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    耳聾基因的胚胎植入前診斷

    2018-04-19 02:24:10畢青玲黃莎莎戴樸
    中華耳科學(xué)雜志 2018年1期
    關(guān)鍵詞:耳聾染色體胚胎

    畢青玲黃莎莎戴樸

    1中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(北京100853)

    2中日友好醫(yī)院耳鼻喉科(北京100029)

    耳聾出生缺陷是影響我國(guó)出生人口素質(zhì)的重要疾病之一。2006年第二次全國(guó)殘疾人抽樣調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,中國(guó)聽力語(yǔ)言殘疾者有2780萬(wàn),在目前全國(guó)現(xiàn)有的8296萬(wàn)殘疾人中占到34%。7歲以下聾兒80萬(wàn),且每年新增3萬(wàn)聾兒。每1000個(gè)新生兒中,就有1-3名聽力障礙患者,其中至少一半與遺傳因素有關(guān)[1]。大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示GJB2和SLC26A4基因突變是我國(guó)最常見的致聾原因,致病比例分別占到15%、12%[2]。也就是說(shuō)27%的中國(guó)耳聾人群是由GJB2和SLC26A4這兩個(gè)基因突變導(dǎo)致。另外隨著二代測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用,更多罕見耳聾基因突變致聾者能夠得到成功的基因診斷。針對(duì)這些高危家庭,遺傳診斷與咨詢、生育指導(dǎo)及產(chǎn)前診斷目前是預(yù)防耳聾患兒出生可行的方法。2005年中南大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院首次報(bào)道SLC26A4基因突變耳聾產(chǎn)前診斷案例[3]。中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院聾病分子診斷中心自2006年起主要針對(duì)GJB2、SLC26A4這兩個(gè)中國(guó)人群中最常見的常染色體隱性遺傳耳聾基因建立了標(biāo)準(zhǔn)化的產(chǎn)前診斷流程[4]。但由于耳聾是非致死性疾病,其產(chǎn)前診斷及可能帶來(lái)的引產(chǎn)一直存在倫理爭(zhēng)議,隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人民生活水平提高及思想的轉(zhuǎn)變,亟需胚胎植入前診斷(preim plantation genetic diagno?sis,PGD)這種在孕前阻斷耳聾出生缺陷的方法,將預(yù)防關(guān)口前移,真正做到耳聾的一級(jí)預(yù)防。

    1 單基因遺傳病胚胎植入前診斷歷史及新進(jìn)展

    胚胎植入前診斷(preimplantation genetic diag?nosis,PGD)概念的提出始于1967年,Edwards和Gardner[5]對(duì)兔囊胚期胚胎成功進(jìn)行了性別鑒定,但之后的20余年受到試驗(yàn)技術(shù)和方法的制約,PGD沒有得到進(jìn)一步的發(fā)展。直到1990年Handyside[6]對(duì)卵裂球進(jìn)行活檢,應(yīng)用Y染色體特異性重復(fù)序列PCR擴(kuò)增的方法對(duì)胚胎進(jìn)行性別鑒定,避免了X連鎖隱性遺傳病男性患兒的出生。之后隨著PGD相關(guān)技術(shù)的不斷進(jìn)展,其臨床應(yīng)用范圍也不斷擴(kuò)大。PGD技術(shù)首次被應(yīng)用于單基因病是在1992年,Handyside[7]報(bào)道了對(duì)常染色體隱性遺傳的囊性纖維化患者進(jìn)行了成功的PGD。他們應(yīng)用復(fù)合巢式PCR的方法擴(kuò)增目的基因片段,通過單鏈構(gòu)象多態(tài)性凝膠電泳分析目的基因片段的基因型,選擇植入一枚攜帶單等位基因突變的雜合子卵裂球植入受試者子宮,成功地誕生了一個(gè)健康的女性嬰兒。之后全世界多家生殖中心陸續(xù)報(bào)道了多種單基因遺傳病的PGD成功案例。1994年,Griffin[8]等人首次報(bào)道將原位熒光雜交(fluorescent in situ hybridiza?tion,F(xiàn)ISH)的技術(shù)引入PGD過程,對(duì)胚胎細(xì)胞的性染色體進(jìn)行區(qū)分,成功使9位受試者受孕,并無(wú)一例誤診。FISH技術(shù)能夠提高性別選擇的準(zhǔn)確性,并能同時(shí)檢測(cè)性染色體和多條常染色體的拷貝數(shù),該技術(shù)被廣泛用于胚胎染色體疾病的診斷,直到2000年才被更加準(zhǔn)確、能夠全面檢測(cè)染色體組的比較基因組雜交技術(shù)(Comprehensive chromosom?al hybridization,CGH)所取代。2004年,Handyside AH[9]和HellaniA[10]幾乎同期報(bào)道了多重替代擴(kuò)增(multiple displacement amplification,MDA)技術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增在PGD領(lǐng)域中的應(yīng)用,他們分別以單細(xì)胞MDA產(chǎn)物為模板成功擴(kuò)增囊性纖維化、地中海貧血相關(guān)基因和多個(gè)微衛(wèi)星重復(fù)序列,驗(yàn)證了該方法的有效性和準(zhǔn)確性,并預(yù)測(cè)這種恒溫全基因組擴(kuò)增的方法可以代替之前以PCR為基礎(chǔ)的各種方法,成為PGD標(biāo)準(zhǔn)程序的第一步,適用于所有已知單基因遺傳病??梢哉f(shuō),MDA技術(shù)開啟了PGD領(lǐng)域的新時(shí)代。

    Karyomapping技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種PGD新技術(shù),2015年首次報(bào)道應(yīng)用于臨床[11]。這種技術(shù)在同樣以全基因組擴(kuò)增為基礎(chǔ),基于二代測(cè)序技術(shù)掃描全基因組范圍內(nèi)大于300,000個(gè)SNP標(biāo)記,進(jìn)行染色體篩查。同時(shí),通過位于目標(biāo)基因區(qū)域的SNP標(biāo)記,建立單倍體型,通過連鎖分析推測(cè)胚胎是否攜帶致病突變。這個(gè)技術(shù)的特點(diǎn)是無(wú)需進(jìn)行前期實(shí)驗(yàn),無(wú)需針對(duì)每一個(gè)遺傳病家庭進(jìn)行個(gè)體化PGD方法設(shè)計(jì),可以直接應(yīng)用于幾乎所有單基因遺傳病。有專家認(rèn)為,Karyomapping技術(shù)是目前單基因遺傳病領(lǐng)域的里程碑式的新技術(shù)[12,13]。但Karyomapping技術(shù)的問題在于數(shù)據(jù)量大,需要花費(fèi)大量的人力進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及處理,并由此導(dǎo)致檢測(cè)成本很高。同年Li Yan等發(fā)表了一種基于MAL?BAC全基因組擴(kuò)增的新單基因遺傳病PGD方法,被命名為突變位點(diǎn)聯(lián)合非整倍檢測(cè)及連鎖分析(mutated allele revealed by sequencing with aneuploi?dy and linkage analyses,MARSALA)[14]。他們首次提出可以通過一次低深度的二代測(cè)序同時(shí)進(jìn)行連鎖分、突變位點(diǎn)檢測(cè)及PGS。并成功地實(shí)現(xiàn)了針對(duì)一例多發(fā)軟骨瘤家庭的胚胎植入前診斷。

    PGD最初被用于耳聾基因是在2009年,分別由以色列的Gheona A[15]和臺(tái)灣的C.CWu[16]報(bào)道。Gheona A等在2004年至2009年期間,對(duì)14對(duì)分別為GJB235delG、GJB2167delT以及GJB6/D13S1830雜合突變的攜帶者夫婦進(jìn)行PGD,他們選取了GJB2和GJB6基因周圍12個(gè)STR位點(diǎn),用復(fù)合巢式PCR的方法同時(shí)擴(kuò)增突變的基因片段和具有雜合性的STR片段進(jìn)行診斷,其中8對(duì)夫婦獲得了成功妊娠。臺(tái)灣的C.CWu課題組為一對(duì)SLC26A4919A>G突變攜帶者夫婦進(jìn)行了PGD并成功生育一個(gè)表型正常的女嬰。該課題組應(yīng)用單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增(MDA)聯(lián)合目的基因擴(kuò)增和引物延伸微測(cè)序技術(shù)進(jìn)行基因型的辨別。2015年,解放軍總醫(yī)院報(bào)道了一例GJB2基因PGD的成功案例,同樣是應(yīng)用復(fù)合巢式PCR的方法,聯(lián)合STR連鎖分析篩選出一枚攜帶者胚胎植入并獲得成功妊娠[17]。這些成功案例在遺傳性耳聾的預(yù)防取得了很大的突破,但技術(shù)上仍然有一定的限制。例如未對(duì)胚胎進(jìn)行染色體掃描、復(fù)合巢式PCR診斷成功率低、對(duì)家庭個(gè)體化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)耗時(shí)耗力等。因此,針對(duì)耳聾的PGD尚未規(guī)模展開。

    2 胚胎植入前診斷的技術(shù)流程

    PGD建立在人工輔助生殖技術(shù)基礎(chǔ)上(Assist?ed Reproductive Technology,ART)俗稱試管嬰兒,其中體外受精-胚胎移植(IVF-ET)被稱為第一代試管嬰兒,應(yīng)用卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)(ICSI)的稱為第二代試管嬰兒。進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)的被稱為第三代試管嬰兒。PGD需要取胚胎少量細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),必須嚴(yán)格避免多余精子的污染,因此常規(guī)體外受精的方法不能滿足檢測(cè)要求,必須應(yīng)用單精子卵胞漿內(nèi)注射(intra?cytoplasmic sperm injection,ICSI)的方法進(jìn)行人工受精。臨床上PGD的流程包括了促超排卵、ICSI、胚胎體外培養(yǎng)及活檢、遺傳學(xué)檢測(cè)及胚胎植入的一系列過程。

    2.1 胚胎活檢技術(shù)

    為了取得胚胎的遺傳物質(zhì),需要對(duì)其進(jìn)行活檢,取得一定數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。目前極體活檢、卵裂球活檢、囊胚活檢是主流技術(shù),可根據(jù)檢測(cè)需求不同選擇相應(yīng)的活檢方式。

    2.1.1 極體活檢(polar body diagnosis,PBD):初級(jí)卵母細(xì)胞經(jīng)過第一次減數(shù)分裂排出含有二倍體染色體的第一極體并形成次級(jí)卵母細(xì)胞。次級(jí)卵母細(xì)胞的姐妹染色單體分離,進(jìn)行第二次減數(shù)分裂,排出具有與卵母細(xì)胞相同染色單體的第二極體。極體和卵母細(xì)胞的核型相互對(duì)應(yīng),因此可以通過檢測(cè)極體來(lái)推斷卵母的染色體狀態(tài)和基因型。極體對(duì)胚胎發(fā)育不產(chǎn)生作用[18],取出后不影響胚胎的完整性和其后的生長(zhǎng)發(fā)育,具有極大的優(yōu)勢(shì),但由于其只能反應(yīng)母源DNA情況,應(yīng)用受到一定的限制。目前我們常見的耳聾基因包括GJB2及SLC26A4基因均為常染色體隱性遺傳,我們需要獲得父源遺傳信息,因此不能應(yīng)用極體活檢的方式。而針對(duì)母源的常染色體顯性遺傳性耳聾,可以采取此種方式進(jìn)行活檢。

    2.1.2 卵裂球活檢:胚胎培養(yǎng)至第三天時(shí)形成卵裂球,內(nèi)含6~8個(gè)細(xì)胞,此時(shí)經(jīng)透明帶打孔吸取1~2個(gè)細(xì)胞進(jìn)行活檢稱為卵裂球活檢。目前國(guó)內(nèi)外大部分生殖醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)報(bào)道的成功PGD案例選擇此種方法進(jìn)行活檢[19]。卵裂球活檢的方法能夠直接得知胚胎的染色體情況和基因型,同時(shí)獲得父源、母源的基因信息,較極體活檢更為可靠。但于8細(xì)胞期胚胎獲取1~2個(gè)細(xì)胞損失了胚胎的總遺傳物質(zhì),是否對(duì)胚胎的發(fā)育安全產(chǎn)生影響一直以來(lái)是各個(gè)生殖醫(yī)學(xué)中心探索的重點(diǎn)問題。研究顯示,8細(xì)胞期活檢較6細(xì)胞期更為安全;取出1~2個(gè)細(xì)胞后囊胚期細(xì)胞數(shù)量會(huì)有所減少,但不改變內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的比例;經(jīng)活檢后的囊胚形成率在53%~65%。因此主流觀點(diǎn)認(rèn)為卵裂球8細(xì)胞期活檢對(duì)胚胎的體外發(fā)育能力、著床能力和體內(nèi)發(fā)育能力影響不大。從遠(yuǎn)期影響來(lái)看,在小鼠模型上能觀察到胚胎活檢可能對(duì)成年后神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變?cè)斐捎绊?,但由于目前世界最早的PGD成功案例是1990年報(bào)道,至今還未到老齡,還需長(zhǎng)期隨訪觀察。

    2.1.3 養(yǎng)外胚層活檢:隨著胚胎體外培養(yǎng)的技術(shù)不斷發(fā)展更新,更多的胚胎可以在體外培養(yǎng)成為早期囊胚,使得滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢成為可能。而玻璃化冷凍胚胎技術(shù)的出現(xiàn),大大延長(zhǎng)了囊胚活檢可供診斷時(shí)間,并且在子宮內(nèi)膜容受性最佳的情況下解凍、移植胚胎,最大限度地提高可供嘗試的妊娠次數(shù),同時(shí)顯著增加單胎妊娠和累積妊娠率[20]。囊胚活檢的最大優(yōu)勢(shì)在于能夠獲得4~5個(gè)細(xì)胞用于后續(xù)檢測(cè),同時(shí)不破壞發(fā)育成胎兒的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu),胚胎嵌合率低,獲得更多的細(xì)胞數(shù)量對(duì)于有序檢測(cè)的準(zhǔn)確性有著至關(guān)重要的意義,尤其是對(duì)于單基因疾病的診斷,提高初始模板量,降低等位基因脫扣率對(duì)診斷結(jié)果有直接影響[21]。

    2.2 全基因組擴(kuò)增技術(shù)

    由于單細(xì)胞DNA的含量?jī)H為1pg,所以PGD檢測(cè)得以實(shí)現(xiàn)需要建立在目標(biāo)基因擴(kuò)增的基礎(chǔ)上。PGD出現(xiàn)的早期,胚胎基因型的檢測(cè)依賴于PCR技術(shù)。將細(xì)胞裂解后直接進(jìn)行目標(biāo)基因片段和連鎖標(biāo)記的PCR。為了提高擴(kuò)增的特異性,巢式PCR、多重?zé)晒釶CR等技術(shù)被逐漸引入。單細(xì)胞PCR的條件較為苛刻,尤其是多重PCR擴(kuò)增多個(gè)DNA片段時(shí),存在PCR條件摸索困難和擴(kuò)增失敗率高的問題。因此基于PCR的檢測(cè)方法逐漸被單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增所代替。在全基因組擴(kuò)增(whole ge?nome am?plification,WGA)可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞的全基因組進(jìn)行非選擇性的擴(kuò)增,其目的是在沒有序列傾向性的前提下大幅度增加DNA的總量。獲得覆蓋度高、保真性好的全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物是進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)的前提。

    2.2.1 基于PCR的全基因組擴(kuò)增:在2002年以前,WGA常用的方法有IRS-PCR(interspersed repeatse?quence PCR)、LA-PCR(linkeradaptor PCR)、T-PCR(Tagged-PCR)[22,23]、簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR(degen?erate oligonucleotide primed PCR)[24]、擴(kuò)增前引物延伸PCR(primer extension preamplification PCR)等。其中最具代表性方法是后兩者。但是由于擴(kuò)增均衡性差,產(chǎn)物片段較短(小于1kb)以及存在非特異性擴(kuò)增等缺點(diǎn),其應(yīng)用范圍受到了一定的限制。

    2.2.2 多重替代擴(kuò)增(multiple displace mentamplifi?cation,MDA):2002年Dean[25]等人首次報(bào)道了應(yīng)用多重替代擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增。MDA是一種非PCR基礎(chǔ)的恒溫WGA方法。該技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)在于∮29DNA聚合酶的高保真性。在30℃恒溫條件下,隨機(jī)的六堿基引物在多個(gè)位點(diǎn)與環(huán)狀模板DNA結(jié)合退火,依靠∮29DNA聚合酶的作用,多個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)同時(shí)復(fù)制,取代模板的互補(bǔ)鏈,被置換的合成DNA鏈又作為模板來(lái)進(jìn)行下一次擴(kuò)增。MDA的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在2~10kB之間,平均長(zhǎng)度大于10kb。由于MDA方法擴(kuò)增效率高,保真性好,序列長(zhǎng)度能符合下游的多種檢測(cè),被廣泛應(yīng)用于定量PCR、snp基因型分析、染色體圖譜等后續(xù)分析。MDA技術(shù)從發(fā)明至今一直是單基因病PGD流程中的主流擴(kuò)增方法,在各種單基因遺傳病PGD成功案例中均有報(bào)道[26-28]。

    圖1 A.隨機(jī)六堿基引物滾動(dòng)擴(kuò)增環(huán)狀DNA模板(箭頭指向3’端,粗線表示引物);B.第二次擴(kuò)增以第一次擴(kuò)增產(chǎn)物為模板;C.隨著時(shí)間擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸增加;D.瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度大于10kb[25]。Fig.1 A.Rolling amplification of circular DNA template with random six base primers(Arrows point to 3’end,Thick lines represent primers);B.The second amplification was based on the template of the first amplified product;C.The product increased gradually along with the time;D.Agarose gel electrophoresis showed that the length of amplified product was more than 10KB.

    2.2.3 多重退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增(multiple annealing and looping-based amplification cycles,簡(jiǎn)稱 MAL?BAC):著名華人科學(xué)家、美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院士、哈佛大學(xué)終身教授謝曉亮研究小組于2012年發(fā)明了多重退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增[29]不同于以往的非線性或指數(shù)型擴(kuò)增方法,MALBAC技術(shù)利用特殊引物,使得擴(kuò)增子的結(jié)尾互補(bǔ)而成環(huán),從而很大程度上防止了DNA的指數(shù)性擴(kuò)增,從而解決了基因組擴(kuò)增對(duì)微量初始模板過大的擴(kuò)增偏倚,降低并使基因組測(cè)序的模板需求量從μg級(jí)降至單細(xì)胞水平,同時(shí)保持90%以上的基因組擴(kuò)增覆蓋度。MALBAC技術(shù)在輔助生殖胚胎植入前診斷(IVF-PGD)方面具有強(qiáng)大的潛力。應(yīng)用在PGD過程中可以同時(shí)檢測(cè)染色體微缺失、重復(fù)和單基因疾病,對(duì)于篩選健康的卵細(xì)胞,提高

    植入成活率有巨大的意義。這是基于PCR的全基因組擴(kuò)增和MDA方法做不到的[14]。但MALBAC的保真度較MDA差,SNV的假陽(yáng)性率高于MDA,在二代測(cè)序結(jié)果分析時(shí)需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。

    圖2 MALBAC技術(shù)原理[29]Fig.2 TechnicalprincipleofMALBAC[29]

    2.2.4 轉(zhuǎn)座子插入線性擴(kuò)增(Linear amplification via transposon insertion,LIANTI):2017年4月謝曉亮研究小組發(fā)表了關(guān)于轉(zhuǎn)座子插入線性擴(kuò)增的新的全基因組擴(kuò)增方法[30]。該方法通過特殊設(shè)計(jì)的LIANTI轉(zhuǎn)座子將目標(biāo)DNA片段化。LIANTI轉(zhuǎn)座子由一個(gè)19bp雙鏈轉(zhuǎn)座酶結(jié)合位點(diǎn)和單鏈T7環(huán)狀啟動(dòng)子組成。同摩爾量的轉(zhuǎn)座子和Tn5轉(zhuǎn)座酶混合后形成二聚體轉(zhuǎn)座復(fù)合體。單細(xì)胞的基因組DNA被轉(zhuǎn)座復(fù)合體隨機(jī)地片段化。通過T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄DNA片段并線性復(fù)制獲得RNA片段。再通過逆轉(zhuǎn)錄獲得DNA產(chǎn)物。不同于MALBAC的線性擴(kuò)增+指數(shù)擴(kuò)增以及MDA的完全指數(shù)擴(kuò)增,這種方法是完全的線性復(fù)制過程,能夠獲得均一性更強(qiáng)的擴(kuò)增產(chǎn)物。這種優(yōu)勢(shì)使LIANTI方法在CVN檢測(cè)時(shí)更具有優(yōu)勢(shì)。同時(shí)LIANTI擴(kuò)增保真性優(yōu)于MDA,測(cè)序結(jié)果中SNP的假陽(yáng)性率低。目前LIAN?TI尚未應(yīng)用于任何人工生殖先關(guān)領(lǐng)域。需要更多的研究,進(jìn)一步對(duì)其實(shí)用性進(jìn)行檢驗(yàn)。

    圖3 LIANTI技術(shù)原理[30]A.二聚體轉(zhuǎn)座復(fù)合體形成;B.模板DNA隨機(jī)片段化-線性擴(kuò)增-逆轉(zhuǎn)錄Fig.3 Technical principle of LIANTI[30]A.LIANTI transposon consists of a 19-bp double-stranded transposase binding site and a single-stranded T7 promoter loop.Equalmolar amounts of LIANTI trans poson and Tn5 trans posase aremixed and dimerized to form LIANTI transposome;B.Genomic DNA random ly fragmented and tagged by LIANTI transposon-Linear amplification-reverse transcription.

    3 胚胎植入前染色體篩查(preimplantation genome screen,PGS)

    人類自然排卵以及精子細(xì)胞存在一定比例的染色體異常(非整倍體),包括大片段的缺失、重復(fù)等。文獻(xiàn)報(bào)道促超排卵產(chǎn)生的卵細(xì)胞染色體異常率要更高一些,且隨著女性年齡的增長(zhǎng),卵母細(xì)胞染色體異常的概率會(huì)越來(lái)越高。Munne[31]等對(duì)超過6,000個(gè)胚胎進(jìn)行染色體非整倍體篩查分析后發(fā)現(xiàn)35歲以下女性胚胎染色體非整倍體率為56%~70%,41歲以上女性胚胎染色體非整倍體率79%~88%。染色體異常的胚胎大部分植入后不能成活,少部分可以造成嚴(yán)重的出生缺陷,如唐氏兒等。在診斷單基因遺傳病的同時(shí)對(duì)染色體異常進(jìn)行診斷有助于提高胚胎植入成活率,同時(shí)預(yù)防嚴(yán)重出生缺陷。

    熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridiza?tion,FISH)是早期進(jìn)行PGS的主要手段,但由于其信號(hào)判讀的主觀性比較強(qiáng)且只能檢測(cè)2~15條染色體,不能全面反映胚胎染色體狀況,目前已經(jīng)逐漸被其他檢測(cè)方法所代替。比較基因組雜交[32-34](Comprehensive chromosomal hybridization,CGH)自2000年后開始廣泛應(yīng)用,其優(yōu)點(diǎn)在于可以一次反應(yīng)檢測(cè)所有的染色體,缺點(diǎn)是不能檢出小片段異常和平衡異位。近年來(lái)二代測(cè)序技術(shù)迅速發(fā)展和成本的降低,為PGS提供了一個(gè)很好的選擇,一些生殖中心開始將二代測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于胚胎細(xì)胞非整倍體的檢測(cè)。Treff等[35]運(yùn)用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)PGD單基因病進(jìn)行診斷,他們推測(cè)應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)可以在進(jìn)行單基因病突變位點(diǎn)診斷的同時(shí)對(duì)染色體非整倍體、平衡異位進(jìn)行診斷。國(guó)內(nèi)外的研究[36-37]一致認(rèn)為,二代測(cè)序的方法更加快捷廉價(jià),且檢測(cè)的靈敏度和特異度高,彌補(bǔ)了其他技術(shù)不能檢測(cè)小片段異常和平衡異位的不足,有很好的應(yīng)用前景。

    4 連鎖分析

    無(wú)論基于PCR還是單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增,在單基因遺傳病的診斷中,等位基因脫扣(Allele dropout,ADO)都不能被完全避免,等位基因脫扣指雜合子的其中一條等位基因擴(kuò)增失敗,會(huì)導(dǎo)致誤診的出現(xiàn)。應(yīng)用目標(biāo)基因連鎖不平衡區(qū)域內(nèi)的DNA標(biāo)記進(jìn)行單倍體分型和連鎖分析能夠間接推測(cè)出胚胎是否攜帶父母的致病突變,從而修正由于等位基因脫扣而產(chǎn)生的診斷錯(cuò)誤。歐洲人類生殖與胚胎協(xié)會(huì)PGD分會(huì)在2005年的PGD實(shí)施指南中建議在PGD檢測(cè)過程中加入多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行污染控制和連鎖分析,避免誤診[38]。

    4.1 短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats,STR)又稱微衛(wèi)星DNA(microsatellite),廣泛存在于人類基因組中,以2~7個(gè)堿基為單位串聯(lián)重復(fù)構(gòu)成DNA序列,每個(gè)單位重復(fù)數(shù)的不同構(gòu)成了STR基因座的多態(tài)性[39]。Dreesen[40]在2002年首次報(bào)道了應(yīng)用STR作為連鎖標(biāo)記對(duì)囊性纖維化進(jìn)行PGD。此后由于STR多態(tài)性好、片段長(zhǎng)度易于PCR擴(kuò)增、可以與單細(xì)胞WGA結(jié)合使用的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于PGD的連鎖分析,在明確胚胎基因型的同時(shí)還能鑒別外源污染。在很長(zhǎng)一段時(shí)間里,STR被作為PGD流程中的首選連鎖標(biāo)記。

    4.2 單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymor?phism,SNP)指DNA序列中的某個(gè)位點(diǎn)由于單核苷酸的變化而引起的多態(tài)性,在群體中的頻率>1%,SNPs在基因組中數(shù)量多,分布廣泛,每個(gè)個(gè)體至少攜帶300萬(wàn)個(gè)SNPs,平均300~1000bp中就有一個(gè)SNP。有學(xué)者推測(cè)基因組中約有1000萬(wàn)個(gè)SNP。同時(shí)每一代中每個(gè)核苷酸變異頻率極低,相對(duì)穩(wěn)定,適合作為遺傳標(biāo)記。與STR相比,SNP的數(shù)量更多,且有利于高通量自動(dòng)化的檢測(cè)和分析。現(xiàn)在逐漸成為連鎖分析及建立單倍體型的常用遺傳學(xué)標(biāo)記。

    綜上所述,我國(guó)目前遺傳性耳聾的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)完善,隨著檢查技術(shù)的不斷完善,確診率得到了很大提高[41]。無(wú)論是耳聾家庭還是育齡正常人群,對(duì)采取干預(yù)手段預(yù)防耳聾出生缺陷都有強(qiáng)烈的需求[42]。與此同時(shí),單基因遺傳病的胚胎植入前診斷方法在過去的30多年發(fā)展迅速,全隨著二代測(cè)序技術(shù)、單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)的不斷發(fā)展,針對(duì)胚胎單細(xì)胞診斷的方法也在不斷進(jìn)步,其準(zhǔn)確性、成功率都有了極大的提高。應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)、單基因遺傳病及染色體篩查同時(shí)進(jìn)行是目前PGD領(lǐng)域的關(guān)注熱點(diǎn)。目前針對(duì)耳聾基因的胚胎植入前診斷尚未規(guī)?;归_,方法也需要進(jìn)一步的改進(jìn)和完善。亟需設(shè)計(jì)可行性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高的遺傳性耳聾PGD方法,建立臨床流程與策略,便于推廣應(yīng)用于臨床,為耳聾家庭提供人性化、更加符合醫(yī)學(xué)倫理的出生缺陷干預(yù)措施,整體提升我國(guó)耳聾預(yù)防的水平。

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