牦牛出血性敗血癥的病原分離與藥敏試驗(yàn)

趙青山 ， 趙登雪

(青海省家畜改良中心 ， 青海 西寧 810016)

多殺性巴氏桿菌在自然界中分布廣泛，是一種能使多種畜禽及野生動物發(fā)生以敗血癥及呼吸系統(tǒng)疾病為主要癥狀的重要條件致病菌。在青海地區(qū)常見的巴氏桿菌病主要有牛出血性敗血癥、羊巴氏桿菌病、豬肺疫及禽霍亂等。一般認(rèn)為家畜在發(fā)病前已經(jīng)帶菌，當(dāng)其飼養(yǎng)在不衛(wèi)生環(huán)境中，由于寒冷、悶熱、潮濕、擁擠、氣候劇變、營養(yǎng)缺乏、飼料突變、長途運(yùn)輸、寄生蟲等誘因，而使其抵抗力降低時，病菌即可乘機(jī)侵入體內(nèi)，經(jīng)淋巴液而入血液，發(fā)生內(nèi)源性感染[1]。

2012 年3月初，青海省黃南藏族自治州尖扎縣尖扎灘村一戶牧民飼養(yǎng)的38頭牦牛中有13頭牦牛陸續(xù)發(fā)病，發(fā)病率為34.21%(13/38)，就診前死亡7頭，致死率為53.85%(7/13)?；疾￡笈２〕躞w溫高達(dá)41 ℃，病牛口吐白沫，臥地不起，飲食欲減退或廢絕，心跳加快，節(jié)律不齊；頜下、喉部及胸前部出現(xiàn)炎性腫脹；腹式呼吸；眼結(jié)膜呈藍(lán)紫色；下痢，氣味惡臭。對病死牦牛剖檢可見: 皮下及肌肉組織有較為嚴(yán)重的出血性膠樣浸潤，切開后流出淡黃色透明液體；氣管內(nèi)充滿大量的泡沫狀黏液；淋巴結(jié)腫大、出血；肝腫脹、質(zhì)脆，個別牦牛肝表面有壞死灶；腎稍腫；肺臟切面呈現(xiàn)大理石病變；大網(wǎng)膜和腸系膜上有大面積彌漫性點(diǎn)狀、片狀出血；真胃和十二指腸黏膜水腫、增厚、出血；結(jié)腸呈紫紅色，有的發(fā)生壞死。通過對采取的實(shí)質(zhì)臟器進(jìn)行病原的分離鑒定，結(jié)合流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化，診斷為牦牛出血性敗血癥，同時對患病牦牛采取了相應(yīng)的治療與綜合性防制措施，再無新病例發(fā)生，結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病料 無菌采取病死牦牛心、肝、脾、肺、腎等臟器9份，置4 ℃冰箱保存待檢。

1.2 培養(yǎng)基 TSB肉湯、TSA瓊脂平板、TSA瓊脂斜面、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、鼠李糖、棉子糖、阿拉伯糖、木糖、蕈糖、衛(wèi)矛醇、肌醇、山梨醇、水楊苷、M.R.，V-P、靛基質(zhì)、明膠、鳥氨酸、硫化氫、西蒙氏枸櫞酸鹽、硝酸鹽、半固體和尿素，均購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司(批號080606)；MH培養(yǎng)基，購自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司(批號20081206)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 健康昆明系小鼠6只(體重16～18 g)，均購自青海省地方病研究所。

1.4 藥敏試驗(yàn) 抗生素種類為丁胺卡那霉素和青霉素等24種，購自上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司。

1.5 方法

1.5.1 觸片染色鏡檢 病料進(jìn)行觸片，分別進(jìn)行革蘭和美藍(lán)染色、鏡檢。

1.5.2 分離培養(yǎng) 將病料分別無菌接種到TSB肉湯，37 ℃溫箱培養(yǎng)18～24 h后搖勻再分別勾取2～3環(huán)TSB肉湯培養(yǎng)物劃線接種于TSA瓊脂平板上進(jìn)行細(xì)菌的數(shù)次純化培養(yǎng)，而后將純化好的細(xì)菌接種到TSA血斜面上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后置4 ℃冰箱備用[2]。

1.5.3 生化試驗(yàn) 將純化好的疑似多殺性巴氏桿菌株分別接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、鼠李糖、棉子糖、阿拉伯糖、木糖、蕈糖、衛(wèi)矛醇、肌醇、山梨醇、水楊苷、M.R.，V-P、靛基質(zhì)、明膠、鳥氨酸、硫化氫、西蒙氏枸櫞酸、硝酸鹽、半固體和尿素分解培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24～48 h后，判定結(jié)果。

1.5.4 致病性試驗(yàn) 勾取單個疑似多殺性巴氏桿菌落劃線接種于TSA瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，再用滅菌的生理鹽水無菌洗下，與麥?zhǔn)蠞峁苓M(jìn)行比濁，均選取9×108活菌/mL濃度腹腔注射試驗(yàn)組小鼠3只，0.5 mL/只，對照組3只小鼠腹腔注射滅菌生理鹽水，0.5 mL/只，觀察結(jié)果。

1.5.5 藥敏試驗(yàn) 將上述濃度的菌液分別用滅菌棉拭子蘸取后依次均勻涂布整個MH瓊脂平板，且每隔60度角旋轉(zhuǎn)1次，均勻涂布1～2次，分別貼上藥敏紙片。每塊平板貼3片正置于溫箱 30 min，然后倒置培養(yǎng)18～24 h。判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)藥敏試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法法規(guī)[3]。

2 結(jié)果

2.1 觸片、染色及鏡檢 取心、肝、脾、腎等病料進(jìn)行觸片，革蘭染色鏡檢，觀察到革蘭陰性小桿菌。美藍(lán)染色鏡檢可見到大量兩極濃染的小桿菌。

2.2 菌落形態(tài)與培養(yǎng)特性 TSB肉湯37 ℃培養(yǎng)24 h后均勻渾濁，在TSA平板上呈現(xiàn)淡藍(lán)色光澤，形成光滑、濕潤、邊緣整齊的菌落。

2.3 生化試驗(yàn) 生化試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 多殺性巴氏桿菌生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 動物試驗(yàn) 試驗(yàn)組3只小鼠于16～24 h內(nèi)全部死亡，對死亡小鼠剖檢可見皮下組織略水腫，心包和胸腔有漿液性纖維素性滲出物；有明顯的全身出血性變化，腸道出血尤為明顯；肝臟表面可見針尖大的灰白色壞死灶，分別采取肝、脾、肺等病料進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，分別分離到了與上述一致的革蘭陰性小桿菌，同時將實(shí)質(zhì)臟器觸片后經(jīng)美蘭染色鏡檢見到中間淡染，兩級著色較深的小桿菌。對照鼠飼喂一周后仍健活。

2.5 藥敏試驗(yàn) 抑菌圈的測量結(jié)果見表2。

2.6 根據(jù)流行病學(xué)資料的調(diào)查與分析,結(jié)合臨床癥狀、病理剖檢變化和實(shí)驗(yàn)室診斷，確診為牦牛出血性敗血癥。

表2 多殺性巴氏桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

說明：根據(jù)1994年12月版美國NCCLS藥敏試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法法規(guī)判定 ，“S”:敏感；“I”:中介；“R”:耐藥

3 討論

3.1 由于多殺性巴氏桿菌為條件性致病菌，在畜禽中帶菌率較高。有資料顯示，在豬的鼻道深處和喉頭內(nèi)，帶菌率為30.9%[4]。該病主要經(jīng)消化道感染，其次通過飛沫經(jīng)呼吸道感染，亦有經(jīng)皮膚傷口或蚊蠅叮咬而感染的。該病常年發(fā)生，特別是在青海純牧業(yè)地區(qū)，氣溫的驟降極易導(dǎo)致牦牛抵抗力降低，使多殺性巴氏桿菌通過外源性和內(nèi)源性傳染侵入牦牛機(jī)體后，很快通過淋巴結(jié)進(jìn)入血液形成菌血癥，并可在24 h內(nèi)發(fā)展為敗血癥而死亡。此次發(fā)病的主要原因：一是與發(fā)病前降雪降溫有關(guān)；二是該牧戶的牦牛多年未進(jìn)行牛出敗疫苗的免疫；三是該牧民為減少損失私自剝皮銷售和忽視消毒工作而造成了Pm的機(jī)械性傳播，導(dǎo)致其他牦牛感染本病。

3.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，在24種抗生素中，多殺性巴氏桿菌對頭孢哌酮(CFP)、頭孢三嗪(CRO)、紅霉素(ERY)、氟哌酸(NOR)、妥布霉素(TOB)等5種抗生素敏感；對頭孢呋辛(CFX)、頭孢噻肟(CTX)、呋喃妥因(NI)、利福平(RIF)、萬古霉素(VAN)等5種抗生素中敏介；對其余14種抗生素耐藥。藥物篩選的結(jié)果說明青鏈霉素對Pm分離株耐藥，這也就驗(yàn)證了該牧民曾用青鏈霉素配合0.85%氯化鈉液與25%葡萄糖進(jìn)行治療效果不佳的原因所在。由于該病發(fā)病比較急，病程短，常來不及治療而死亡。因此，必須以預(yù)防為主，一旦發(fā)病應(yīng)盡早治療，越早越好，否則到發(fā)病后期則治愈率極低，若臨床出現(xiàn)拉稀現(xiàn)象多為預(yù)后不良。因此，筆者選取2～3種敏感氟哌酸、頭孢哌酮和中敏(呋喃妥因)的藥物交替進(jìn)行治療(用量按說明書)，2 次/d，3d 為1個療程。同時對尚未發(fā)病的牦牛隔離并緊急注射牛出敗氫氧化鋁滅活疫苗，確保免疫密度達(dá)到100%，是防止牦牛出敗發(fā)生的重要措施。此外，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，避免牦牛受寒以增強(qiáng)其抗病能力；對在剖檢過程中被污染的飼草、土壤、血液集中深埋，防止疫病進(jìn)一步擴(kuò)散；對病死牦牛進(jìn)行深埋，嚴(yán)禁私自剝皮或?qū)⑷馐?、?nèi)臟飼喂自家的藏獒；畜主接觸牦牛前后均應(yīng)嚴(yán)格洗手消毒，以避免交叉感染或機(jī)械性地傳播病原。通過采取上述綜合措施1周后，剩余的6例患牛全部被治愈，疫情得到了控制。這一結(jié)果也充分說明牦牛出血性敗血癥在臨床上明確診斷、篩選用藥與及時采取綜合性的防制措施才能有效控制疫情發(fā)展。

參考文獻(xiàn):

[1] 黃銀云,胡新崗.犬巴氏桿菌病的預(yù)防與控制[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2008(11):40-41.

[2] H G.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].第3版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2001：248-252.

[3] 胡繼紅，高振翔，尹銘芳，等.美國NCCLS2002年版抗生素藥敏試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)更新內(nèi)容[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2002,25(6):367-369.

[4] 索緒峰,王建新.豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及毒素檢測[J].中國獸醫(yī)雜志,2005,41(6):25-27.