脈血、末梢血、加入阿米卡星的EDTA-K2抗凝靜脈血血涂片的血小板分布情況

圖3EDTA-K2抗凝靜脈血血小板直方圖

圖4枸櫞酸鈉抗凝靜脈血、加入阿米卡星的EDTA-K2抗凝靜脈血血小板直方圖

圖5末梢血血小板直方圖

3　討論

目前，臨床上常用的全自動(dòng)血液分析儀進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)的方法有電阻抗法和光學(xué)法[3]。電阻抗法主要通過細(xì)胞的體積大小來(lái)區(qū)分血小板和紅細(xì)胞。光學(xué)法用熒光染料使細(xì)胞內(nèi)的核酸著色，再用相應(yīng)波長(zhǎng)的激光照射，利用表達(dá)細(xì)胞大小的前向散射光和表達(dá)細(xì)胞內(nèi)核酸濃度的側(cè)向熒光來(lái)識(shí)別血小板[4]。血小板體積較紅細(xì)胞小，在散點(diǎn)圖中分布在紅細(xì)胞下方，血小板內(nèi)含極少量的核酸，側(cè)向熒光的強(qiáng)度較成熟紅細(xì)胞稍大，因此能有效區(qū)分紅細(xì)胞和血小板。電阻抗法只能檢測(cè)體積在2～30fL內(nèi)的血小板[5]，當(dāng)EDTA-K2誘導(dǎo)血小板發(fā)生聚集而體積增大后，電阻抗法檢出的血小板數(shù)量偏低。光學(xué)法理論上可以檢出所有體積大小的血小板[5]，但此項(xiàng)研究表明光學(xué)法對(duì)EDTA-K2誘導(dǎo)的發(fā)生聚集的血小板檢出結(jié)果與電阻抗法的檢出結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。也就是說，當(dāng)EDTA-K2誘導(dǎo)血小板發(fā)生聚集后，電阻抗法和光學(xué)法的檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，不能正確反映患者的血小板數(shù)量。

EDTA-K2可以誘導(dǎo)血小板聚集是因?yàn)镋DTA-K2可以激活血小板，使血小板表面的隱匿性抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，與血漿中存在的自身抗體發(fā)生特異性的抗原抗體反應(yīng)，從而激活許多生物活性物質(zhì)，如磷脂酶A2、5-羥色胺、ADP等。這些生物活性物質(zhì)可以活化纖維蛋白原的受體，促進(jìn)血小板與纖維蛋白原結(jié)合，從而使血小板發(fā)生聚集。阿米卡星是一種氨基糖苷類的抗生素，可以抑制EDTA-K2對(duì)血小板的激活作用，避免血小板隱匿性抗原的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，因而可以抑制EDTA-K2誘導(dǎo)的血小板聚集[6]，糾正血小板計(jì)數(shù)假性減少的現(xiàn)象。

血小板本身就具有聚集的功能，正常人非抗凝血的血涂片上?？梢砸姷?～5個(gè)血小板成簇分布的現(xiàn)象[7]，因此本實(shí)驗(yàn)中20例患者的末梢血涂片出現(xiàn)3～5個(gè)血小板成簇分布的現(xiàn)象是正常的。

電阻抗法只能在2～30fL內(nèi)分析血小板，正常的血小板直方圖峰值在8fL左右，在20～30fL范圍內(nèi)幾乎與基線重合[7]。當(dāng)EDTA-K2誘導(dǎo)血小板發(fā)生聚集，體積增大后，體積在8fL左右的血小板數(shù)量下降，而20～30fL體積范圍內(nèi)及體積大于30fL的血小板數(shù)量增加，使得血小板直方圖的峰值下降，并且20～30fL范圍內(nèi)的部分曲線上揚(yáng)而出現(xiàn)翹尾的現(xiàn)象。

本實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于EDTA-K2依賴性的假性血小板減少的患者，更換抗凝劑、采集末梢血，加阿米卡星均可以糾正血小板計(jì)數(shù)，但應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)姆椒?。如：有文獻(xiàn)報(bào)道個(gè)別EDTA-K2依賴性血小板聚集的患者枸櫞酸鈉、肝素抗凝劑也可引起其血小板聚集[8]，此時(shí)更換抗凝劑的方法就無(wú)法糾正血小板計(jì)數(shù)，可以采集末梢血或添加阿米卡星來(lái)進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。

在實(shí)際檢驗(yàn)工作中，應(yīng)該重視復(fù)檢工作，嚴(yán)格按照“41條復(fù)檢規(guī)則”[9]對(duì)血小板計(jì)數(shù)低于100×109/L的標(biāo)本推片復(fù)檢，觀察血小板的數(shù)量及分布情況(金標(biāo)準(zhǔn))[1]。如發(fā)現(xiàn)血小板聚集的現(xiàn)象，應(yīng)及時(shí)與臨床溝通，若患者沒有可以導(dǎo)致血小板減少的疾病和出血癥狀，并排除采血等人為因素，則應(yīng)該及時(shí)采取有效的措施重新計(jì)數(shù)患者的血小板，保證發(fā)出準(zhǔn)確的檢驗(yàn)報(bào)告。

對(duì)于EDTA-K2依賴性假性血小板減少的患者，應(yīng)該根據(jù)具體情況，可以更換抗凝劑或者采集末梢血進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，還可以向1000μL EDTA-K2抗凝血中加入0.2 g/2 mL阿米卡星60μL，混勻，放置30 min后再進(jìn)行檢測(cè)。

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