豬輪狀病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的建立

陳如敬, 章秋月, 陳秋勇, 修金生, 吳學(xué)敏, 嚴(yán)　山, 周倫江

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013；2.南平市星星畜牧有限公司，福建 南平 363000；3.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

豬輪狀病毒(porcine rotavirus, PoRV)屬呼腸孤病毒科(Reoviridae)輪狀病毒屬(Rotavirus)，該病原是導(dǎo)致仔豬或其他幼齡動(dòng)物(包括嬰幼兒)腹瀉的主要病原之一.不同日齡仔豬(10～60日齡)均易感，表現(xiàn)為厭食、腹瀉、嘔吐和水樣糞便，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致動(dòng)物因脫水死亡[1-2].

PoRV為不連續(xù)的雙鏈RNA(dsRNA)、二十面體對(duì)稱(chēng)的無(wú)囊膜結(jié)構(gòu)病毒，其直徑約為70 nm.PoRV中央為致密的六角形核芯，直徑約為40 nm.檢測(cè)PoRV感染的常見(jiàn)方法有RT-PCR方法[3]、SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法[4]和基于單克隆抗體的免疫熒光技術(shù)[5]等.但RT-PCR檢測(cè)方法存在敏感性不高的問(wèn)題；SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法可能存在非特異性擴(kuò)增及受引物二聚體等的影響而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果[6]；而基于單克隆抗體的免疫熒光技術(shù)由于單克隆抗體僅識(shí)別單一抗原表位，可能對(duì)部分PoRV毒株檢測(cè)出假陰性結(jié)果.

PoRV主要外層衣殼為VP4和VP7，中間為VP6，內(nèi)層為VP2[7-9].結(jié)構(gòu)蛋白VP6是PoRV基因組的核心蛋白，其占病毒蛋白的50%左右.VP6不像結(jié)構(gòu)蛋白VP4和VP7那樣具有較強(qiáng)的抗原性和免疫性，且研究證實(shí)VP6蛋白沒(méi)有中和輪狀病毒的血清學(xué)抗體活性[10-12].但VP6基因是參與介導(dǎo)輪狀病毒粘膜免疫學(xué)反應(yīng)的特異性抗原[13-14]，具有較強(qiáng)的診斷學(xué)意義和疫苗開(kāi)發(fā)價(jià)值[15-17].本試驗(yàn)根據(jù)VP6基因序列特征，建立檢測(cè)PoRV TaqMan 探針的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，該方法較SYBR GreenⅠ染料法特異性強(qiáng)，其熒光信號(hào)只來(lái)源于目標(biāo)序列，不受非特異性擴(kuò)增及引物二聚體的影響，為開(kāi)展PoRV的流行病學(xué)調(diào)查及感染水平的定量分析提供新的檢測(cè)手段.

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1毒株P(guān)oRV、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、豬瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)和豬流行性乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離、鑒定并保存.

1.1.2主要儀器與試劑Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)、One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Perfect Real Time)、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus)、pMD18-T和DL2000 Marker均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒和克隆感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，其他試劑均為商業(yè)公司購(gòu)買(mǎi)的分析純.

1.2　陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備

采用病毒提取試劑盒MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0，按照說(shuō)明書(shū)操作提取PoRV(RV-FJ2014-01株)的RNA，用針對(duì)PoRVVP6基因的特異性引物(VP6F：5′-TCTTCGACATGGAGGTTCTGTA-3′，VP6R1289：5′-GAAATCACACCCTTACTTGTAGA-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約1 289 bp)獲得VP6基因全長(zhǎng).RT-PCR擴(kuò)增體系為50 μL體系，配置如下：2 μL PrimeScript One Step Enzyme Mix、25 μL 2×One Step Buffer(Dye Plus)、上/下游引物(VP6F和VP6R1289，濃度為20 μmol·L-1)各1 μL、2 μL提取RNA，補(bǔ)充滅菌去離子水至終體積為50 μL.RT-PCR反應(yīng)條件為：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min； 94 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)行PCR循環(huán)(共循環(huán)35次)，條件為：94 ℃變性50 s、53 ℃退火30 s、72 ℃延伸80 s；PCR循環(huán)結(jié)束后，于72 ℃再延伸10 min.對(duì)目的片段使用膠回收試劑盒切膠回收后克隆到T載體上，提取相應(yīng)的質(zhì)粒，經(jīng)序列測(cè)定驗(yàn)證符合試驗(yàn)預(yù)期后的質(zhì)粒作為本試驗(yàn)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒(記為PoRV-VP6).將獲得的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品用超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行定量，計(jì)算拷貝數(shù)并進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋?zhuān)糜?20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.3　TaqMan實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR方法的建立

1.3.1熒光定量引物的設(shè)計(jì)參考GenBank中登陸的PoRVVP6基因特征，利用DNAStar軟件進(jìn)行分析比較，明確VP6基因保守區(qū)，利用Oligo 7軟件，設(shè)計(jì)特異性的引物和探針.采用BLAST工具進(jìn)行檢索，初步驗(yàn)證其特異性，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成.pF1：5′-GACCACCAAATATGACAC-3′；pR1：5′-GTCCTACTGGTATAGCATA-3′.探針序列pTaqMan-probe：5′-CCGCAAGCACCACCATTCAT-3′，其中， 5′端以FAM標(biāo)記，3′端以Eclipse標(biāo)記.

1.3.2反應(yīng)條件的優(yōu)化采用Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)試劑盒說(shuō)明書(shū)推薦的條件，配置TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的反應(yīng)液.以出現(xiàn)最高的熒光值(△Rn)、最小的循環(huán)閾值(Ct)為指標(biāo)，對(duì)退火溫度(56～64 ℃)、引物終濃度(0.1～1 μmol·L-1)和探針終濃度(0.05～0.5 μmol·L-1)進(jìn)行條件優(yōu)化.

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立以陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)10倍系列稀釋(10-2～10-8)的質(zhì)粒為模板，以“1.3.2”的優(yōu)化后條件進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn).以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(PoRV-VP6質(zhì)粒)拷貝數(shù)的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct為縱坐標(biāo)，推導(dǎo)計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)線(xiàn)性回歸方程，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).

1.3.4特異性檢測(cè)用“1.3.2”的優(yōu)化后條件分別檢測(cè)PoRV、PEDV、TGEV、CSFV和JEV的RNA，評(píng)價(jià)所建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的特異性.

1.3.5可重復(fù)性與再現(xiàn)性評(píng)估將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(PoRV-VP6)設(shè)3個(gè)重復(fù)，用“1.3.2”的優(yōu)化后條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算組內(nèi)變異系數(shù)；將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒置-20 ℃冰箱中保存.每隔兩周重檢一次，連續(xù)檢測(cè)3次，計(jì)算組間變異系數(shù).

1.4　臨床樣品的檢測(cè)

對(duì)福建地區(qū)收集的79份仔豬腹瀉病料按照常規(guī)方法處理后，利用病毒提取試劑盒提取其相應(yīng)的RNA后，分別用本試驗(yàn)建立的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR方法和文獻(xiàn)報(bào)道的RT-PCR方法[3]進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)兩種方法之間的符合率.

2　結(jié)果與分析

2.1　優(yōu)化后的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)條件

優(yōu)化后TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)條件為： 95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸20 s，循環(huán)40次.優(yōu)化后的20 μL最佳反應(yīng)體系為：10 μL Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2×)、上/下游引物(5 μmol·L-1)各0.3 μL、0.6 μL探針(10 μmol·L-1)、2 μL待檢樣品核酸， 補(bǔ)充滅菌去離子水至終體積為20 μL.

2.2　TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的動(dòng)力學(xué)擴(kuò)增曲線(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

基于TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)PoRVVP6基因在1.92×102～1.92×108拷貝·μL-1有很好的線(xiàn)性關(guān)系，檢測(cè)的最低值為1.92×102拷貝·μL-1.所獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性方程為：y=-3.248x+39.453，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999.獲得的動(dòng)力學(xué)擴(kuò)增曲線(xiàn)見(jiàn)圖1，推導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2.

1-7：標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度分別為1.92×108、1.92×107、1.92×106、1.92×105、1.92×104、1.92×103和1.92×102拷貝·μL-1.圖1　TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的動(dòng)力學(xué)擴(kuò)增曲線(xiàn)Fig.1　The kinetic curve for TaqMan based real-time PCR method

2.3　TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的特異性

圖2　TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2　The standard curve for TaqMan based real-time PCR method

建立的基于TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法僅對(duì)PoRV擴(kuò)增出陽(yáng)性信號(hào)，對(duì)豬常見(jiàn)病原(如PEDV、TGEV、CSFV和JEV)均未檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào)(圖3).

2.4　TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的重復(fù)性與再現(xiàn)性

建立的基于TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的組內(nèi)變異系數(shù)為0.25%～1.26%，組間變異系數(shù)0.31%～1.49%(表1).

陰性對(duì)照(PEDV、TGEV、CSFV和JEV)未見(jiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增信號(hào)，肉眼難以區(qū)分.圖3　TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的特異性Fig.3　The specificity for TaqMan based real-time PCR method

標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度拷貝·μL-1組內(nèi)變異系數(shù)CtSDCV/%組間變異系數(shù)CtSDCV/%1.92×10812.520.080.6012.550.090.741.92×10715.800.080.5115.860.100.621.92×10618.990.110.5819.060.120.621.92×10522.480.060.2522.610.130.471.92×10425.220.110.4225.330.080.311.92×10328.900.240.8229.070.351.201.92×10231.980.401.2632.030.481.49

2.5　臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)79份豬腹瀉病料進(jìn)行常規(guī)RT-PCR檢測(cè)，檢測(cè)出陽(yáng)性樣品4份，陽(yáng)性率為5.06%(4/79)；對(duì)這79份病料進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR檢測(cè)，檢測(cè)出陽(yáng)性樣品6份，陽(yáng)性率為7.59%(6/79).同時(shí)，4份經(jīng)RT-PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品經(jīng)TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果均為陽(yáng)性，符合率達(dá)100%.

3　討論

輪狀病毒感染是嬰幼兒較為常見(jiàn)的感染，在人醫(yī)上作為引起腹瀉的病原之一被廣泛關(guān)注[18-19].國(guó)內(nèi)外關(guān)于豬群感染輪狀病毒的研究起步較晚，隨著近年來(lái)豬群的“頑固性腹瀉”病原學(xué)研究而成為研究熱點(diǎn)[20-21].對(duì)輪狀病毒VP6基因的研究表明，不同宿主(人源、豬源和大熊貓?jiān)?輪狀病毒VP6基因之間的核苷酸同源性較高，在90.5%以上[22]；且遺傳進(jìn)化分析表明其并無(wú)明顯的宿主一致性，推測(cè)人源和豬源輪狀病毒可相互感染.RNA病毒的跨種感染和傳播常常會(huì)導(dǎo)致病毒基因序列的重組以便能更好地適應(yīng)宿主的免疫作用，當(dāng)前有跨多種屬的基因重配輪狀病毒的報(bào)道[23]，提示我們應(yīng)加強(qiáng)對(duì)生豬養(yǎng)殖業(yè)工作人員相關(guān)病原的流行病學(xué)跟蹤，防止相互交叉感染[24].

本試驗(yàn)建立的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法針對(duì)VP6基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)，其熒光信號(hào)針對(duì)VP6基因保守區(qū)，不受非特異性擴(kuò)增及引物二聚體的影響，對(duì)常見(jiàn)豬群病原(如PEDV、TGEV、CSFV和JEV)檢測(cè)均未見(jiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增信號(hào)，特異性強(qiáng)；建立的方法敏感性高，最低檢測(cè)限為192拷貝·μL-1；擴(kuò)增相關(guān)系數(shù)為0.999，組內(nèi)和組間變異系數(shù)低(均低于1.50%)，表明建立的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好.對(duì)臨床收集的79份豬腹瀉病料進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，常規(guī)RT-PCR方法檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品，經(jīng)TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR方法檢測(cè)均為陽(yáng)性，符合率達(dá)100%.可見(jiàn)，本試驗(yàn)建立的檢測(cè)PoRV感染的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR方法，可有效用于臨床開(kāi)展PoRV感染的分子流行病學(xué)研究.

[1] 姜晶,吳丹,李男.豬輪狀病毒的分子流行病學(xué)研究進(jìn)展[J].吉林畜牧獸醫(yī),2015,36(4):24-28.

[2] 胡帥,周慶安,李軍,等.2013—2014年廣西省主要豬病毒性傳染病流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2016,43(6):1 618-1 623.

[3] 張坤,何啟蓋.豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬A群輪狀病毒多重RT-PCR檢測(cè)方法的建立及臨床應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2010,41(8):1 001-1 005.

[4] 陳小金,陳建飛,時(shí)洪艷,等.豬輪狀病毒SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2010,40(2):174-179.

[5] 邊亞娟,林長(zhǎng)水,田志軍,等.應(yīng)用PRV VP6蛋白McAb間接免疫熒光法檢測(cè)豬輪狀病毒[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2007,43(4):36-37.

[6] 袁亞男,劉文忠.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的類(lèi)型、特點(diǎn)與應(yīng)用[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2008,35(3):27-30.

[7] HU L, CRAWFORD S E, HYSER J M, et al. Rotavirus non-structural proteins: structure and function [J]. Curr Opin Virol, 2012,2(4):380-388.

[9] 楊盟,周建國(guó),馬海利.A組輪狀病毒的基因組及其蛋白研究進(jìn)展[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2012,20(2):75-80.

[10] WEN X, WEI X, RAN X, et al. Immunogenicity of porcine P[6], P[7]-specific △VP8 rotavirus subunit vaccines with a tetanus toxoid universal T cell epitope [J]. Vaccine, 2015,33(36):4 533-4 539.

[11] PARBHOO N, DEWAR J B, GILDENHUYS S. Sequence analysis and structural implications of rotavirus capsid proteins [J]. Acta Virol, 2016,60(3):260-270.

[12] MALM M, HEINIMKI S, VESIKARI T, et al. Anti-VP6 VHH: an experimental treatment for rotavirus A-associated disease [J]. PLoS One, 2016,11(9):e0162351.

[13] 劉陽(yáng)陽(yáng),冉旭華,聞曉波.輪狀病毒拮抗宿主先天性免疫機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2016,32(7):659-664.

[14] VILLENA J, VIZOSO-PINTO M G, KITAZAWA H. Intestinal innate antiviral immunity and immunobiotics: beneficial effects against rotavirus infection [J]. Front Immunol, 2016,7:563.

[15] NAIR N, NEWELL E W, VOLLMERS C, et al. High-dimensional immune profiling of total and rotavirus VP6-specific intestinal and circulating B cells by mass cytometry [J]. Mucosal Immunol, 2016,9(1):68-82.

[16] NAVARRO R, AUNG M S, CRUZ K, et al. Whole genome analysis provides evidence for porcine-to-simian interspecies transmission of rotavirus-A [J]. Infect Genet Evol, 2017,49:21-31.

[17] MAFFEY L, VEGA C G, MIO S, et al. Rotavirus capsid VP6 tubular and spherical nanostructures act as local adjuvants when co-delivered with norovirus VLPs [J]. Clin Exp Immunol, 2017,189(3):331-341.

[18] BIALOWAS S, HAGBOM M, NORDGREN J, et al. Rotavirus and serotonin cross-talk in diarrhoea [J]. PLoS One, 2016,11(7):e0159660.

[19] BURNETT E, JONESTELLER C L, TATE J E, et al. Global impact of rotavirus vaccination on childhood hospitalizations and mortality from diarrhea [J]. J Infect Dis, 2017,215(11):1 666-1 672.

[20] 陳強(qiáng),曾麗莉,俞伏松,等.規(guī)?；i場(chǎng)仔豬腹瀉4種病原的感染情況調(diào)查[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2010,25(1):8-13.

[21] VLASOVA A N, AMIMO J O, SAIF L J. Porcine rotaviruses: epidemiology, immune responses and control strategies [J]. Viruses, 2017,9(3):E48.

[22] LIE Y, CHEN S, WANG C, et al. Molecular cloning and sequence analysis of VP6 gene of giant panda rotavirus strain CH-1 [J]. African Journal of Biotechnology, 2011,10(65):14 329-14 336.

[23] ESONA M D, ROY S, RUNGSRISURIYACHAI K, et al. Characterization of a triple-recombinant, reassortant rotavirus strain from the Dominican Republic [J]. J Gen Virol, 2017,98(2):134-142.