三種栽培棉籽油脂組成及相關(guān)基因表達(dá)分析

薛金愛，高慧玲，高宇，郝青婷，劉寶玲，李潤植

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

中國是世界上棉花單產(chǎn)量最高的國家。但是，由于棉花產(chǎn)量大，生產(chǎn)成本低，相關(guān)棉織產(chǎn)品價(jià)格低廉，棉花經(jīng)濟(jì)效益不高。如何穩(wěn)定高效的提高棉花的經(jīng)濟(jì)效益，已成為目前我國棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。棉籽是棉花作物的種籽，是植物油脂的重要來源，因此提高棉籽油利用率對于穩(wěn)定發(fā)展棉花產(chǎn)業(yè)起著重要的作用[1]。

目前已有許多學(xué)者對棉籽油脂肪酸生物功能進(jìn)行了研究，一些脂肪酸，特別是不飽和脂肪酸如油酸和亞油酸成為了高值物質(zhì)。關(guān)于脂肪酸生物合成的代謝途徑及其調(diào)控也受到廣泛的關(guān)注[2]。棉籽油脂肪酸合成途徑受到多種酶的調(diào)控，其中β-酮脂酰-ACP合成酶II (KASII)催化16碳酸延長至18碳酸；Δ9硬脂酰-ACP脫氫酶(SAD)催化硬脂酸(18∶0)轉(zhuǎn)化為油酸(18∶1)；Δ12脂肪酸脫氫酶(FAD2)催化油酸 (18∶1) 轉(zhuǎn)化為亞油酸 (18∶2)；二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶 (DGAT2) 是催化三酰甘油(TAG)生物合成的最后一步。這些相關(guān)酶對棉籽油脂肪酸的組成和含量起了決定性作用。因此，明確棉花油脂代謝過程的一些相關(guān)酶基因的表達(dá)水平，對利用油脂代謝工程定向改造棉籽油成分、含量、棉花育種及棉花綜合利用提供一定的理論依據(jù)。

棉籽油脂中相對含量較多的3種脂肪酸是棕櫚酸(16∶0)、油酸(18∶1)和亞油酸(18∶2)，油酸和亞油酸這兩種不飽和脂肪酸的含量接近80%，其中亞油酸(18∶2)含量最高，可高達(dá)50%以上[3～5]。棉籽油由于富含不飽和脂肪酸，尤其是亞油酸屬于高值脂肪酸，可用于生產(chǎn)特殊用途的食用油，比如高亞油酸保健油等[6]。因此明確棉籽油脂肪酸的組成和含量對于提高棉花的營養(yǎng)價(jià)值以及培育專用型油脂品種的選育提供一定的理論依據(jù)。雖然目前已有關(guān)于棉花脂肪酸組成的報(bào)道[7～9]，但是關(guān)于對3種栽培棉進(jìn)行比較分析的報(bào)道很少。為此，本文以3種栽培棉海島棉(G.barbadense)、亞洲棉(G.arboretumL.)和3種陸地棉(G.hirsutum)為試驗(yàn)材料，提取棉籽油進(jìn)行粗脂肪定量，使用氣相色譜分析(GC)對棉籽油中的脂肪酸組成和含量進(jìn)行分析，并利用qRT-PCR技術(shù)分析4個相關(guān)酶基因的表達(dá)水平，以期解析3種栽培棉籽油脂肪酸組成差異的分子遺傳基礎(chǔ)，旨在為培育棉籽油專用型品種以及提高棉花綜合利用價(jià)值提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

材料：海島棉pima379、亞洲棉石系亞1號和陸地棉(徐19、冀豐1271、中棉所2)，種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地。

主要試劑:氯仿∶甲醇(2∶1)、0.9% KCL、甲醇鈉、異辛烷、RNA提取試劑盒等。

1.2 主要儀器與設(shè)備

氣相色譜儀(美國安捷倫7890B)、搖床、離心機(jī)、氮吹儀、PCR儀等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 棉花種子的收集

選用種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地的棉花材料，在授粉棉鈴25 d后，取胚珠液氮速凍后保存于-80 ℃，用于表達(dá)試驗(yàn)；并收獲其種子用于油脂提取。每種材料選用3粒飽滿的種子，以備重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 棉籽油脂的提取以及含油量的測定

分別稱取50 mg充分研磨的去殼干種子粉末于離心管中，加入甲醇∶氯仿(2∶1)溶液，搖床抽提24 h，離心后收集上層有機(jī)相，加入氯仿、NaCl溶液，離心10 min，收集下層有機(jī)相到稱重的玻璃管中，氮?dú)獯蹈珊蠓Q出玻璃管及脂肪酸的總重量。計(jì)算方法：

總脂含量=(提取后總重-提取前管重)/0.05。

1.3.3 棉籽油脂的甲酯化

將提取的棉籽油甲酯化，先加入甲醇鈉，混勻后震動20～45 min。然后加入異辛烷，混勻、離心、靜置使溶液分層。最后加入0.9% KCL, 混勻，離心至溶液分層，用玻璃吸管吸取上層(含脂肪酸甲酯FAME)溶液，放入GC小瓶中編號，放入-20 ℃冰箱保存待測。

1.3.4 棉籽油脂肪酸成分的測定

將甲酯化后的樣品用氣相色譜儀進(jìn)行分析測定，參數(shù)條件為：進(jìn)樣口溫度為260 ℃，高純氮?dú)庾鳛檩d氣；檢測器溫度250 ℃；色譜柱型號：HP-88(100 m*0.25 mm*0.2 μm)。利用17種混標(biāo)中各脂肪酸甲酯(FAME)保留時(shí)間的對比確定樣品中FAME的種類，利用峰面積歸一化法確定各FAME相對含量，計(jì)算方法為：某一種FAME相對含量=(某一FAME的峰面積/總FAME的峰面積)×100%。

1.3.5 相關(guān)酶基因的表達(dá)分析

1.3.5.1 序列查找及保守區(qū)同源引物的設(shè)計(jì)

在Cottongen數(shù)據(jù)庫(https://www.cottongen.org/)中blast搜索找到海島棉、亞洲棉和陸地棉的FAD2、KASII、DGAT2、SAD對應(yīng)的CDS序列，然后在開放閱讀框內(nèi)經(jīng)比對分析，找到對應(yīng)的保守區(qū)，利用Primer primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物用于qPCR反應(yīng)(表1)。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 The primers of present experiment

1.3.5.2 棉花胚珠總RNA的提取和cDNA的合成

采用北京康潤(Genstar)公司的Plant RNA Kit試劑盒提取棉花25 d胚珠總RNA，具體試驗(yàn)方法參照試劑盒說明書，采用Genstar(康潤公司，北京)反轉(zhuǎn)錄試劑盒按說明書進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

1.3.5.3 qRT-PCR驗(yàn)證基因的表達(dá)

以陸地棉GhEF-1α，海島棉GbUBQ7作為內(nèi)參，并用qPCRsoft3.0(2-ΔΔCq)對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，Origin 6.0繪制柱形圖。反應(yīng)體系參考Takara公司試劑盒說明書推薦的20 μL體系，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變形30 s，58 ℃退火15 s，40個循環(huán)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種棉籽油的含油量的分析

經(jīng)分析，5種棉籽油材料的含油量均可達(dá)到30%以上，最高的為陸地棉冀豐1271，可達(dá)40.18%，最低的為海島棉pima379，含量為35.66%。(表2)。

表2 5種栽培棉棉籽油含油量Table 2 The Oil contents of five kinds of cotton seeds

2.2 5種棉籽油的FAME 組成以及含量的分析

由氣相色譜分析得知(圖1)，5種棉籽油脂肪酸甲酯(FAME)主要集中在C16∶0(棕櫚酸)、C18∶0(硬脂酸)、C18∶1(油酸)、C18∶2(亞油酸)。經(jīng)計(jì)算分析得到5種栽培棉棉籽FAME的組成和含量(表3)，由表可見，5種材料脂肪酸甲酯總含量不存在顯著差異。其中飽和脂肪酸主要集中在C16∶0，含量在21%～25%之間，而不飽和脂肪酸主要是C18∶1、C18∶2，二者總含量可以達(dá)到70%以上，尤其是C18∶2的含量最高，與C16∶0、C18∶0、C18∶1的含量存在顯著差異。

每種棉籽油的FAME組成在相對含量上也有一定的差異，陸地棉徐19的C16∶0含量最高，陸地棉中植棉2最高值則是C18∶2，而海島棉pima379在C18∶0達(dá)最高值，亞洲棉石系亞1號中含量最高的是C18∶1，可達(dá)33.46%，是其它4種材料含量的二倍，由于其C18∶1含量高，所以導(dǎo)致其C18∶2的含量比海島棉和陸地棉的都低。

2.3 棉籽油代謝途徑相關(guān)酶基因的表達(dá)分析

經(jīng)qRT-PCR分析(圖2)5種棉籽油材料油脂代謝途徑4種相關(guān)酶基因在棉籽胚珠中都有一定的表達(dá)，但各酶基因表達(dá)量有一定的差異。

圖1 5種棉籽油材料的GC圖譜Fig.1 Gas chromatograms of five kinds of cotton seeds

脂肪酸甲酯FAME海島棉pima379Gb．pima379亞洲棉石系亞1號Ga．shixiya1徐19Xu19冀豐1271Jifeng1271中植棉2號CCRI2平均含量AveragecontentC16∶0238321712447220921162265bC18∶0320248211228214244cC18∶1194333461679155515932023bC18∶2535442615664600860775473a

注：不同字母代表p<0.05差異顯著

Note: Different letters represent significant at 0.05 level.

圖2 5種棉籽油4個油脂代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)分析Fig.2 The expression and analysis of four oil metabolism related enzyme genes in five cotton seed oil

5種材料中FAD2的表達(dá)量均是最高，其余3個酶基因的表達(dá)存在一定的差異。中植棉2號SAD的表達(dá)量最低，其它4種材料是KASII的表達(dá)量最低，表達(dá)量僅是FAD2的1/3。海島棉pima379、中植棉2號、冀豐1271和徐19中DGAT2的表達(dá)量僅次于FAD2的表達(dá)量，而亞洲棉石系亞1號中SAD的表達(dá)量次于FAD2，DGAT2的表達(dá)量低于FAD2和SAD。

3 結(jié)論與討論

棉籽油脂既是食用油的主要來源,又是重要的工業(yè)原料，因而具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[10]。棉籽油脂肪酸成分包括飽和脂肪酸類和不飽和脂肪酸類；飽和脂肪酸類包括棕櫚酸和硬脂酸；不飽和脂肪酸類包含油酸和亞油酸。棉籽脂肪酸以不飽和脂肪酸為主，2種主要不飽和脂肪酸占棉籽總脂肪酸含量的70%以上，亞油酸是占比最大的脂肪酸[11]。本文對棉籽脂肪酸成分分析結(jié)果顯示，3種栽培棉中陸地棉材料的含油量相對高于其它2種，這與前人研究結(jié)果一致。目前，我國陸地棉栽培面積比例可達(dá)90%以上[12,13]。而棉籽油脂的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及用途的決定因素是其脂肪酸組成和含量。大多數(shù)研究人員對亞油酸的關(guān)注更高。本文通過對棉籽油脂肪酸成分分析發(fā)現(xiàn)了另一個值得關(guān)注的脂肪酸——棕櫚酸，棉籽油飽和脂肪酸棕櫚酸(16∶0)的含量可高達(dá)20%以上，遠(yuǎn)高于另一種飽和脂肪酸硬脂酸(18∶0)，而且也高于大豆等其它油料作物。如將其部分甚至全部轉(zhuǎn)化為棕櫚油酸(16∶1)，將為生產(chǎn)生物柴油提供最佳的生產(chǎn)原料，這樣不僅可以充分提高棉籽油的工業(yè)價(jià)值，同時(shí)也為培育專用型

棉花品種指明了方向，為穩(wěn)定而高效發(fā)展棉花產(chǎn)業(yè)做出貢獻(xiàn)。

本文在前人對脂肪酸代謝途徑相關(guān)研究的基礎(chǔ)上[2],進(jìn)一步對棉籽油脂肪酸代謝相關(guān)酶基因進(jìn)行組織表達(dá)分析,可以進(jìn)一步闡明棉籽油脂肪酸代謝的分子遺傳基礎(chǔ)，而且對利用代謝工程組裝技術(shù)改善棉花種子中脂肪酸的組分和品質(zhì)具有重要的指導(dǎo)意義。棉籽油脂肪酸組成和含量取決于脂肪酸代謝途徑的一些相關(guān)酶的表達(dá)情況。FAD2催化油酸(18∶1)轉(zhuǎn)化為亞油酸(18∶2)，本文獲得結(jié)果表明5種材料均是FAD2的表達(dá)量相對高一些，這是對棉籽油富含不飽和脂肪酸尤其是亞油酸(18∶2)的一個很好的詮釋。3種陸地棉材料均是DGAT2的表達(dá)量較低于FAD2的表達(dá)量，海島棉和亞洲棉材料DGAT2的表達(dá)量相對低一些。這與海島棉和亞洲棉這2種材料含油量相對比較低是符合的。亞洲棉則是SAD的表達(dá)量較低于FAD2的表達(dá)量，SAD催化硬脂酸(18∶0)轉(zhuǎn)化為油酸(18∶1)，亞洲棉籽中油酸(18∶1)的含量最高，最接近亞油酸(18∶2)的含量。5種材料中除了陸地棉中植棉2，其余的KASII的表達(dá)量均是處于最低水平，KASII催化16碳酸延長至18碳酸，因此硬脂酸(18∶0)的含量也屬于最低。本研究對棉籽油脂肪酸組成的分子遺傳基礎(chǔ)進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果可為棉籽油的營養(yǎng)價(jià)值、工業(yè)價(jià)值的深度利用以及提高棉花綜合利用價(jià)值提供理論依據(jù)及參考信息。

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