PKC抑制劑對甲醛誘導(dǎo)的內(nèi)臟炎性痛大鼠脊髓ERK1/2磷酸化的影響*

張家君 岳 偉 張燦文 牛敬忠 胡冬梅 袁 慧 楊明峰 張顏波△

（泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1超聲科；2消化科；3神經(jīng)內(nèi)科，泰安271000）

炎癥腸道疾病和癌癥相關(guān)性內(nèi)臟痛是臨床上常見的內(nèi)臟痛，內(nèi)臟炎癥痛機(jī)制和治療是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)、難點(diǎn)。內(nèi)臟痛發(fā)病機(jī)制尚不明確，其研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于軀體痛，嚴(yán)重影響了內(nèi)臟痛病人的治療與預(yù)后。眾多信號分子、受體在內(nèi)臟痛覺特別是痛覺敏感化形成和維持中起重要作用，是目前研究的主要方向[1～5]。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠脊髓內(nèi)PKC及其PKCγ、PKCε亞型參與甲醛內(nèi)臟炎癥痛發(fā)生、發(fā)展過程；Galan等和Sakurai等研究發(fā)現(xiàn)，脊髓和脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)ERK參與內(nèi)臟炎癥痛痛覺敏感化的維持PKC、ERK1/2已經(jīng)作為內(nèi)臟炎癥痛新型藥物治療靶點(diǎn)[6～8]。ERK1/2是否作為PKC的下游信號通路在內(nèi)臟炎癥痛發(fā)病機(jī)制中起重要作用，對內(nèi)臟炎癥痛靶向治療具有重要意義。所以本實(shí)驗(yàn)利用甲醛直腸黏膜下注射內(nèi)臟炎癥痛大鼠模型[6,9～11]，通過蛛網(wǎng)膜下腔注射給予PKC抑制劑H-7，觀察H-7對內(nèi)臟炎癥痛大鼠脊髓ERK1/2磷酸化水平的影響，探討PKC- ERK1/2信號通路在內(nèi)臟炎癥痛發(fā)病機(jī)制中的作用。

方 法

1.試劑與材料

H-7（Sigma公司，美國），甲醛、戊巴比妥鈉（北京西中化工廠），PE-10管（ID:0.28 mm; OD:0.61 mm,Becton Dickinson公司，美國），有機(jī)玻璃行為學(xué)觀察箱（首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物研究室制），大鼠手持直腸窺器（專利號：CN200820173538.2），兔ERK 1/2一抗、兔p-ERK 1/2一抗、actin一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體（美國Santa Cruz公司，美國），ECL反應(yīng)底物（Bio-Rad公司，美國），BCA蛋白分析試劑盒（PIERCE公司，美國），Gel Doc凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國）。

2.實(shí)驗(yàn)動物及分組

選用清潔級雄性SD大鼠（重200～250 g，山東省中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK（魯）2005-0015），實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為5組：正常對照組（N組）；甲醛(formalin, F)直腸致炎組（F組）；甲醛直腸致炎和脊髓蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)插管(intrathecal, IT)組（IT組）；甲醛直腸致炎、脊髓蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)插管并注射生理鹽水組（NaCl組）；甲醛直腸致炎、脊髓蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)插管并注射H-7組（ H-7組）；每組大鼠24只，共120只。

3.脊髓蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)插管及給藥

根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室既往成熟方法[6,9～11]，用PE-10管插入大鼠脊髓蛛網(wǎng)膜下腔，插入長度7.5 cm，外端留有4.5 cm左右。本實(shí)驗(yàn)中NaCl和H-7組，分別在甲醛直腸致炎前30 min經(jīng)PE-10插管注射20 μl 0.9% NaCl、20 μl H-7 溶液（含 5 μg H-7），然后注入10 μl 0.9% NaCl沖洗插管，保證注射藥品全部進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔。

4.內(nèi)臟炎癥痛模型復(fù)制

根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室既往成熟方法[6,9～11]，大鼠乙醚持續(xù)麻醉，經(jīng)肛門插入自制的直腸窺器（專利號：CN200820173538.2），距肛門約35 mm處，用針長8 cm的1 ml注射器于直腸黏膜下注射100 μl 5%的甲醛。

5.內(nèi)臟痛行為學(xué)觀察

甲醛致痛后，大鼠共有4種疼痛行為：①舔腹（L）；②伸腰（B）；③側(cè)扭（C）；④全身收縮（W）。疼痛評分公式計算：S = 1L + 2B + 3C + 4W。L，B，C和W代表在一段時間內(nèi)相應(yīng)行為的次數(shù)。4組大鼠，每組8只，每15 min進(jìn)行一次疼痛計分，連續(xù)記錄大鼠的行為120 min[6,9～11]。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的大鼠在120 min觀察后進(jìn)行ERK1/2磷酸化水平檢測。

6. ERK1/2磷酸化水平檢測

在甲醛造模后30 min、60 min和120 min取出L6-S1節(jié)段脊髓，根據(jù)我們既往的方法進(jìn)行ERK1/2磷酸化檢測[9]。磷酸化ERK1/2 的蛋白檢測后，同一張NC膜，再與總ERK1/2抗體進(jìn)行第二次Western blot 雜交反應(yīng)，獲得ERK1/2總蛋白印跡結(jié)果。Gel Doc凝膠成像分析系統(tǒng)同時進(jìn)行actin水平檢測，ERK1/2相對磷酸化水平以p-ERK1/2與ERK1/2的比值表示。

7.統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

1. PKC抑制劑H-7減輕內(nèi)臟炎癥痛疼痛反應(yīng)

4個實(shí)驗(yàn)組大鼠在注射甲醛后30 min均達(dá)到疼痛評分的最大值，從注射甲醛后45 min至120 min內(nèi)，疼痛評分逐漸降低。前60 min內(nèi)行為表現(xiàn)主要以W、C、B反應(yīng)為主；而在后60 min內(nèi)主要以L反應(yīng)為主。F、IT、NaCl組和H-7組大鼠在注射甲醛后30 min均達(dá)到疼痛評分的最大值，從注射甲醛后45 min至120 min內(nèi)，疼痛評分逐漸降低，120 min時疼痛評分正常。H-7組在前90 min內(nèi)疼痛分?jǐn)?shù)顯著低于 F組 (P＜ 0.05或P＜ 0.01)，F(xiàn)分別與IT、NaCl組相比未見顯著性差異(P＞ 0.05，見表1)。

2.內(nèi)臟炎癥痛大鼠脊髓ERK1/2磷酸化水平增加

與N組相比，F(xiàn)組甲醛直腸黏膜注射后脊髓ERK1/2磷酸化水平增加，30 min時達(dá)最高水平，60 min時仍高于對照組，有顯著性差異(P＜ 0.05或P＜ 0.01)；60 min后磷酸化水平逐漸下降，120 min時磷酸化水平與N組相比，無顯著性差異(P＞ 0.05)。IT組、NaCl組與F組相比，無顯著性差異(P＞ 0.05，見圖1～4)。

3. PKC抑制劑H-7降低內(nèi)臟炎癥痛大鼠脊髓ERK1/2磷酸化水平

與N相比，H-7組甲醛直腸黏膜注射后脊髓ERK1/2磷酸化水平也增加，30 min時達(dá)最高水平，60 min時仍高于對照組，有顯著性差異(P＜ 0.05或P＜ 0.01)；60 min后逐漸下降，120 min時下降至正常水平(P＞ 0.05)。在甲醛注射后60 min內(nèi)，H-7組與F組相比，ERK1/2磷酸化水平明顯下降，有顯著性差異 (P＜ 0.05或P＜ 0.01)，120 min時無顯著性差異(P＞ 0.05，見圖1～4)。

討 論

在臨床中由炎癥而導(dǎo)致的內(nèi)臟炎癥痛非常常見，而且炎癥也是導(dǎo)致內(nèi)臟器官痛敏的最常見原因，常伴隨一系列的征候群，如腸易激綜合癥(irritable bowel syndrome, IBS)等。內(nèi)臟痛與軀體痛發(fā)病機(jī)制不同，所以內(nèi)臟痛與軀體痛對鎮(zhèn)痛藥物的療效也不相同。與軀體痛相比，在炎性腸道疾病疼痛的治療中，應(yīng)用阿片類藥物會導(dǎo)致較高的副作用和死亡率；同樣應(yīng)用非甾體抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)鎮(zhèn)痛效果也不理想[4]。所以研發(fā)新型、有效的內(nèi)臟炎癥痛鎮(zhèn)痛藥物迫在眉睫。信號通路將是內(nèi)臟炎癥痛新型鎮(zhèn)痛藥物的研發(fā)方向，針對多個信號通路聯(lián)合藥物鎮(zhèn)痛治療優(yōu)于單一藥物，聯(lián)合治療是內(nèi)臟痛治療原則[4,12]。根據(jù)既往我們研究基礎(chǔ)和目前國內(nèi)外進(jìn)展，所以本研究選擇PKC、ERK1/2兩條信號通路進(jìn)行研究，并且將PKC、ERK1/2作為一條上下游信號通路進(jìn)行研究，是本研究的一個創(chuàng)新點(diǎn)。

表1 注射甲醛后各組不同時間段的疼痛分?jǐn)?shù)(min,±SD)Table 1 Pain scores of different time periods after formalin injection (min,±SD)

表1 注射甲醛后各組不同時間段的疼痛分?jǐn)?shù)(min,±SD)Table 1 Pain scores of different time periods after formalin injection (min,±SD)

F: formalin group; IT: intrathecal group; NaCl: NaCl group; H-7: H-7 group. *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with F group.

Group Pain Score 15 30 45 60 75 90 105 120 F 60.32±6.47 88.47±7.89 47.56±4.56 25.98±3.04 14.78±2.32 10.35±1.79 3.41±1.65 3.22±0.97 IT 64.78±7.06 89.45±7.65 48.78±5.01 22.47±3.65 13.41±2.74 11.01±2.01 3.73±1.78 3.34±0.87 NaCl 62.62±6.14 86.25±8.03 49.45±4.54 24.45±3.17 14.14±2.98 9.88±2.74 4.87±1.58 3.25±0.96 H-7 44.52±5.18** 65.78±6.65** 35.74±4.65** 16.42±3.89* 8.57±2.69* 5.36±1.87* 3.58±1.54 3.52±1.12

圖1 注射甲醛后30 min ERK1/2磷酸化水平Fig.1 Phosphorylation of ERK1/2 at 30 minutes after formalin injection

圖2 注射甲醛后60 min ERK1/2磷酸化水平Fig.2 Phosphorylation of ERK1/2 at 60 minutes after formalin injection

圖3 ERK1磷酸化水平變化Fig.3 Changes of phosphorylation level of ERK1 N: Normal control group; F: Formalin group; IT:Intrathecal group; NaCl: NaCl group; H-7: H-7 group.

圖4 ERK2磷酸化水平變化Fig.4 Changes of phosphorylation level of ERK2 N: Normal control group; F: Formalin group; IT:Intrathecal group; NaCl: NaCl group; H-7: H-7 group.

在本實(shí)驗(yàn)中，甲醛注射后30 min達(dá)到疼痛的高峰，注射90 min后，甲醛組和對照組相比，沒有明顯差異，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和Miampamba等人的結(jié)果一致[13]，說明甲醛直腸黏膜下注射誘導(dǎo)內(nèi)臟炎癥痛模型，是國際上公認(rèn)的、可靠的內(nèi)臟痛模型，是內(nèi)臟炎癥痛的研究手段。PKC抑制劑H-7在甲醛注射后90 min內(nèi)，能明顯抑制內(nèi)臟炎癥痛行為反應(yīng)，說明PKC抑制劑可作為內(nèi)臟炎癥痛的治療藥物。在甲醛注射30 min時ERK1/2磷酸化水平達(dá)最高水平，60 min仍高于對照組，說明ERK1/2參與內(nèi)臟炎癥痛的形成和維持過程；PKC抑制劑H-7在甲醛注射后60 min內(nèi)能明顯抑制ERK1/2磷酸化水平，說明ERK1/2可能作為PKC的下游信號通路參與了內(nèi)臟炎癥痛的發(fā)病機(jī)制。PKC-ERK1/2作為一條信號通路參與信號傳導(dǎo)，這與目前國際上應(yīng)用不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷贸龅慕Y(jié)果一致[14～18]。El-Zein等研究發(fā)現(xiàn)，瘦素通過PKC/ERK信號通路抑制腸道葡萄糖的吸收[17]；Sun[16]等也研究證實(shí)，Egr-1通過PKC/ERK信號通路介導(dǎo)慢性缺氧引起的腎間質(zhì)纖維變性。

綜上所述，PKC抑制劑H-7能降低內(nèi)臟炎癥痛疼痛評分和抑制脊髓ERK1/2磷酸化水平，ERK1/2是PKC的下游信號通路在內(nèi)臟炎癥痛發(fā)病機(jī)制中起重要作用，對內(nèi)臟炎癥痛靶向治療具有重要意義。

[1]Gebhart GF, Bielefeldt K. Physiology of Visceral Pain.Compr Physiol, 2016, 6:1609 ～ 1633.

[2]Elsenbruch S, Enck P. Psychobiological mechanisms in the pathophysiology of chronic visceral pain. Schmerz,2016, 30:407 ～ 411.

[3]Johnson AC, Greenwood-Van Meerveld B. The Pharmacology of Visceral Pain. Adv Pharmacol, 2016,75:273 ～ 301.

[4]Davis MP. Drug management of visceral pain:concepts from basic research. Pain Res Treat, 2012,2012:265605.

[5]Yamanaka H, Noguchi K. Pathophysiology of neuropathic pain: molecular mechanisms underlying central sensitization in the dorsal horn in neuropathic pain. Brain Nerve, 2012, 64:1255 ～ 1265.

[6]Zhang Y, Gong K, Zhou W,et al. Involvement of subtypes γ and ε of protein kinase C in colon pain induced by formalin injection. Neurosignals, 2011,19:142 ～ 150.

[7]Galan A, Cervero F, Laird JM. Extracellular signalingregulated kinase-1 and -2 (ERK 1/2) mediate referred hyperalgesia in a murine model of visceral pain. Brain Res Mol Brain Res, 2003, 116:126 ～ 134.

[8]Sakurai J, Obata K, Ozaki N,et al. Activation of extracellular signal-regulated protein kinase in sensory neurons after noxious gastric distention and its involvement in acute visceral pain in rats.astroenterology, 2008, 134:1094 ～ 1103.

[9]Zhang YB, Guo ZD, Li MY,et al. Gabapentin Effects on PKC-ERK1/2 Signaling in the Spinal Cord of Rats with Formalin-Induced Visceral Inflammatory Pain.PLoS One, 2015, 10: e0141142.

[10]張顏波,牛敬忠,周衛(wèi)華,等. cPKCs在大鼠內(nèi)臟炎性痛形成中的作用.中華麻醉學(xué)雜志, 2008,28:249 ～ 252.

[11]張顏波,高翠英,李菁錦,等.大鼠福爾馬林內(nèi)臟炎癥痛過程中脊髓PKC、PKCε膜轉(zhuǎn)位的變化.中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 11(2): 91 ～ 95.

[12]Aziz Q, Botha C, Willert R. Pharmacology of visceral pain: central factors. Dig Dis, 2009, 27 (Suppl 1):31 ～ 41.

[13]Miampamba M, Chéry-Croze S, Gorry F,et al.In flammation of the colonic wall induced by formalin as a model of acute visceral pain. Pain, 1994, 57(3):327 ～334.

[14]Muscella A, Vetrugno C, Calabriso N,et al.[Pt(O,O'-acac)(γ-acac)(DMS)]Alters SH-SY5Y Cell Migration and Invasion by the Inhibition of Na+/H+Exchanger Isoform 1 Occurring through a PKC-ε/ERK/mTOR Pathway. PLoS One, 2014, 9(11): e112186.

[15]Jia K, Sun D, Ling S,et al. Activated δ-opioid receptors inhibit hydrogen peroxide-induced apoptosis in liver cancer cells through the PKC/ERK signaling pathway.Mol Med Rep, 2014, 10(2):839 ～ 847.

[16]Sun S, Ning X, Zhai Y,et al. Egr-1 mediates chronic hypoxia-induced renal interstitial fi brosis via the PKC/ERK pathway. Am J Nephrol, 2014, 39(5):436 ～448.

[17]El-Zein O, Kreydiyyeh SI. Leptin inhibits glucose intestinal absorption via PKC, p38MAPK, PI3K and MEK/ERK. PLoS One, 2013, 8(12): e83360.

[18]Zhou JR, Zhang LD, Wei HF,et al. Neuropeptide Y induces secretion of high-mobility group box 1 protein in mouse macrophage via PKC/ERK dependent pathway.J Neuroimmunol, 2013, 260(1-2):55 ～ 59.