豚鼠近視模型中屈光度眼軸長度及鞏膜Ⅰ型膠原纖維變化的研究

在全球屈光性疾病中，近視的發(fā)病率居首，且常見于學(xué)齡兒童及青少年。在亞洲及東南亞地區(qū)的城市中，青少年受近視的困擾最甚。這不僅給青少年帶來苦惱，也增加了全球負(fù)擔(dān)[1-2]。我國近視發(fā)病率已位居世界第二，僅次于日本，占世界近視總?cè)藬?shù)的33%[3-4]，但目前近視的發(fā)病機制仍不是十分清楚。因此，對近視發(fā)病機制的研究是亟待解決的醫(yī)學(xué)難題。

以往的研究[5]認(rèn)為，新生動物或人眼正視化進(jìn)程有賴于眼的各部分相互協(xié)調(diào)和精確調(diào)控，早期適宜的視覺經(jīng)驗對眼球的正常生長與正視化進(jìn)程非常重要。在動物發(fā)育早期，如剝奪其形覺視覺以干擾正視化視覺依賴性反饋機制，將導(dǎo)致眼軸過度延長，產(chǎn)生近視，即形覺剝奪性近視[6]。研究[7]顯示，鞏膜重塑在近視的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中起到至關(guān)重要的作用。鞏膜中含量最多的是膠原纖維，占鞏膜凈重的90%，Ⅰ型膠原纖維在鞏膜中占75%以上[8]。早期研究[9]表明，形覺剝奪性近視可導(dǎo)致玻璃體腔擴大，鞏膜組織結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化,特別是后極部。本研究通過面罩遮蓋豚鼠單眼制作形覺剝奪性近視(form deprivation myopia，F(xiàn)DM)模型，對實驗組和兩組對照組進(jìn)行屈光度和眼軸長度的測量，并觀察后極部鞏膜中Ⅰ型膠原纖維的變化，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1倫理學(xué)聲明實驗程序依照《實驗動物管理與使用指南》[10]。本研究方案經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會審查批準(zhǔn)(LLSC20150115)。

1.2動物形覺剝奪模型的建立和分組選用出生7 d，體質(zhì)量為100～140 g的健康新生有色豚鼠75只，采用帶狀光檢影法排除有先天性近視及其他全身疾病的豚鼠，在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院實驗動物中心室內(nèi)12 h自然照明和12 h黑暗環(huán)境下(以每天上午8時為起始時間)，并給予水、富含維生素的豚鼠飼料及新鮮蔬菜等飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度為22℃。將75只豚鼠采用完全隨機分組方法分為空白對照組(共25只，分為5組，每組5只)和FDM模型組(50只，分為5組，每組10只)。豚鼠(誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后2、4、6周及誘導(dǎo)4周去誘導(dǎo)1周)FDM組佩戴頭套，具體方法：采用6號半透明乳膠氣球套住豚鼠頭部，將對照眼、鼻唇部及耳部氣球剪去并暴露，左眼氣球保留遮蓋，用訂書機將氣球頭套于頸部對折固定，防止眼罩滑落及旋轉(zhuǎn)。遮蓋眼為形覺剝奪組，對側(cè)未遮蓋眼為自身對照組，空白對照組不做任何處理。

1.3觀察指標(biāo)及方法

1.3.1屈光度及眼軸長度將豚鼠標(biāo)記、編號，分別于誘導(dǎo)前0 周、誘導(dǎo)后2周、4周、6周及誘導(dǎo)4周去誘導(dǎo)1周(4/-1周)，托吡卡胺充分?jǐn)U瞳，在暗室內(nèi)采用帶狀光檢影(六六,中國)驗光，取其平均值，并精確到0.01 D；結(jié)膜囊滴用0.5%鹽酸丙美卡因表面麻醉藥物后，A超(TOMEY AL-100，日本)測定雙眼眼軸長度(取角膜頂點到眼球后極部玻璃體視網(wǎng)膜界面的距離)，以手動模式連續(xù)測量3次，取其平均值，精確到0.01 mm，由2名熟練的技師采用雙盲法分別測量。

1.3.2后極部鞏膜Ⅰ型膠原的免疫組化檢測所有豚鼠均使用過量的1%戊巴比妥鈉處死，摘除眼球放在提前備好的冰塊上，去除眼前節(jié)。在以視神經(jīng)為中心，直徑為6 mm的范圍內(nèi)，切除鞏膜組織，并剔除視神經(jīng)部分。然后將鞏膜組織放入40%二聚甲醛溶液中，4℃保存。組織脫水, 石蠟包埋、切片作HE染色及免疫組化染色。一抗：Ⅰ型膠原，稀釋度1∶150。陰性對照以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)替代一抗,其余步驟相同。結(jié)果判定：Ⅰ型膠原在胞質(zhì)中表達(dá)，呈棕黃色。隨機選取后極部鞏膜各10個部位進(jìn)行圖像掃描，遵循雙盲原則測量Ⅰ型膠原的相對蛋白表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1眼球屈光度出生后1周左右，豚鼠雙眼呈遠(yuǎn)視狀態(tài)，3組中豚鼠的屈光度兩兩相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。隨著遮蓋時間的不斷延長，F(xiàn)DM組的屈光狀態(tài)逐漸由遠(yuǎn)視變成近視?？瞻讓φ战M和自身對照組遠(yuǎn)視度數(shù)略有減低，兩組間在每個時間點的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。除實驗前，F(xiàn)DM組眼屈光狀態(tài)和空白對照組及自身對照組各時間點的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、2 。

表1　FDM組與空白對照組在造模前后不同時間點屈光度比較±s，D)

注：F分組是FDM組與空白對照組間總體的比較；F時間是不同時間點與各自時間點空白對照組總體比較，與各自時間點空白對照組比較，aP<0.05(兩因素方差分析，LSD-t檢驗)

表2　自身對照組與FDM組不同時間點屈光度值比較±s，D)

2.2眼軸長度遮蓋前，空白對照組、自身對照組及FDM組的豚鼠眼球的眼軸長度兩兩相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。隨著遮蓋時間的不斷延長，F(xiàn)DM組的眼軸長度逐漸延長?？瞻捉M對照組和自身對照組眼軸長度略有延長，各時間點兩組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。FDM組眼屈光狀態(tài)和自身對照組及空白對照組比較，除遮蓋前，其余時間點的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3、4。

表3　空白對照組與FDM組不同時間點眼軸長度比較±s，mm)

注：F分組是FDM組與空白對照組間總體的比較；F時間是不同時間點與各自時間點空白對照組總體比較，與各自時間點空白對照組比較，bP<0.05(兩因素方差分析，LSD-t檢驗)

表4　自身對照組與FDM組不同時間點眼軸長度比較±s，mm)

注：FDM為形覺剝奪性近視

2.3FDM組屈光度與眼軸長度之間的相關(guān)性分析FDM組中，豚鼠眼球的屈光度發(fā)生了明顯的變化，隨著遮蓋時間的不斷延長，由遮蓋前的遠(yuǎn)視眼逐漸演變?yōu)榻曆?，且屈度?shù)不斷增加，同時，眼軸長度也不斷增長，兩者之間存在顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.997，P<0.05)。

2.4鞏膜中Ⅰ型膠原纖維的變化在遮蓋前0周時，F(xiàn)DM組與兩組對照組的Ⅰ型膠原纖維無明顯差別；FDM組遮蓋2周、4周、4/-1周及6周的亞組中，Ⅰ型膠原纖維隨著遮蓋時間的延長，表達(dá)量逐漸下降；而空白對照組及自身對照組的Ⅰ型膠原纖維卻無明顯變化。見表5、6，圖1。

表5　空白對照組與FDM組Ⅰ型膠原蛋白的相對表達(dá)量比較±s，ug/L)

注：F分組是FDM組與空白對照組間總體的比較；F時間是不同時間點與各自時間點空白對照組總體比較，與各自時間點空白對照組比較，cP<0.05(兩因素方差分析，LSD-t檢驗)；FDM為形覺剝奪性近視

表6　自身對照組與FDM組不同時間點Ⅰ型膠原蛋白相對表達(dá)量比較±s，ug/L)

注：FDM為形覺剝奪性近視

圖1　豚鼠后極部鞏膜型膠原纖維的變化(×400)

注：A為FDM組未遮蓋；B為FDM組遮蓋2周；C為FDM組遮蓋4周；D為FDM組遮蓋4周去遮蓋1周；E為FDM組遮蓋6周；F為空白對照組未遮蓋；G為空白對照組遮蓋2周；H為空白對照組遮蓋4周；I為空白對照組遮蓋4周去遮蓋1周；J為空白對照組遮蓋6周；K為自身對照組未遮蓋；L為自身對照組遮蓋2周；M為自身對照組遮蓋4周；N為自身對照組遮蓋4周去遮蓋1周；O為自身對照組遮蓋6周

3　討論

本實驗是在利用半透明面罩來遮蓋豚鼠，從而使視網(wǎng)膜模糊成像，結(jié)果顯示，豚鼠形覺剝奪性近視的形成過程中伴隨著眼球近視度數(shù)逐漸增加和眼軸長度不斷增長，表明成功構(gòu)建了形覺剝奪性近視動物模型。本實驗采用12 h/12 h晝夜交替遮蓋，從而避免在黑暗條件下無法順利形成近視。研究結(jié)果與楊蓓等[11]的研究相符合，他們也是利用相似手段，從而構(gòu)建豚鼠近視模型，觀察短期豚鼠形覺剝奪性近視的屈光狀態(tài)、眼軸及后極部鞏膜的改變。實驗顯示，隨著時間的延長，實驗組豚鼠逐漸變?yōu)榻?，同時，眼軸長度也不斷延長。在實驗前(0周)時，F(xiàn)DM組與空白對照組及自身對照組的屈光度及眼軸長度無明顯區(qū)別，差異無統(tǒng)計學(xué)意義,隨著遮蓋時間的延長，F(xiàn)DM組與兩組對照組間以后每個時間點所測屈光度及眼軸長度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但空白對照組與自身對照組在每個時間點的屈光度及眼軸長度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。FDM組除遮蓋4周去遮蓋1周與遮蓋4周兩亞組間的屈光度及眼軸長度差異無統(tǒng)計學(xué)意義,其余各亞組間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明，形覺剝奪法可成功構(gòu)建近視動物模型，另外，從遮蓋4周去遮蓋1周的豚鼠亞組的實驗結(jié)果可知，一旦形覺剝奪的誘導(dǎo)去除，豚鼠的近視進(jìn)展便會基本停止。FDM組各個亞組的屈光度及眼軸長度間呈高度的負(fù)相關(guān)，說明在一定程度內(nèi)，隨著近視度數(shù)進(jìn)展，眼軸長度逐漸延長[10]。

Rada等[12]認(rèn)為，大多數(shù)近視是通過延長眼球的玻璃體腔產(chǎn)生的。高度近視的特征在于鞏膜變薄和后鞏膜的局部擴張。鞏膜作為眼睛的外涂層十分致密，由纖維狀的粘彈性結(jié)締組織及不規(guī)則排列的膠原纖維薄片組成，其間填充蛋白聚糖和非膠原糖蛋白。鞏膜成纖維細(xì)胞位于鞏膜片層之間，并且負(fù)責(zé)合成它們所在的細(xì)胞外基質(zhì)。鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)重塑是近視發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。在實驗的兩組對照組的后極部鞏膜中可以觀察到，Ⅰ型膠原纖維無明顯變化，但在FDM組各亞組豚鼠的后極部鞏膜中，Ⅰ型膠原纖維的表達(dá)量在不斷降低，這與Harper等[13]的研究相符合。從而可以進(jìn)一步說明，在豚鼠出生早期進(jìn)行形覺剝奪，可以很快使鞏膜出現(xiàn)病理改變，且這種改變會隨著遮蓋時間的延長表現(xiàn)的越來越明顯。Jonas等[14]的研究認(rèn)為，在近視進(jìn)展中，形態(tài)學(xué)的改變先于生物學(xué), 在近視早期，鞏膜通過代償調(diào)節(jié)，當(dāng)調(diào)節(jié)失代償后，才會出現(xiàn)生物學(xué)改變。本實驗的結(jié)果并未完全支持這種結(jié)論，這可能是本研究分組的時間點設(shè)置較長導(dǎo)致。

綜上所述，使用形覺剝奪法順利成功構(gòu)造了近視動物模型，對于出生不久的豚鼠，在遮蓋不久后便出現(xiàn)屈光度及眼軸長度的變化，在一定程度內(nèi)，隨著遮蓋時間的不斷延長，這種變化會越來越明顯，且兩者的變化呈高度的負(fù)相關(guān)性。本研究只是對動物近視模型中屈光度、眼軸長度及鞏膜Ⅰ型膠原纖維變化進(jìn)行初步研究，對于其確切機制還有待進(jìn)一步的深入研究。

[1]GUO L,YANG J,MAI J,et al.Prevalence and associated factors of myopia among primary and middle school-aged students: a school-based study in Guangzhou[J]. Eye (Lond),2016,30(6):796-804.

[2]FOSTER P J, JIANG Y. Epidemiology of myopia[J]. Eye (Lond),2014,28(2):202-208.

[3]JIANG B,WU Z Y,ZHU Z C,et al.Expression and role of specificity protein 1 in the sclera remodeling of experimental myopia in guinea pigs[J].Int J Ophthalmol,2017,10(4):550-554.

[4]唐磊,廖榮豐.有晶狀體眼后房型人工晶體植入矯正高度近視合并散光研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)學(xué),2016,37(9):1185-1188.

[5]ROBBINS R A,MAURER D,HATRY A,et al.Effects of normal and abnormal visual experience on the development of opposing aftereffects for upright and inverted faces[J].Dev Sci,2012,15(2):194-203.

[6]MISHRA M,RENTSCH M,KNUST E.Crumbs regulates polarity and prevents light-induced degeneration of the simple eyes of Drosophila,the ocelli[J].Eur J Cell Biol,2012,91(9):706-716.

[7]朱子誠,吳章友,溫躍春,等.AG490抑制STAT3信號通路活性對豚鼠形覺剝奪性近視鞏膜重塑的調(diào)控[J].中華實驗眼科雜志,2015,33(6):493-499.

[8]GENTLE A,LIU Y,MARTIN J E,et al.Collagen gene expression and the altered accumulation of scleral collagen during the development of high myopia[J].J Biol Chem,2003,278(19):16587-16594.

[9]MCBRIEN N A, CORNELL L M, GENTLE A. Structural and ultrastructural changes to the sclera in a mammalian model of high myopia.[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2001, 42(10):2179.

[10]姜波,吳章友,朱子誠,等.豚鼠進(jìn)展性近視眼鞏膜中Smad3和Ⅰ型膠原的動態(tài)表達(dá)變化[J].中華實驗眼科雜志,2017,35(6):491-497.

[11]楊蓓,劉桂香.豚鼠短期形覺剝奪性近視屈光度眼軸及鞏膜改變[J].國際眼科雜志,2009,9(10):1871-1875.

[12]RADA J A,SHELTON S,NORTON T T.The sclera and myopia[J].Exp Eye Res,2006,82(2):185-200.

[13]HARPER A R,SUMMERS J A.The Dynamic Sclera: Extracellular Matrix Remodeling in Normal Ocular Growth and Myopia Development[J].Exp Eye Res,2015, 133:100-111.

[14]JONAS J B,XU L.Histological changes of high axial myopia[J].Eye,2014, 28(2):113-117.