高血糖對骨髓干細胞衰老的影響＊

劉畇 ，朱艷 ，盛霞 ，何琪 ，魏宏 ，簡蔚泓 ，寧紅紅 ，秦淑蘭

(1、蚌埠醫(yī)學院，蚌埠 233030；2、南昌大學第三附屬醫(yī)院，南昌 330008)

骨髓干細胞在特定的機體環(huán)境下能分化發(fā)展成血管內(nèi)皮細胞，并可分泌血管生長因子，參與組織損傷的修復和血管的再生；另外骨髓干細胞采集方便、取自自身，因此沒有排斥反應，也避免了倫理學糾紛而具有特殊的優(yōu)勢[1-3]。糖尿病是一組以慢性血糖水平增高為特征的代謝性疾病，是我國常見病、多發(fā)病，與非糖尿病人群相比較，其缺血性疾病患病率極高且發(fā)病年齡輕、病情進展快[4，5]。目前，骨髓干細胞在糖尿病患者中治療性血管新生的研究得到了廣泛的開展，然而大部分研究結(jié)果顯示該項治療在合并有糖尿病狀態(tài)下療效欠佳，并認為與高血糖毒性有必然的聯(lián)系[6，7]。我們認為高血糖可促進骨髓干細胞的衰老加速，從而導致該項治療療效降低，然而目前相關(guān)研究甚少。因此，我們對高血糖狀態(tài)下骨髓干細胞衰老是否加速進行了探討，現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1材料6-8周齡雄性BALB/c小鼠，體質(zhì)量（20.5±1.34）g，均在無病理條件下自由進食進水。鏈脲佐 菌 素（STZ）、DAPI 購 自 Sigma 公 司 ；FITC-conjugatedratanti-mouseCD117(c-Kit)monoclonal antibody購自美國 BD Pharmingen公司；anti-FITC microbeads購自德國Miltenyi Biotech公司，抗γ-H2AX抗體 (Polyclonal Rabbit anti-γ-H2AX購自abcam公司（美國）；抗P16INK4a抗體(Polyclonal Rabbit anti-P16INK4a)購自Santa Cruz公司（美國)；抗 β-actin抗體(Polyclonal rabbit antiβ-actin)購自 Cell Signaling 公司（美國）；二抗 Goat anti-Rabbit IgG-HRP購自KPL公司（美國）；強生血糖儀（美國）；MiniMACS Separator(德國)；NIKON倒置熒光顯微鏡（日本）；蛋白電泳儀（美國），垂直電泳槽（美國）；轉(zhuǎn)移電泳槽（美國）；精密電子天平(德國)；低溫高速離心機（德國）。

1.2方法

1.2.1STZ糖尿病小鼠模型的制備及分組 6-8周齡的 BALB/c雄性小鼠腹腔注射 STZ（60mg/kg，pH4.4，無菌檸檬酸緩沖液稀釋，每天腹腔注射1次，連續(xù)5d），注射結(jié)束后第3d測隨機血糖，高于15mmol/L認為糖尿病模型制備成功。正常對照組：6-8周齡的BALB/c雄性小鼠腹腔注射無菌檸檬酸緩沖液稀釋，每天腹腔注射1次，連續(xù)5d。制模成功8周后，用于以下實驗分組。

1.2.2骨髓CD117+干細胞的分離分別測量兩組的體質(zhì)量及血糖后，將小鼠麻醉，腹主動脈脫血后，在無菌的條件下取股骨及脛骨，用phosphatebuffered saline（PBS）沖洗骨髓腔，收集細胞懸液，使用比重離心液去除紅細胞后，使用免疫磁珠分離法（MACS）分離出 CD117+細胞。

1.2.3共聚焦檢測骨髓干細胞γ-H2AX表達將MACS分離得到的CD117+細胞，調(diào)整待測細胞的濃度為 1×105個/ml，按照試劑盒(Cell Biolabs，DNA Double Strand Break Assay)步驟標準操作，具體如下：接種在多聚賴氨酸包被的24孔培養(yǎng)板上，每孔接種1ml。體外培養(yǎng)12h之后，使用PBS清洗3次后，接著細胞用多聚甲醛固定，加入抗小鼠γ-H2AX抗體室溫下反應 1h，PBS清洗 3次后與FITC標識的二抗反應，之后再用DAPI對細胞核進行染色，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.4Western blot檢測γ-H2AX以及p16蛋白表達 取MACS分離得到的CD117+細胞，調(diào)整待測細胞的濃度為1×106-107個/ml，提取蛋白質(zhì)，進行Western blot分析，檢測γ-H2AX蛋白表達以及衰老相關(guān)蛋白p16表達的變化，內(nèi)參β-actin蛋白的含量作為參照計算蛋白的相對表達量。

1.2.5統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用 t檢驗。 P≤0.05 為有統(tǒng)計學差異。

2　結(jié)果

2.1兩組體重及血糖情況造模前兩組小鼠體重[正常對照組（19.91±0.84）g，糖尿病組（20.21±0.97）g]；血糖[正常對照組（7.68±0.67）mmol/L，糖尿病組（7.60±0.92）mmol/L]，差異無統(tǒng)計學意義。造模成功8周后，正常對照組及糖尿病組體重分別為（28.14±0.83）g、（21.13±0.79）g，血糖分別為（7.85±0.66）mmol/L、（21.28±1.46）mmol/L， 糖尿病組與正常對照組相比多飲、多尿癥狀較重，體重明顯低下(P＜0.001)，糖尿病組血糖水平明顯高于正常對照組(P＜0.001)。

2.2高血糖對骨髓干細胞γ-H2AX表達量的影響通過熒光共聚焦顯微鏡觀察兩組骨髓干細胞DSB標志物γ-H2AX（綠色熒光）表達情況，我們發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，糖尿病組骨髓干細胞γ-H2AX表達更為明顯，兩組差異具有統(tǒng)計學意義 （P=0.0006，n=3）。 （見圖 1）

圖1　A：熒光共聚焦顯微鏡下觀察高血糖對骨髓干細胞γ-H2AX表達量的影響（10倍分辨率，細胞核顯示藍色熒光，γ-H2AX顯示綠色熒光）B：兩組骨髓干細胞熒光染色后，γ-H2AX陽性細胞百分比定量結(jié)果（STZ：糖尿病組；WT：對照組）；*P＜0.001

2.3高血糖對骨髓干細胞γ-H2AX以及p16蛋白表達的影響通過Western blot分析兩組骨髓干細胞DSB標志物γ-H2AX以及衰老相關(guān)蛋白p16蛋白表達情況，我們發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比、糖尿病組骨髓干細胞γ-H2AX以及p16蛋白表達明顯增強。（見圖2）

3　討論

圖2　Western blot檢測高血糖對骨髓干細胞γ-H2AX以及p16蛋白表達的影響

缺血性疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，傳統(tǒng)療法主要為藥物緩解和手術(shù)再通，但對于嚴重缺血性疾病療效欠佳[8，9]。近年來，骨髓干細胞移植治療重癥缺血性疾病作為一種新療法成為關(guān)注的焦點[1-3]。骨髓干細胞是一種具有高度自我更新、強分化潛能及多重分化活性的細胞[10，11]，其細胞標志物包括CD117及 CD34[12，13]。眾多國內(nèi)外研究表明，移植到缺血區(qū)的骨髓干細胞，可通過歸巢、聚集并融入缺血組織附近，分化發(fā)展成血管內(nèi)皮細胞及分泌血管生長因子，移植細胞的存活率與治療效果密切相關(guān)[14，15]。

糖尿病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，糖尿病患者合并缺血性疾病的發(fā)病率增高，常規(guī)藥物及手術(shù)治療效果欠理想[16]。近年來，自體骨髓干細胞移植治療得到一定的應用，但不少研究結(jié)果表明其療效欠佳，Govaert等的研究及Jiménez-Quevedo等的研究[17，18]均證實糖尿病合并缺血性心臟病患者給予骨髓干細胞移植后，心臟功能無改善，然而療效欠佳的原因至今未明。

眾所周知，細胞衰老是指可增殖細胞在信號通路的調(diào)控下，不可逆地脫離細胞周期后進入的一種相對穩(wěn)定的狀態(tài)，細胞衰老涉及DNA的損傷與修復、線粒體的能量代謝以及一系列基因的調(diào)控等[19]。高血糖可引起機體氧化應激，而氧化應激可進一步促進細胞的衰老[20，21]。因此本研究通過建立STZ誘導的糖尿病小鼠模型，探討了高血糖狀態(tài)是否促進CD117+骨髓干細胞DNA受損、從而加速細胞衰老。本研究考慮到高血糖狀態(tài)的長期影響效果，我們在糖尿病模型建模成功8周后，才收集了骨髓干細胞進行分析。我們發(fā)現(xiàn)糖尿病組與正常對照組相比，DNA雙鏈斷裂(DSB)損傷標志物γ-H2AX表達明顯增強。我們進一步采用Western blot檢測γ-H2AX以及衰老相關(guān)蛋白p16表達情況，結(jié)果也提示與正常對照組相比，糖尿病組骨髓干細胞γ-H2AX以及p16蛋白表達水平增強。以上結(jié)果表明高血糖狀態(tài)可促進骨髓干細胞的衰老。眾多研究表明高血糖引起的氧化應激可破壞DNA的結(jié)構(gòu)而引發(fā)DNA損傷應答、或者直接調(diào)控衰老相關(guān)的信號通路，促進細胞衰老的發(fā)生[22]。

該研究首次分析了高血糖狀態(tài)對骨髓干細胞衰老的影響，具有一定的新意，但也存在一定的不足點：首先，未能在機制上進一步論證所得結(jié)果；其次，本研究所得的結(jié)果是體外分析結(jié)果，而機體體內(nèi)微環(huán)境遠遠比體外復雜。以上不足有待今后的研究中去解決，包括給予糖尿病小鼠抗氧化應激治療后分析骨髓干細胞衰老狀況。

綜上所述，我們證實了高血糖狀態(tài)可促進骨髓干細胞的衰老，為骨髓干細胞移植在糖尿病合并缺血性疾病患者方面的應用提供了一定基礎理論依據(jù)。

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