車前草干、鮮品提取物有效成分含量的對(duì)比研究＊

李劍琦 ，劉宇政 ，余承歡 ，曾飛 ，冷紅文 ，楊慧 ，郭新秀

(1、江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，南昌 330006；2、南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院，南昌 330003)

車前草為車前科植物車前 （Plantago asiatica L）或平車前（Plantago degresa Willd）干燥全草，車前草主要含有熊果酸、齊墩果酸、桃葉珊瑚苷、黃酮類化學(xué)成分，具有祛痰、止咳、利尿等作用，臨床上常用于治療水腫，淋病，肺熱咳嗽[1]，清下焦?jié)駸醄2]等癥。在我國(guó)古今醫(yī)學(xué)典著中均有藥物鮮品治療疾病的記載，如三鮮湯、四生丸等[3]，車前草亦常以鮮品應(yīng)用于中醫(yī)臨床，隨著保鮮技術(shù)的發(fā)展，使得對(duì)中藥鮮品的研究呈上升趨勢(shì)，而中藥鮮品和干品其有效成分和藥理作用往往會(huì)有所不同[4]，因此對(duì)于車前草鮮品有必要進(jìn)行更深入的研究。熊果酸作為車前草的一個(gè)主要成分，具有護(hù)肝、抗腫瘤，可明顯改善肝纖維化大鼠的肝功能[5]；總黃酮作為已被認(rèn)可的具有生物活性的物質(zhì)。本文通過以車前草中主要成分熊果酸和總黃酮為指標(biāo)，探討車前草鮮品干品的成分差別，為進(jìn)一步拓展車前草鮮品的利用，提高車前草制劑的質(zhì)量提供參考。

1　材料與方法

1.1儀器和試藥DIONEX UltiMate 3000型高效液相色譜儀 （美國(guó)賽默飛科技公司）：DAD二極管陣列檢測(cè)器；UV5800紫外分光光度計(jì) （上海元析儀器有限公）；KQ-500E型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海亞榮生化儀器廠）；蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：20161111，純度98.0%，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）；熊果酸對(duì)照品（批號(hào)：20160705，純度98.1%，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）；乙腈（色譜純，美國(guó)Fishier試劑公司）；其他試劑均為分析純，液相用水為純化水。車前草藥材采集于贛州，鮮品到干品的質(zhì)量比為5.02。

1.2提取物的制備[6，7]

1.2.1鮮品提取物的制備稱取洗凈晾干水分的新鮮車前草2kg，粉碎，第一次加4800ml的60%乙醇超聲提取1h，過濾，藥渣再加入3200ml的60%乙醇超聲提取1h，過濾，合并兩次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，放入60℃烘箱烘干，粉碎，即得。

1.2.2干品提取物的制備稱取洗凈晾干水分的新鮮車前草2kg，置于60℃烘箱中至干燥，粉碎藥材，取藥材粉末，提取方法同1.2.1。

1.3熊果酸含量的測(cè)定與結(jié)果

1.3.1色譜條件Kromasil C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱；流動(dòng)相：甲醇：乙腈：0.2%磷酸水（40：50：10）；流速：1ml·min-1； 柱溫：25℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；進(jìn)樣量：20μl。 在此色譜條件下，對(duì)照品及樣品的色譜圖如下：

圖1　車前草鮮品提取物（A）、車前草干品提取物（B）和熊果酸對(duì)照品（C）溶液的HPLC色譜圖

1.3.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取熊果酸對(duì)照品溶液10.89mg，至10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取1ml，至10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得每1ml含108.9μg的熊果酸對(duì)照品溶液。

1.3.3供試品溶液的制備精密稱取車前草鮮藥和干藥提取物浸膏粉末各0.2g，置50ml量瓶中，加80%甲醇超聲使溶解，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液即得。

1.3.4線性關(guān)系考察分別精密量取對(duì)照品貯備液0.2、0.4、0.8、1.6、2.0ml，置 10ml量瓶中，加入 80%甲醇稀釋至刻度，即得濃度為1.995、3.991、7.981、15.96、19.95μg·ml-1的熊果酸對(duì)照品溶液， 按“1.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（C），峰面積為縱坐標(biāo)（A），進(jìn)行回歸分析，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=0.1703C+0.0456(r=0.9999)，表明熊果酸在 1.995-19.95μg·ml-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.5精密度試驗(yàn)取15.963μg·ml-1熊果酸對(duì)照品溶液，按“1.3.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。計(jì)算的平均峰面積的RSD=0.95%，表明本條件精密度良好。

1.3.6重復(fù)性試驗(yàn)取同一批車前草鮮藥提取物，平行制備6份供試品溶液，按“1.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算熊果酸的平均含量為 2.980mg·g-1，RSD=1.40%，表明該方法的重復(fù)性良好。

1.3.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取車前草鮮藥提取物，制備供試品溶液，分別在 0、2、4、6、8、24h 時(shí)精密量取20μl注入液相色譜儀，計(jì)算峰面積的RSD=1.6%，表明該樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.3.8加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量的車前草鮮藥提取物約0.1g，共6份，按1：1加入熊果酸對(duì)照品，按“1.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定，計(jì)算回收率。熊果酸的平均加樣回收率為99.09%，RSD為1.0%。結(jié)果表明，熊果酸回收率符合要求，測(cè)定方法可行。結(jié)果見表1。

表1　熊果酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

1.3.9樣品的測(cè)定取車前草鮮藥及干藥提取物各0.2g，精密稱定，制備供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各 20μl，按““1.3.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中熊果酸的含量。結(jié)果：車前草鮮品提取物的含量為2.980mg·g-1；車前草干品提取物的含量為 1.479mg·g-1。

1.4總黃酮的含量測(cè)定與結(jié)果[8]

1.4.1蘆丁對(duì)照品溶液的制備精密稱取蘆丁對(duì)照品12.51mg，置100ml量瓶中，加60%乙醇溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.1201mg·ml-1對(duì)照品溶液。

1.4.2供試品溶液的制備稱取車前草鮮品或者干品提取物0.1g，精密稱定，置100ml量瓶中，加60%乙醇超聲15min使溶解，放冷，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.4.3供試品溶液的測(cè)定精密量取供試品溶液2ml，置10ml量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3ml搖勻，靜置6min；再加10%硝酸鋁溶液0.3ml，搖勻，靜置6min，再加入4%氫氧化鈉溶液4ml，用60%乙醇稀釋定容刻度，搖勻，靜置12min，以60%乙醇溶液作空白，于510nm處測(cè)吸光度，計(jì)算浸膏中總黃酮的含量。

1.4.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對(duì)照品液0、0.5、1、2、3、4、5ml分別置于 10ml容量瓶中， 分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3ml搖勻，靜置6min；再加10%硝酸鋁溶液0.3ml，搖勻，靜置6min，再加入4%氫氧化鈉溶液4ml，用70%乙醇稀釋定容至10ml刻度線，搖勻，靜置12min，以60%乙醇溶液作空白，于510nm處測(cè)吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為 A=0.0121C+0.0094(r=9998)，蘆丁在 6.01-60.05 μg·ml-1與吸光度線性關(guān)系良好。

1.4.5精密度試驗(yàn)取對(duì)照品溶液3ml，置于10ml容量瓶中，照“1.4.4”項(xiàng)下方法，自“加入5%亞硝酸鈉溶液0.3ml”起，依法測(cè)定吸光度，同份顯色樣品；連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算RSD=0.12%，結(jié)果顯示精密度良好。

1.4.6重復(fù)性試驗(yàn)取車前草鮮品提取物0.1g，共稱取6份，照“1.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取2ml置10ml量瓶中，照“1.4.3”項(xiàng)下方法，測(cè)定吸光度，結(jié)果6份樣品中總黃酮含量的RSD為1.58%，說(shuō)明樣品的重復(fù)性良好。

1.4.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取重復(fù)性項(xiàng)下的供試品溶液，在室溫下分別放置0、30、60、120分鐘，測(cè)定吸光度，計(jì)算各吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.91%，說(shuō)明樣品的穩(wěn)定性良好。

1.4.8加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量的車前草鮮藥提取物約50mg，共6份按1：1加入蘆丁對(duì)照品，按“1.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“1.4.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。蘆丁的平均加樣回收率為99.26%，RSD為1.4%。結(jié)果表明，蘆丁的回收率符合要求。測(cè)定方法可行。結(jié)果見表2。

1.4.9樣品的測(cè)定取車前草鮮品和干品提取物0.1g，精密稱定，照“1.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“1.4.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果：車前草鮮品提取物的含量為167.8mg·g；車前草干品提取物的含量為 128.1mg·g。

2　討論

本研究中車前草干品為鮮品經(jīng)烘箱60℃干燥而來(lái)，干燥之前的鮮品與鮮品提取物所用鮮品為同一批采購(gòu)，保證了原材料的一致性，從而保證最后結(jié)果的可靠性。對(duì)鮮品-干品-干品提取物，干品提取物的得膏率為5.667%；從鮮品-鮮品提取物，鮮品提取物的得膏率為5.769%，表明鮮品提取物和干品提取物的得膏率基本一致。

表2　蘆丁加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

在對(duì)車前草提取物中熊果酸的含量進(jìn)行測(cè)定時(shí)，用純甲醇處理提取物，提取物不易溶散，從而使熊果酸提取不完全，經(jīng)過多次試驗(yàn)，采用80%甲醇作為提取溶劑效果較好，故采用80%甲醇處理提取物。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，采用相同的提取工藝，車前草鮮品提取物中熊果酸和總黃酮的含量均高于干品提取物，鮮品提取物中熊果酸含量比干品高了1倍多，鮮品提取物中總黃酮含量比干品高約30%。隨著對(duì)車前草鮮品研究的深入，以及保鮮技術(shù)的發(fā)展，可以發(fā)掘出車前草鮮品的更多新用途，本實(shí)驗(yàn)為合理高效的利用車前草鮮品提供了一定的參考依據(jù)。

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