FOXM1在人類結(jié)腸癌中的表達(dá)及意義＊

曹原，堯陽(yáng)揚(yáng)，郭惠，劉鎮(zhèn)，熊建萍

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，南昌 330006)

結(jié)腸癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅我國(guó)居民健康。在我國(guó)，隨著人群生活方式的日益西化以及過(guò)多高脂高熱食物的攝入、肥胖、吸煙以及缺乏鍛煉等因素，結(jié)直腸癌的發(fā)生率正在日益攀升，縱使目前手術(shù)技術(shù)及新輔助化療在結(jié)直腸癌早期診斷及治療上取得了一定的進(jìn)步，但對(duì)結(jié)直腸癌伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病人，其5年生存率仍在12.5%以下。結(jié)腸癌患者絕大多數(shù)初診時(shí)已為晚期，其病情進(jìn)展快、預(yù)后差[1]。結(jié)腸癌的早期診斷技術(shù)落后是導(dǎo)致結(jié)腸癌死亡率及復(fù)發(fā)率高的主要原因，由于其確切的分子機(jī)制仍不甚清楚，目前缺乏有效的預(yù)防和治療措施。最近多項(xiàng)研究表明基因突變與結(jié)直腸癌的預(yù)后及治療密切相關(guān)，鑒于此，很多的分子靶向治療藥物應(yīng)運(yùn)而生[2-5]。因此，探討發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌的新型腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)于結(jié)腸癌的早期診斷、預(yù)后判斷和指導(dǎo)治療意義重大。

Forkhead Box轉(zhuǎn)錄因子家族成員轉(zhuǎn)錄因子叉頭盒蛋白 M1（Forkhead box M1，F(xiàn)OXM1）是叉頭盒蛋白家族重要的成員，是一種增殖相關(guān)的致瘤性的轉(zhuǎn)錄因子，具有在進(jìn)化上保守的螺旋翼狀(Winged Helix)DNA結(jié)合域。FOXM1的表達(dá)僅局限于成人組織分裂活躍的細(xì)胞中，例如胸腺、睪丸、結(jié)腸和小腸，然而在靜止期或分化的細(xì)胞中幾乎不表達(dá)[6，7]。目前研究已證實(shí)FOXM1的表達(dá)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展起到至關(guān)重要的作用。大量基因芯片分析結(jié)果顯示FOXM1在超過(guò)20種實(shí)體腫瘤中高表達(dá)，如肝細(xì)胞癌、胰腺腺癌、乳癌、卵巢癌、肺癌以及結(jié)直腸癌等[8-14]。FOXM1在細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)展、血管生成、EMT、DNA損傷修復(fù)和代謝等許多生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)已證實(shí)FOXM1可通過(guò)激活尿激酶型纖溶酶原激活劑受體（PLAUR，urokinase-typeplasminogenactivator receptor）促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移[14]。最近，一些研究已經(jīng)表明，F(xiàn)OXM1可增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)基因，如乳腺癌相關(guān)基因（BRCA2），X線交叉互補(bǔ)基因 1（XRCC1）和 RAD5 的表達(dá)[16，17]，而敲除 FOXM1顯示降低了結(jié)腸癌細(xì)胞DNA復(fù)制[18]。

在本項(xiàng)研究中，我們用生物信息學(xué)網(wǎng)站GEPIA證實(shí)了絕大多數(shù)腫瘤中FOXM1的基因表達(dá)量都有不同程度的增加，同時(shí)查詢生物信息學(xué)網(wǎng)站cBioPortal發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中FOXM1的基因變異率較高，同時(shí)我們運(yùn)用westren boltting技術(shù)比較結(jié)腸癌組織及其相對(duì)應(yīng)的臨近非癌組織中FOXM1蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌組織中FOXM1的表達(dá)比鄰近非癌組織中的表達(dá)水平更高。這些結(jié)果表明，F(xiàn)OXM1在人類結(jié)腸癌中的表達(dá)量有所增加，并可能成為結(jié)腸癌患者的新型預(yù)后因子。

1　材料和方法

1.1臨床標(biāo)本該研究方案經(jīng)南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院批準(zhǔn)。在知情同意的情況下收集結(jié)腸癌患者的新鮮腸癌手術(shù)標(biāo)本及對(duì)應(yīng)的非癌組織共4對(duì)。

1.2蛋白質(zhì)印跡從新鮮組織中提取總蛋白，并用冰冷的裂解緩沖液裂解。用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶封閉膜，然后用針對(duì)FOXM1（Abgent，USA）和 β-肌動(dòng)蛋白（Affinity，USA）的一級(jí)抗體進(jìn)行免疫印跡，其次是辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗（ZSGB，中國(guó)）。使用化學(xué)發(fā)光溶劑（Thermo，USA）檢測(cè)信號(hào)。

2　結(jié)果

2.1各腫瘤樣本及其配對(duì)正常組織的FOXM1的mRNA表達(dá)情況本研究中，我們使用生物信息學(xué)網(wǎng)站 GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn）對(duì) FOXM1在人類各惡性腫瘤樣本及其配對(duì)正常組織樣本中的mRNA表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在絕大多數(shù)樣品中FOXM1在腫瘤組織中的mRNA表達(dá)中值均大于其配對(duì)的正常組織樣品 （圖1A和1B）。其中在結(jié)腸癌樣品中的FOXM1的mRNA表達(dá)中值為30.78PTM，而在相應(yīng)正常組織中的表達(dá)中值為2.47PTM。

圖1　圖1A GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn）中跨所有腫瘤樣品和配對(duì)的正常組織的FOXM1 mRNA表達(dá)譜。注：縱坐標(biāo)代表腫瘤類型或正常組織中FOXM1的mRNA表達(dá)中值。圖1B GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn）中跨所有腫瘤樣品和配對(duì)的正常組織的FOXM1 mRNA表達(dá)散點(diǎn)圖

2.2FOXM1在結(jié)直腸癌中DNA的改變情況為了進(jìn)一步探討FOXM1基因在結(jié)腸癌中表達(dá)情況，對(duì)FOXM1在結(jié)直腸腺癌中的改變頻率及情況進(jìn)行信息挖掘。一項(xiàng)研究統(tǒng)計(jì)了249例結(jié)腸腺癌患者FOXM1基因改變的情況，這些病例中有高達(dá)2.81%的病例出現(xiàn)FOXM1基因的改變，其中2.01%為突變，0.4%為擴(kuò)增，0.4%為多重改變；還有一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)針對(duì)122例直腸腺癌患者，這些病例中有高達(dá)2.46%的病例出現(xiàn)FOXM1基因的改變，其中1.64%為突變，0.82%為擴(kuò)增；更有說(shuō)服了的是，來(lái)自cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)的一項(xiàng)更大樣本量的統(tǒng)計(jì)同時(shí)納入了結(jié)腸腺癌和直腸腺癌患者，發(fā)現(xiàn)在2001例結(jié)直腸癌病例中有0.8%的病例出現(xiàn)FOXM1基因的改變，其中0.75%為突變，0.05%為擴(kuò)增（見圖2A）。說(shuō)明FOXM1在結(jié)直腸癌，尤其是結(jié)腸癌中的存在高頻率的DNA突變現(xiàn)象。

2.3結(jié)腸癌組織中FOXM1蛋白的表達(dá)較臨近非癌組織高在查詢和挖掘上訴生物信息學(xué)依據(jù)之后，我們通過(guò)westren blotting技術(shù)對(duì)4對(duì)結(jié)腸癌及其鄰近非癌組織進(jìn)行FOXM1蛋白質(zhì)表達(dá)分析，以驗(yàn)證結(jié)腸癌中FOXM1在蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果顯示：4對(duì)組織中，結(jié)腸癌組織中FOXM1蛋白的表達(dá)比鄰近非癌組織中的表達(dá)水平更高（圖3A）。

圖2　圖2A cBioPortal(http：//www.cbioportal.org)中3項(xiàng)數(shù)據(jù)顯示FOXM1在結(jié)直腸癌中的DNA的改變情況。

圖3　圖3A 6對(duì)結(jié)腸癌及其鄰近非癌組織的FOXM1表達(dá)水平

3　討論

Forkhead Box轉(zhuǎn)錄因子家族成員FOXM1是一種進(jìn)化上保守的致癌性轉(zhuǎn)錄因子。FOXM1在細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)展、血管生成、EMT、DNA損傷修復(fù)和代謝等許多生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有研究表明，F(xiàn)OXM1表達(dá)與晚期非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后不良相關(guān)，并且與非小細(xì)胞肺癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)[19，20，21]。 在白血病細(xì)胞中，miR-370的異位表達(dá)通過(guò)靶向抑制FOXM1表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯和衰老[22]?，F(xiàn)已證實(shí)FOXM1可通過(guò)激活尿激酶型纖溶酶原激活劑受體（PLAUR，urokinasetype plasminogen activator receptor）促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移[15]。FOXM1還可增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)基因，如乳腺癌相關(guān)基因（BRCA2），X線交叉互補(bǔ)基因 1 （XRCC1） 和 RAD51的表達(dá)[16，17]。 此外，Yoshida等[18]發(fā)現(xiàn)FOXM1基因敲除小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞DNA復(fù)制及生長(zhǎng)能力顯著減弱。一項(xiàng)研究表明，F(xiàn)OXM1靶向Nijmegen破壞綜合征1（NBS1）來(lái)調(diào)節(jié)DNA損傷誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞衰老[22]。miRNA在結(jié)腸癌中的研究也越來(lái)越多[23]，既往的文獻(xiàn)表明多種miRNA可以靶向FOXM1參與調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的耐藥[22，24]。

在本項(xiàng)研究中，我們通過(guò)在生物信息學(xué)網(wǎng)站，挖掘了人類各腫瘤樣本中FOXM1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在絕大多數(shù)人類腫瘤樣本中FOXM1的表達(dá)中值均大于正常組織，這表明，F(xiàn)OXM1的異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。FOXM1在結(jié)直腸癌中基因突變和擴(kuò)增比較頻繁，基因水平的異常改變是FOXM1表達(dá)異常的重要原因之一。通過(guò)大數(shù)據(jù)我們證實(shí)了FOXM1在結(jié)腸癌中的DNA改變頻率較高，mRNA的表達(dá)較正常組織高，并且我們結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)腫瘤中FOXM1在蛋白水平上表達(dá)較正常組織亦增高。因此我們認(rèn)為FOXM1作為結(jié)腸癌患者新的治療靶點(diǎn)及預(yù)后生物指標(biāo)是有意義的。

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