釀酒酵母ScCoA-Δ9脫氫酶種子特異表達(dá)載體構(gòu)建及在棉花中的功能驗(yàn)證

劉寶玲，孫巖，張飛，郝青婷，吉夏潔，李潤(rùn)植，薛金愛(ài)*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

棉花(Gossypiumhirsutum)是我國(guó)主要的纖維經(jīng)濟(jì)作物，大量的棉籽也可用于制作食用油和生物燃油等[1]。作為日常食用的重要植物油，棉籽油僅含有限的幾種脂肪酸，即棕櫚 酸 (16∶0)、硬脂酸 (18∶0)、單不飽和油酸 (18∶1Δ9)、多不飽和亞油酸 (18∶2Δ9,12)和亞麻酸(18∶3Δ9,12,15)[2,3]。其中亞油酸含量最高，約為54%，這種脂肪酸含有兩個(gè)雙鍵，易氧化，難以長(zhǎng)期儲(chǔ)存，而在防氧化加工過(guò)程會(huì)產(chǎn)生大量反式脂肪酸，對(duì)人體健康非常不利，大大降低了棉籽油的食用價(jià)值[4]。棕櫚油酸(16∶1Δ9) 是一種重要的稀有單不飽和脂肪酸(ω-7)，具有極為廣泛的應(yīng)用價(jià)值。棕櫚油酸可用來(lái)生產(chǎn)保健品，降低血液中膽固醇的含量，預(yù)防心腦血管疾病和抑制腫瘤發(fā)生等[5,6]，還可用作工業(yè)1-辛烯的原材料和生物燃油等[7,8]。

然而，這種高附加值的棕櫚油酸在棉籽中含量極低(<1%)，但在貓爪草(DoxanthaunguiscatiL.)[9,10]，澳洲堅(jiān)果(Macadamiaintegrifolia)[11]和沙棘(HippophaerhamnoidesL.)[12]等野生植物種子中大量積累，含量分別為64%、30%和70%[4]。這些野生植物大多數(shù)僅能在部分地區(qū)生存，種子很小，產(chǎn)量極低,難以被用來(lái)大規(guī)模生產(chǎn)高含量棕櫚油酸[13,14]。隨著市場(chǎng)對(duì)棕櫚油酸含量需求日益劇增，通過(guò)基因工程手段對(duì)大田油料作物脂肪酸合成代謝通路進(jìn)行遺傳修飾，以期提高種子棕櫚油酸的積累量，已成為目前植物油脂代謝領(lǐng)域的熱點(diǎn)話題[15]。

釀酒酵母(Saccharomyeescerevisiae)脂酰CoA-Δ9脫氫酶 (ScCoA-Δ9D)是一種定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜結(jié)合蛋白酶，其在生物體內(nèi)能夠催化棕櫚酸 (16∶0) 酯酰鏈上第9個(gè)碳原子上脫氫產(chǎn)生棕櫚油酸(16∶1Δ9)[16,17]。據(jù)前人報(bào)道，一些外源的脂酰-Δ9脫氫酶已被用來(lái)提高植物棕櫚油酸含量，盡管產(chǎn)生的棕櫚油酸含量尚低于10%[18]。例如，在亞麻薺種子過(guò)量表達(dá)ScCoA-Δ9D基因，則使其種子內(nèi)棕櫚油酸(16∶1Δ9)含量升高了約2.7%[14]，轉(zhuǎn)ScCoA-Δ9D基因的煙草中棕櫚油酸的含量也高于野生型[19]。棉花種子含有約25%的16∶0, 是大田油料作物中最高的[3]。因此，將對(duì)16∶0有較高特異性的ScCoA-Δ9D轉(zhuǎn)入陸地棉種子，不存在該酶底物不足的限制因素。

為此，本試驗(yàn)以幾乎不含棕櫚油酸等ω-7脂肪酸的棉花為試驗(yàn)材料，利用農(nóng)桿菌將含有釀酒酵母ScCoA-Δ9D基因的種子特異性表達(dá)載體轉(zhuǎn)入陸地棉種子中，期望將棉籽內(nèi)更多的棕櫚酸(C16∶0)轉(zhuǎn)化為棕櫚油酸(C16∶1Δ9)，減少C16∶0流向亞油酸(C18∶2)途徑，從而從源頭上改變其脂肪酸成分, 改良棉籽油的營(yíng)養(yǎng)及工業(yè)用品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用材料為陸地棉WC種子，由山西省農(nóng)科院棉花研究所資源室提供。大腸桿菌DH5α，GV3101農(nóng)桿菌均為本實(shí)驗(yàn)室保存。引物和測(cè)序工作由金唯智生物科技有限公司完成。pCAMBIA1303-ScCoA-Δ9D表達(dá)載體和帶紅色熒光蛋白的大豆種子特異性載體(pJC-DsRed)均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所實(shí)驗(yàn)室保存。測(cè)序和引物合成由寶生物工程(大連)有限公司完成。BamHI內(nèi)切酶和T4連接酶購(gòu)于NEB公司。

1.2 ScCoA-Δ9D基因的亞克隆及其種子特異性表達(dá)載體的構(gòu)建

本試驗(yàn)在ScCoA-Δ9D基因的起始密碼子和終止密碼子兩端設(shè)計(jì)一對(duì)特異擴(kuò)增引物F：5'-CGggatccACCACGCCTCAGGTTCTC-3'和R：5'-CGggatccAAGCACAACCGAAGATAG-3'，斜體部分為BamHI酶切位點(diǎn)，加粗字母為保護(hù)堿基，擴(kuò)增的表達(dá)盒總長(zhǎng)度為1 533 bp。以pCAMBIA1303-ScCoA-Δ9D為模板進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增，程序?yàn)?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60℃40 s，72℃40 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后割膠回收，然后利用BamHI同時(shí)酶切ScCoA-Δ9D基因和pJC-DsRed質(zhì)粒，酶切體系(NEB公司)為：Cutsmart Buffer 5 μL，BamHI 1 μL，pJC-DsRed質(zhì)粒 4 μL，ScCoA-Δ9D擴(kuò)增產(chǎn)物6 μL，然后加ddH2O補(bǔ)足至50 μL，酶切3 h后得到酶切產(chǎn)物。酶連接體系為：Buffer 2 μL，ScCoA-Δ9D產(chǎn)物為15 μL，pJC-DsRed質(zhì)粒為 2 μL，T4連接酶為1 μL，總體積為20 μL，然后經(jīng)過(guò)16 ℃過(guò)夜連接，得到酶連接產(chǎn)物，經(jīng)轉(zhuǎn)化和PCR分子鑒定，得到陽(yáng)性DH5α菌并提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化

1.3.1 棉花無(wú)菌苗的培養(yǎng)

選取籽粒飽滿的WC種子，70%酒精清洗10 s，經(jīng)過(guò)10% 的H2O2浸泡2 h后，用無(wú)菌水清洗3～5遍，并浸泡于無(wú)菌水中24 h直至種子露白。然后剝離種皮后，種植于1/2 MS培養(yǎng)基，置于25 ℃中，黑暗培養(yǎng)3 d，然后3 000 lx光照培養(yǎng)4 d[20]。

1.3.2 侵染及共培養(yǎng)

將成功轉(zhuǎn)入二元表達(dá)載體的農(nóng)桿菌GV3101，在含50 mg·L-1利福平和50 mg·L-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中28 ℃，200 r·min-1，振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5左右，然后8 000 r·min-1離心5 min，棄上清，用等體積的1/2 MS液體培養(yǎng)基重懸。取培養(yǎng)一周的棉花幼苗下胚軸，切成1 cm長(zhǎng)的莖段，用農(nóng)桿菌液浸泡10 min后用濾紙吸干菌液，放入新的共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2d[20,21]。

1.3.3 植株誘導(dǎo)再生

將上述共培養(yǎng)2 d后的莖段重新放置于含抗生素(500 mg·L-1頭孢霉素、50 mg·L-1草氟安膦)和激素(0.05 mg·L-12,4-D和0.1 mg·L-1KT)的篩選培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，并每隔15 d左右繼代一次。經(jīng)過(guò)3～4繼代篩選后，取形態(tài)較好的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到不含任何激素和抗生素的改良MS培養(yǎng)基上分化形成胚性愈傷組織并再生出小植株。然后將再生小苗單獨(dú)轉(zhuǎn)移到試管苗培養(yǎng)基中，待其長(zhǎng)出3～4片真葉時(shí)(圖2G)，在超凈臺(tái)中取1～2片提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，等陽(yáng)性植株繼續(xù)長(zhǎng)至5～6 cm用于嫁接(圖2H)[20]。本文用

未浸染的無(wú)菌苗葉片做陰性對(duì)照。

1.4 轉(zhuǎn)基因棉花DNA的提取及ScCoA-Δ9D基因的表達(dá)情況

采用改良的CTAB法[16]提取上述轉(zhuǎn)基因棉花幼葉和陰性對(duì)照的DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)分析。ScCoA-Δ9D基因擴(kuò)增PCR引物為1F：5'-TGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCC-3'，1R：5'-CATAAAAACCCATCTCATAAATAAC-3'，擴(kuò)增片段大約為 501 bp，PCR 程序參考上述參數(shù)。利用艾德萊RNA試劑盒對(duì)各轉(zhuǎn)基因事件中的棉花幼葉提取總RNA，經(jīng)過(guò)凝膠電泳和核酸檢測(cè)合格后，利用TAKARA公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以管家基因GhHistone3為內(nèi)參，草銨膦基因(Bar)為轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，?duì)ScCoA-Δ9D基因進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，其中非轉(zhuǎn)基因棉花葉片作為外對(duì)照。反應(yīng)體系為ABM公司(鎮(zhèn)江愛(ài)必夢(mèng)生物科技)Master EvaGreen Mix 為10 μL,正反引物各0.6 μL，cDNA各1 μL，ddH2O為7.8 μL，反應(yīng)程序?yàn)?5℃10 min；95℃15 s；58℃1 min，72 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。利用2-ΔΔcq法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。各基因引物如下表1。

表1 qRT-PCR相對(duì)表達(dá)引物Table 1 Primers of relative expression of qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 ScCoA-Δ9D基因的亞克隆與表達(dá)載體構(gòu)建

經(jīng)過(guò)PCR克隆方法得到1 533 bp的ScCoA-Δ9D為圖3 A所示，利用通過(guò)割膠回收、BamHI酶切和T4酶連接反應(yīng)，獲得種子特異性超表達(dá)載體pJC-ScCoA-Δ9D-DsRed(圖1C)，圖1 A為ScCoA-Δ9D超表達(dá)載體pCAMBIA1303載體的T-DNA區(qū)。圖1B為含種子特異性表達(dá)盒的質(zhì)粒pJC-DsRed T-DNA區(qū)。經(jīng)過(guò)測(cè)序和PCR驗(yàn)證后，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌用于后續(xù)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

2.2 轉(zhuǎn)基因再生植株的誘導(dǎo)過(guò)程

棉花種子經(jīng)無(wú)菌培養(yǎng)、農(nóng)桿菌浸染、共培養(yǎng)(圖2 A)、誘導(dǎo)培養(yǎng)(圖2B，2C)、分化培養(yǎng)(圖2D～2F)等一系列處理后，在誘導(dǎo)培養(yǎng)繼代2～3次(約1個(gè)月)后，在切斷兩端各生成一團(tuán)透明的薄壁愈傷組織，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)取下得愈傷，大約20 d時(shí)，愈傷逐漸彭大，并能產(chǎn)生部分葉綠素，使得部分愈傷為淺綠色(圖2D)。然后，更換培養(yǎng)基為分化培養(yǎng)基，開(kāi)始誘導(dǎo)薄壁組織分化為胚，在繼代2～3次后，部分愈傷(圖2D箭頭所示)形成淡黃色米粒狀致密的球形胚(圖2E箭頭所示)，進(jìn)而又分化為有明顯生長(zhǎng)點(diǎn)且能正常發(fā)育的轉(zhuǎn)基因小苗(圖2F)，待小苗長(zhǎng)到4～5片葉，約4～5 cm高時(shí)(圖2G),取出瓶中的小苗，在溫室中嫁接到生長(zhǎng)健壯的海島棉母體上，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間愈合培養(yǎng)，形成真正的轉(zhuǎn)基因棉花(圖2H)，經(jīng)過(guò)這樣嫁接的小苗存活率一般能達(dá)到90%。

圖1 種子特異性ScCoA-Δ9D超表達(dá)載體構(gòu)建圖Fig.1 Recombination of overexpression vector of ScCoA-Δ9D gene

圖2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化流程Fig.2 Cotton genetic transformation process with Agrobacterium-mediated method

2.3 陽(yáng)性幼苗ScCoA-Δ9D基因的PCR檢測(cè)和表達(dá)分析

本試驗(yàn)隨機(jī)挑選18株經(jīng)過(guò)抗生素篩選的陽(yáng)性T0代轉(zhuǎn)基因幼苗(圖3B：1～18號(hào))分別進(jìn)行目的基因檢測(cè)。結(jié)果表明：將近99%的再生苗能夠擴(kuò)增出501 bp大小的目的基因片段，只是擴(kuò)增條帶的強(qiáng)弱不同，表明擴(kuò)增效率各不相同，這些片段大小與含上述表達(dá)載體的陽(yáng)性質(zhì)粒擴(kuò)增片段(圖3B“+”)大小一致，而在非轉(zhuǎn)基因棉花的下胚軸中均未擴(kuò)增出目的片段(圖3B，“CK”)，表明已經(jīng)成功獲得不同轉(zhuǎn)化事件的轉(zhuǎn)基因棉花株系。

對(duì)上述陽(yáng)性幼苗作表達(dá)分析(圖4)，發(fā)現(xiàn)棉花葉片中該基因與草銨膦基因(Bar)相比，表達(dá)量很低，這可能是啟動(dòng)子類型不同造成的，驅(qū)動(dòng)Bar基因表達(dá)的啟動(dòng)子為CaMV35S，而驅(qū)動(dòng)ScCoA-Δ9D基因表達(dá)的是大豆種子特異性啟動(dòng)子。另外，該基因在非轉(zhuǎn)基因棉花無(wú)任何表達(dá)，這表明，該基因不僅成功轉(zhuǎn)入棉花中而且也能在葉片中有所表達(dá)。研究表明，這類型組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的基因僅在相應(yīng)組織中是高量表達(dá)的[22]，Cahoon等在亞麻薺中使用該類型啟動(dòng)子特異性分別同時(shí)驅(qū)動(dòng)突變型Δ9-16∶0-ACP和Δ9-16∶0-CoA基因，結(jié)果使種子內(nèi)包括棕櫚油酸在內(nèi)的ω-7脂肪酸含量從1.4%提高到約23%[14]；王丕武等從大豆中分別克隆了種子、種皮和根特異性啟動(dòng)子，通過(guò)表達(dá)和GUS染色分析，表明這些組織特異性啟動(dòng)子均驅(qū)動(dòng)基因在這些組織中高表達(dá)，且均比CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的表達(dá)量低，而在葉，花等其他組織中表達(dá)均很弱[23]。

圖3 ScScCoA-Δ9D基因亞克隆片段及陽(yáng)性幼苗PCR檢測(cè)圖Fig.3 Subcloning fragment of ScScCoA-Δ9D gene and PCR detection for positive seedlings 注：A：1%瓊脂糖凝膠電泳中的ScCoA-Δ9D亞克隆，“M”代表分子量為2 000 bp的Marker，“1”代表目的擴(kuò)增片段；B：陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因幼苗的PCR鑒定，“1～18”代表轉(zhuǎn)基因棉花幼苗葉片，“CK”代表非轉(zhuǎn)基因棉花下胚軸，“+”代表陽(yáng)性pJC-ScCoA-Δ9D-DsRed質(zhì)粒。Note：A: Subcloning of ScCoA-Δ9Dgene in 1% agarose gel electrophoresis,"M"represents marker with a molecular weight of 2 000 bp and "1" represents the target amplified fragment；B:PCR amplification of positive transgenic seedlings. "1-18" represents transgenic cotton seedlings, "CK" represents the hypocotyl of non-transgenic cotton, and "+" represents positive plasmid of GlyP-ScCoA-Δ9D-DsRed.

圖4 轉(zhuǎn)基因棉花ScCoA-Δ9D基因的表達(dá)情況Fig.4 The expression pattern of ScCoA-Δ9D in transgenic cotton 注：1～5種為轉(zhuǎn)基因棉花。Note:"1～5"represent transgenic cotton.

3 討論

棕櫚油酸(C16∶1Δ9)是一類珍稀ω-7單不飽和脂肪酸，具有重要的營(yíng)養(yǎng)和工業(yè)價(jià)值。比如，棕櫚油酸能夠修飾細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、提高人體免疫力，還可對(duì)老年人中風(fēng)等疾病具有特殊功效[24,25]。而較多的亞油酸則可升高血液中膽固醇的含量, 增加心臟疾病和結(jié)腸癌等各類疾病的發(fā)生率。為提高成品油抗氧化性，在加工過(guò)程中經(jīng)常要進(jìn)行氫化處理，而氫化處理則導(dǎo)致一些反式脂肪酸形成。反式脂肪酸對(duì)人體有害，可誘發(fā)各類疾病的發(fā)生率[26]。試驗(yàn)證明，ScCoA-Δ9脫氫酶是是一種膜結(jié)合蛋白，能特異性識(shí)別16∶0-CoA，選擇細(xì)胞質(zhì)膜上的16∶0-CoA為底物，將其催化脫氫形成16∶1-CoA，棉籽內(nèi)含有約25%的棕櫚酸，居于油料作物之首，可為ScCoA-Δ9脫氫酶提供充足的底物[3]。本研究從pCAMBIA1303單基因載體上亞克隆出ScCoA-Δ9D基因，并將其通過(guò)連接酶連入大豆種子特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體中，旨在過(guò)量表達(dá)外源ScCoA-Δ9D基因，期望將棉籽內(nèi)更多的C16∶0脫氫形成C16∶1Δ9，從而增加棉籽中棕櫚油酸的含量。

目前，通過(guò)農(nóng)桿菌浸染棉花下胚軸從而獲得轉(zhuǎn)基因棉花還是最為有效的方法。盡管組培過(guò)程較為漫長(zhǎng)，但還是能夠在含激素和抗生素培養(yǎng)基上成功誘導(dǎo)受浸染的棉花下胚軸切斷長(zhǎng)出抗性愈傷組織，隨后愈傷分化為淡黃色致密的分化胚，最后形成轉(zhuǎn)基因幼苗，經(jīng)PCR基因鑒定，均能確定該基因已經(jīng)整合進(jìn)入棉花基因組中。通過(guò)棉花葉片表達(dá)分析表明，該基因在大豆種子特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的表達(dá)量非常低，明顯低于CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的Bar基因的表達(dá)量，這也驗(yàn)證了組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下，基因在相應(yīng)組織中高量表達(dá)的情況。這將為后續(xù)轉(zhuǎn)基因棉籽中該基因的表達(dá)和脂肪酸成分檢測(cè)打下良好的試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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