鹽度脅迫對(duì)泥蚶存活率及3種酶活力的影響

李　敏，鄭伊諾，許凱倫，曾國(guó)權(quán)，陸榮茂，胡　園*

(1.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江 溫州　325005； 2.浙江省近岸水域生物資源開(kāi)發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州　325005)

近年來(lái)，干旱、暴雨頻發(fā)等自然因素以及人為因素的影響給灘涂貝類(lèi)的生存環(huán)境帶來(lái)巨大改變，其中鹽度受環(huán)境的變化更顯著。鹽度是影響貝類(lèi)分布和生理代謝最重要的生態(tài)因子之一，在不同地理環(huán)境中分布的貝類(lèi)，其可耐受的鹽度范圍不同，因而鹽度的變化對(duì)貝類(lèi)的生理活動(dòng)會(huì)造成一定影響[1-5]。一般而言，海水的鹽度直接影響貝類(lèi)體內(nèi)的滲透壓，當(dāng)海水鹽度改變時(shí)，為適應(yīng)環(huán)境，機(jī)體需重新平衡體內(nèi)外的水鹽系統(tǒng)，消耗能量，貝類(lèi)的正常生長(zhǎng)就會(huì)受到影響，只有在一定的鹽度范圍內(nèi)，水生動(dòng)物的生長(zhǎng)才能達(dá)到最大速度。

泥蚶(Tegillarcagranosa)隸屬軟體動(dòng)物門(mén)(Mollusca)，雙殼綱(Bivalvia)，蚶屬(Tegillarca)，是潮間帶中重要的養(yǎng)殖種類(lèi)。目前，在溫度、重金屬等脅迫對(duì)泥蚶影響的研究方面已有報(bào)道[6-8]，但是有關(guān)鹽度脅迫對(duì)泥蚶基礎(chǔ)生理代謝的研究資料不多。本試驗(yàn)以泥蚶為研究對(duì)象，研究了鹽度脅迫下泥蚶血漿滲透壓、過(guò)氧化物酶(POD)活力、總超氧化物歧化酶(TSOD)活力及組織Na+/K+-ATP酶活力的變化規(guī)律，旨在為泥蚶的滲透生理調(diào)節(jié)及適應(yīng)機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

供試用泥蚶于2016年6月底購(gòu)自浙江溫嶺。從中選擇活動(dòng)能力正常、健康、個(gè)體大小均勻的泥蚶進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)選取的泥蚶平均殼長(zhǎng)(3.43±0.07) cm，平均殼高(2.70±0.06) cm， 平均體重(15.63±0.80) g。

1.2　方法

1.2.1處理設(shè)計(jì)

本次試驗(yàn)采取靜水系統(tǒng)，設(shè)定8個(gè)鹽度梯度，鹽度分別為0、0.5%、1.0%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，另設(shè)置與貝類(lèi)取樣區(qū)域海水鹽度相似的鹽度1.5%作為對(duì)照組，其他鹽度組為實(shí)驗(yàn)組，各設(shè)3個(gè)平行組。通過(guò)加人工海水精鹽配制所需鹽度梯度，每隔24 h全量換水1次。2016年7月3—8日，每天取樣檢測(cè)1次。

1.2.2檢活方法

每天定時(shí)取出10只大小相近、活力相當(dāng)?shù)哪囹乐糜诔睾Ｋo置1 h后，采用目測(cè)法檢活，即活泥蚶雙殼緊閉，絞合縫嚴(yán)密，用手掰不開(kāi)，自動(dòng)張口的稍一觸動(dòng)即迅速閉合。

1.2.3樣品的制備

將泥蚶置于冰盤(pán)上，使用無(wú)菌注射器快速抽取血液，移入樣品管中冰浴，將血液置于低溫離心機(jī)，10 000 r·min-1速度下離心8 min，取上層液用以測(cè)定血漿滲透壓、POD活力及TSOD活力，樣品在24 h內(nèi)分析完畢。

取樣品組織時(shí)，每次每組隨機(jī)取6只試驗(yàn)?zāi)囹?，將其置于冰盤(pán)上解剖，用預(yù)冷的0.86%生理鹽水清洗2次，除去血液，用干凈濾紙擦拭干凈后取出組織置于5 mL干凈的預(yù)冷的離心管中，加入預(yù)冷的0.86%生理鹽水制成組織勻漿液，再將勻漿液置于3 000 r·min-1速度下離心10 min，取上清液測(cè)定有關(guān)數(shù)值。

1.2.4樣品的測(cè)定

血漿滲透壓的測(cè)定：利用Model型冰點(diǎn)滲透壓計(jì)測(cè)定血漿滲透壓，血漿滲透壓?jiǎn)挝挥胢Osm·kg-1表示。

酶活力的測(cè)定：POD活力、TSOD活力及Na+/K+-ATP酶活力的測(cè)定均采用南京建成生物研究所生產(chǎn)的試劑盒，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

血漿POD活力單位：每毫升血漿每分鐘催化1 μg底物的酶量為一個(gè)POD活力單位(U·mL-1)。

血漿TSOD活力單位：每毫升血漿在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位(U·mL-1)。

組織Na+/K+-ATP酶活力單位：每小時(shí)每毫克組織蛋白的組織中三磷酸腺苷酶分解三磷酸腺苷產(chǎn)生1 μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位(U·mg-1)。

1.3　成活率的計(jì)算

成活率=(成活數(shù)/總數(shù))×100。

1.4　數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 9.0分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1　鹽度脅迫對(duì)泥蚶成活率的影響

由表1可以看出，不同鹽度脅迫對(duì)泥蚶的存活率的影響不同。試驗(yàn)過(guò)程中，鹽度為3.5%、4.0%時(shí)，1 d內(nèi)泥蚶的死亡率達(dá)到100%，鹽度為3.0%，2 d時(shí)全部死亡，這2組在1 d時(shí)存活率極顯著低于對(duì)照組。而鹽度為2.0%、2.5%時(shí)3 d的存活率與對(duì)照組基本相同，均為60%。試驗(yàn)到4 d時(shí)0、0.5%、1.0% 3組存活率均為100%，到試驗(yàn)結(jié)束時(shí) 3組的存活率為50%。由此可以看出，隨著時(shí)間的進(jìn)行鹽度的變化對(duì)泥蚶存活率影響可表示為低鹽度組(0、0.5%、1.0%)>對(duì)照組(1.5%)和中鹽度組(2.0%、2.5%)>高鹽度組(3.0%、3.5%、4.0%)。

表1　鹽度脅迫下泥蚶的存活率　%

2.2　鹽度脅迫對(duì)泥蚶血漿滲透壓的影響

不同鹽度對(duì)泥蚶血漿滲透壓的影響見(jiàn)圖1，由圖1可以看出不同鹽度對(duì)泥蚶血漿滲透壓的影響不同，鹽度3.5%、4.0%在實(shí)驗(yàn)1 d時(shí)血漿滲透壓達(dá)(1 332±10) mOsm·kg-1、(1 661±18) mOsm·kg-1，較開(kāi)始分別增加了122.4%和177.3%，極顯著高于其他組；鹽度3.0%滲透壓隨著試驗(yàn)的進(jìn)行呈明顯上升趨勢(shì)，在2 d時(shí)滲透壓值最大，為(1 082±5) mOsm·kg-1，較開(kāi)始增加了80.6%；鹽度2.0%、2.5%在3 d時(shí)滲透壓值最高，分別為(708±1) mOsm·kg-1、(1 026±44) mOsm·kg-1，較開(kāi)始分別增加了18.2%和71.3%；對(duì)照組滲透壓值由試驗(yàn)開(kāi)始的(599±5) mOsm·kg-1，在1 d時(shí)先降低到最低值[(550±2) mOsm·kg-1]后增加，到試驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)到(560±5) mOsm·kg-1；低鹽度的2個(gè)組(0、0.5%)，滲透壓值隨時(shí)間的增加而降低，分別較開(kāi)始降低了42.2%、56.4%，均顯著低于對(duì)照組及其他實(shí)驗(yàn)組。

圖1　不同鹽度對(duì)泥蚶血漿滲透壓的影響

2.3　鹽度脅迫對(duì)泥蚶血漿POD活力及TSOD活力的影響

不同鹽度對(duì)泥蚶血漿POD活力及TSOD活力影響見(jiàn)圖2，由圖2可知不同鹽度脅迫下各處理組POD活力不同，隨時(shí)間的增加鹽度3.5%、4.0%組POD活力顯著降低，分別由1 d的(62.63±2.00) U·mg-1、(63.78±0.88) U·mg-1降低至(28.30±4.87) U·mg-1、(24.52±2.09) U·mg-1，分別降低了54.8%、61.6%；低鹽度組均較1 d時(shí)增加且在第5天的值最高，分別為(60.78±9.92) U·mg-1、(74.44±6.41) U·mg-1、(76.37±9.91) U·mg-1，分別增加了4.1%、42.6%、43.5%；對(duì)照組及其他2組均呈先降后增趨勢(shì)，在2 d時(shí)降低至最低值。

圖2　　　　不同鹽度對(duì)泥蚶血漿POD活力及TSOD活力的影響

從圖2可以看出，不同鹽度脅迫下各處理組TSOD活力不同，試驗(yàn)各組總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，對(duì)照組TSOD活力由1 d時(shí)的(207.41±2.63) U·mL-1下降至(122.22±28.10) U·mL-1，下降了41.1%；鹽度0、0.5%、1.0%、2.0%泥蚶血漿TSOD活力隨時(shí)間的增加而降低，分別下降了48.4%、80.1%、64.2%、34.6%；鹽度2.5%泥蚶血漿TSOD活力呈先增后降趨勢(shì)，在2 d時(shí)增加至最大，后較1 d降低9.8%；鹽度3.0%泥蚶血漿TSOD活力較1 d時(shí)增加22.7%，對(duì)照組TSOD活力顯著高于鹽度0組，極顯著高于鹽度0.5%、1.0%組。

2.4　鹽度脅迫對(duì)泥蚶Na+/K+-ATP酶活力的影響

鹽度脅迫對(duì)泥蚶Na+/K+-ATP酶活力的影響如圖3所示，試驗(yàn)過(guò)程中低鹽度各組呈現(xiàn)先降后增趨勢(shì)，對(duì)照組及中鹽度組呈降低趨勢(shì)。與試驗(yàn)開(kāi)始相比各組均有所降低，其中對(duì)照組由開(kāi)始的(1.805±0.004) U·mg-1降至(0.465±0.099) U·mg-1，降低了74.2%。低鹽度組在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)分別為(0.562±0.126) U·mg-1、(0.737±0.059) U·mg-1、(0.659±0.130) U·mg-1，分別降低了68.9%、59.2%、63.5%。中鹽度組較開(kāi)始分別降低了76.2%、81.8%。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)泥蚶組織NA+/K+-ATP酶活力呈現(xiàn)低鹽度組>對(duì)照組>中鹽度組。

圖3　　　　不同鹽度對(duì)泥蚶Na+/K+-ATP酶活力的影響

3　討論

泥蚶是變滲壓生物，沒(méi)有專(zhuān)門(mén)的滲透壓調(diào)解器官，環(huán)境因素尤其是生長(zhǎng)環(huán)境的鹽度變化對(duì)泥蚶生長(zhǎng)和生命活動(dòng)有重要影響，當(dāng)泥蚶生長(zhǎng)環(huán)境的鹽度升高或降低幅度過(guò)大時(shí)會(huì)出現(xiàn)閉殼及進(jìn)出水管收縮關(guān)閉，進(jìn)而導(dǎo)致泥蚶攝食活動(dòng)減少、生長(zhǎng)速度減慢等。本次試驗(yàn)中對(duì)照組及鹽度為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的實(shí)驗(yàn)組在試驗(yàn)結(jié)束前全部死亡，可能是由于泥蚶的滲透調(diào)節(jié)能力較弱，在鹽度高于1.5%條件下，滲透調(diào)節(jié)已經(jīng)接近極限，超過(guò)此極限，泥蚶即大量死亡。研究表明，泥蚶在低鹽度的海水中死亡率顯著低于高鹽海水中的死亡率，對(duì)高鹽更敏感，這與尤仲杰等[9]在海水溫度鹽度對(duì)泥蚶稚貝生長(zhǎng)及存活的影響的研究中結(jié)果一致。這可能是由于泥蚶棲息于海水鹽度較低且相對(duì)穩(wěn)定的水域，長(zhǎng)期的適應(yīng)使泥蚶缺乏長(zhǎng)期耐受高鹽的能力。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低鹽度的2個(gè)試驗(yàn)組(0、0.5%)滲透壓值，隨時(shí)間的增加而降低且均低于對(duì)照組及其他試驗(yàn)組，鹽度2.5%、3.0%、3.5%、4.0%處理在試驗(yàn)1 d時(shí)滲透壓值明顯增加，且均顯著高于其他各組，這與蔡星媛等[4]在鹽度脅迫對(duì)魁蚶稚貝血液滲透壓影響的研究中結(jié)果一致，對(duì)照組較開(kāi)始滲透壓值略有降低?？赡芤?yàn)楫?dāng)環(huán)境鹽度發(fā)生改變時(shí)，雙殼貝類(lèi)會(huì)緊閉雙殼、關(guān)閉進(jìn)出水管和外套腔來(lái)緩解高鹽或低鹽脅迫的壓力。試驗(yàn)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，泥蚶在鹽度脅迫時(shí)首先會(huì)關(guān)閉貝殼，隨后才逐漸緩慢開(kāi)殼，隨著試驗(yàn)時(shí)間的增加，低鹽脅迫下泥蚶閉殼時(shí)間相對(duì)較短，而鹽度2.5%、3.0%、3.5%、4.0%處理開(kāi)、閉殼次數(shù)減少，頻率也減少，因此若長(zhǎng)期處于高鹽脅迫環(huán)境中泥蚶的生長(zhǎng)和存活均會(huì)受到一定影響。

鹽度脅迫下貝類(lèi)滲透壓變化，隨之其生理活動(dòng)發(fā)生變化，在這個(gè)過(guò)程中貝類(lèi)體內(nèi)酶的活力也發(fā)生變化[10-12]。POD是一種生物氧化中的末端氧化酶[13]，它廣泛存在于生物各個(gè)組織中，能催化分解過(guò)氧化氫從而起到保護(hù)生物體的作用。本次試驗(yàn)表明，高鹽度組POD活力較開(kāi)始顯著降低，低鹽度組較開(kāi)始顯著增加。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)POD活力依次為低鹽度組>對(duì)照組> 高鹽度組，即POD活力與鹽度高低呈負(fù)相關(guān)。這與呂昊澤等[10]以及李子牛等[11]的研究結(jié)果相類(lèi)似。表明鹽度脅迫時(shí)，泥蚶為適應(yīng)環(huán)境通過(guò)增大POD活力來(lái)增強(qiáng)滲透壓適應(yīng)能力，從而減少環(huán)境對(duì)機(jī)體造成的傷害。而當(dāng)鹽度較大時(shí)，POD活力下降，可能是鹽度影響超過(guò)了泥蚶自身調(diào)節(jié)能力，因而在試驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)部分死亡現(xiàn)象。與POD活力相比TSOD活力開(kāi)始時(shí)增加后降低趨勢(shì)更明顯，這與呂昊澤等[10]的研究結(jié)果相似，說(shuō)明TSOD對(duì)鹽度脅迫更為敏感。

海洋無(wú)脊椎動(dòng)物組織中Na+/K+-ATP酶在其應(yīng)對(duì)環(huán)境中鹽度變化過(guò)程中發(fā)揮作用，Na+/K+-ATP酶活力與部分魚(yú)類(lèi)、雙殼貝類(lèi)等滲透壓的調(diào)節(jié)能力顯著相關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果表明，低鹽度各組呈現(xiàn)先降后增趨勢(shì)，對(duì)照組及高鹽度組呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)泥蚶組織Na+/K+-ATP酶活力呈現(xiàn)低鹽度組>對(duì)照組>中鹽度組。這與林聽(tīng)聽(tīng)等[14]的研究結(jié)果不同，林聽(tīng)聽(tīng)等[14]的研究發(fā)現(xiàn)：在不同鹽度脅迫下青蛤鰓組織中Na+/K+-ATP酶活性在低鹽時(shí)增加，高鹽時(shí)下降。可能由于試驗(yàn)對(duì)象及試驗(yàn)鹽度脅迫方式不同，泥蚶較青蛤而言在鹽度脅迫下自身滲透壓的調(diào)節(jié)時(shí)間不同，并且本次試驗(yàn)不是采取鹽度驟升或驟降的方式進(jìn)行脅迫，使得結(jié)果略有差異。

4　小結(jié)

環(huán)境鹽度對(duì)離水貝類(lèi)的存活影響較大，因而不同鹽度脅迫對(duì)泥蚶存活率的影響不同，在一定溫度的條件下合理降低貯藏鹽度能夠延長(zhǎng)泥蚶的存活率。

通過(guò)不同鹽度對(duì)泥蚶3種酶活力高低比較，在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)泥蚶血漿中POD活力呈低鹽度組>對(duì)照組>中高鹽度組，血漿中TSOD活力和組織中Na+/K+-ATP酶活性均較開(kāi)始有所下降。

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