電針對木瓜蛋白酶致骨關節(jié)炎犬血漿中腺苷的影響

朱兆榮 ， 關 璐 ， 彭 詩 ， 劉 娟

(1.西南大學動物科技學院 ， 重慶 榮昌 402460 ； 2.重慶市獸醫(yī)科學工程研究中心中藥創(chuàng)新研究室 ， 重慶 榮昌 402460)

骨關節(jié)炎是犬的一種退行性骨關節(jié)疾病，是由于增齡、創(chuàng)傷、關節(jié)先天性異常、關節(jié)畸形等原因引起的關節(jié)軟骨退化損傷、關節(jié)邊緣和軟骨下骨反應性增生，是犬的一種比較常見多發(fā)的疾病，患病時伴有炎癥反應和疼痛反應。膝關節(jié)周圍有很多穴位，通過電針對它們的刺激能有效促進機體對內(nèi)源性鎮(zhèn)痛物質(zhì)的釋放，起到明顯緩解疼痛，消除炎癥的作用，同時可以促進血液循環(huán)，疏通經(jīng)脈，利于關節(jié)軟骨再生修復和周圍組織滲透液的吸收。腺苷作為一種重要的抑制炎癥反應的內(nèi)源性核苷[1]，其受體還與疼痛信息傳遞和調(diào)控有關[2]。腺苷常用測定方法有紙層析分光光度法[3]、紫外分光光度法[4]、高效液相測定等，其中高效液相色譜法具有高效高速高靈敏度的特點，可以更好的分離血漿中相對含量較少的腺苷，因此選用高效液相法以及最適條件進行含量測定。本研究采用木瓜蛋白酶制造犬骨關節(jié)炎模型，采用電針方法治療至痊愈，通過高效液相法測定腺苷含量變化，為電針治療骨關節(jié)炎的機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 中華田園犬32只，平均年齡3個月齡，體重2.5±0.5 kg，由西南大學榮昌校區(qū)實驗動物科提供。

1.2 試劑及儀器 木瓜蛋白酶(美國Sigma公司)；低速離心機(菲恰爾GL-16A)；Model 680酶標儀(Bio-Rad Laboratories，Inc)；華佗牌電子針療儀(SDZ-Ⅱ，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；LC-20AD型泵(日本島津公司)；SPD-20A紫外檢測器(日本島津公司)；CTO-20A柱溫箱(日本島津公司)；DGU-20A3脫氣機(日本島津公司)；C18柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)(日本島津公司)；AE-240S電子分析天平(梅特勒—托利多儀器有限公司)；AB135-S型十萬分之一電子分析天平(METTLER TOLEDO公司)；SB-25-12型超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)等。

1.3 動物模型建立與分組處理 參照文獻[5]，選取32只健康中華田園犬隨機分對照組和模型組，模型組于試驗開始第1、4、7天，在左膝關節(jié)腔注射0.5 mL體積分數(shù)4%木瓜蛋白酶，對照組同時注射生理鹽水0.5 mL，將模型建立成功的犬隨機分為3組，每組8只，即：模型組(不治療)、電針1組(電針[4]左側(cè)環(huán)跳穴、陽陵泉穴、后三里穴)、電針2組(電針[6]左側(cè)環(huán)跳穴、掠草穴、腎俞穴)，以30號針針刺20 min，1次/d，連續(xù)14 d，采血檢測犬血漿中腺苷含量。

1.4 犬血漿中腺苷的高效液相色譜溶液制備

1.4.1 對照品溶液制備 取腺苷標準品適量，精密稱定10 mg，加純化水制成1 g/L腺苷儲備液。分別精密量取儲備液適量，并用純化水定容于10 mL量瓶中，搖勻，配置成系列標準溶液。

1.4.2 供試品溶液制備 取新鮮犬血，靜置使腺苷被細胞完全滅活。將75 mmol/L-1的雙嘧達莫氯仿溶液1 mL加入潔凈離心管中，輕輕振搖，使整個管壁接觸到溶液，然后靜置待液體蒸發(fā)干，備用。將采集靜置后的血樣置于上述雙嘧達莫離心管中，立即以3 500 r/min離心5 min分離出血漿。

1.5 犬血漿中腺苷的高效液相色譜測定方法學考察

1.5.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸鹽緩沖液[50 mmol/L-1磷酸二氫鈉-50 mmol/L-1磷酸氫二鈉，500∶80]-甲醇(80∶20，pH值5.9)為流動相；柱溫：35 ℃；檢測波長為254 nm，進樣20 μL；流速：1 mL/min。

1.5.2 方法專屬性考察 取新鮮犬血，靜置使腺苷被細胞完全滅活，3 500 r/min離心5 min，分離得空白血漿。分別取腺苷標準品、血漿樣品、空白血漿以及空白血漿加腺苷標準品適量，按“1.4.1”項下操作，將配置好的待測樣品按上述色譜條件分別進行測定。

1.5.3 線性關系考察 取腺苷對照品儲備液1 g/L，用純化水依次稀釋為40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL。按上述色譜條件進行測定，測定結(jié)果以對照品濃度為縱坐標，峰面積為橫坐標，用最小二乘法進行線性回歸分析。

1.5.4 穩(wěn)定性試驗 樣品采集按照1.4.2項下的要求，在室溫下立即放置2 h后進行預處理。預處理后立即放置20 min和40 min后分別進樣測定含量。

1.5.5 精密性試驗 精密量取空白血漿樣品200 μL，加入適量腺苷標準溶液，制成濃度為40 mg/L 血漿樣品溶液，按照上述色譜條件進樣測定，平行測定6次，計算腺苷峰面積分值RSD。

1.5.6 重復性試驗 取同批血漿樣品6份，按供試品溶液配制方法制備，分別進行測定，記錄色譜圖，計算腺苷含量和RSD值。

1.5.7 加樣回收試驗 精密量取空白血漿樣品200 μL，加入適量腺苷標準溶液，制成濃度為40 mg/L血漿樣品溶液，按照上述色譜條件進樣測定，并帶入標準曲線計算濃度和回收率，測定本試驗建立的方法的準確性，通過平行設定6個重復。

1.6 高效液相色譜測定犬血漿中腺苷含量

1.6.1 標準品及樣品制備 同“1.4.1”及“1.4.2”。

1.6.2 樣品測定 精密量取血漿樣品200 μL，加入100 μL純化水，再加入400 μL乙腈，靜置10 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液測定，進樣量20 μL,檢測，外標法計算含量。

1.7 統(tǒng)計分析方法 統(tǒng)計分析用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，對所有數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗，并進行分析比較，試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 高效液相色譜測定犬血漿中腺苷的方法學考察結(jié)果 為考察高效液相色譜測定犬血漿中腺苷的方法是否可行，本試驗進行了如下專屬性、穩(wěn)定性和精密性考察。

2.1.1 專屬性考察 測定結(jié)果色譜圖見圖1，在腺苷對照品峰(圖1A)的保留時間上供試品(圖1B)有相應的色譜峰出現(xiàn)，陰性對照無對應色譜峰(圖1C)，表明用此法在測定犬血漿中腺苷含量時具有較好的專屬性。

2.1.2 線性關系考察 用建立的犬血漿中腺苷含量測定方法測定在濃度為40 μg/mL～0.5 μg/mL腺苷對照品溶液，進樣量20 μL，計算得到線性回歸方程為Y=1×10-5X-0.0183，回歸系數(shù)R=0.9999，表明腺苷在0.50～40.00 mg/L內(nèi)線性關系良好。

圖1 腺苷色譜

2.1.3 穩(wěn)定性試驗 計算得腺苷含量RSD分別為0.2961%和3.9864%，結(jié)果說明制備的供試品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4 精密性試驗 計算得腺苷峰面積分值RSD為0.090%。說明建立方法的精密度良好。

2.2 重復性試驗 計算腺苷含量和RSD值，平均含量為0.0054%，相對標準偏差RSD=6.294%。結(jié)果說明該方法重復性良好。

2.3 加樣回收試驗 測得平均回收率(n=6)為99.96%，相對標準偏差RSD=0.045%。

2.4 高效液相色譜測定犬血漿中腺苷含量結(jié)果 結(jié)果表明，模型組血漿中腺苷含量明顯下降，和對照組比較，差異極顯著(P<0.01)；電針1組、電針2組血漿中腺苷含量明顯升高，與模型組比較，差異極顯著(P<0.01)，電針1組與電針2組之間比較差異極顯著(P<0.01)；結(jié)果見表1。

表1 電針治療后各組犬血漿中腺苷水平

注：同列肩標不同字母表示差異極顯著(P<0.01)

3 分析討論

中醫(yī)認為骨關節(jié)炎屬于“痹癥”，多由風、寒、濕、熱、痰、瘀引起，兼肝、腎虛致正氣不足、筋骨不固，風寒濕邪阻滯經(jīng)絡，導致氣血運行不暢，經(jīng)絡阻滯，久之骨失所養(yǎng)而發(fā)病。治療以溫經(jīng)通絡、活血逐痹為主。本試驗中，選取環(huán)跳、掠草為主穴，分別選取陽陵泉、后三里和腎腧、后跟為配穴。通過針刺肢體穴位，以達到益氣活血、通絡止痛的作用。環(huán)跳穴為足少陽膽經(jīng)與足太陽膀胱經(jīng)交會穴,膀胱與腎相表里,故其具有益腎氣固胞宮之功,肝與膽相表里,肝喜條達,膽欲疏通,太陽主表,少陽主樞,故其具有疏通經(jīng)絡,宣表散寒,調(diào)理氣血,祛風勝濕,通陽助陽之效[6]。有研究表明[7]，環(huán)跳穴在改善膝骨關節(jié)炎患者臨床癥狀體征積分方面優(yōu)于常規(guī)針刺。掠草主治膝關節(jié)扭傷、神經(jīng)痛等；陽陵泉主治后肢麻痹、膝關節(jié)扭傷；后三里主治后肢疼痛，有學者研究[8]表明，后三里具有確切的鎮(zhèn)痛作用；腎俞主治扭傷，后跟主治扭傷、后肢麻痹。前期臨床試驗結(jié)果顯示，本試驗中選用的電針療法[10]，改善了膝關節(jié)血液循環(huán)，有利于吸收多余關節(jié)滲出液以及促進修復骨關節(jié)滑膜，使犬的膝關節(jié)功能恢復正常，疼痛腫脹消失，運動恢復正常。

膝關節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶溶液可導致白細胞數(shù)量增多[9]，因此犬骨關節(jié)炎會伴隨炎癥反應。炎癥，是機體抵御外來刺激的一種防御性免疫機制，過度的炎癥反應則會對機體造成損傷，嗜中性粒細胞是其中重要的參與者之一，有研究表明[10]，腺苷及其受體可以通過參與其粘附、遷移、細菌殺傷作用、炎癥介質(zhì)產(chǎn)生、凋亡等過程的調(diào)節(jié)，從而對炎癥起到調(diào)節(jié)作用。腺苷存在于外周血液及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，是一種具有多種調(diào)節(jié)作用的神經(jīng)活性物質(zhì)，主要通過與細胞表面的特殊受體結(jié)合后發(fā)揮作用。犬患骨關節(jié)炎后，局部炎癥反應強烈，腺苷含量明顯降低，導致機體調(diào)節(jié)炎癥的能力下降，電針刺激后，腺苷含量有所上升，可能是高濃度的腺苷降低了嗜中性粒細胞與血管內(nèi)皮的粘附作用[11]，從而減輕了炎癥。

當炎癥反應加強時，會引起痛覺敏感性升高，機體產(chǎn)生疼痛反應。研究表明，內(nèi)源性核苷及其類似物在疼痛調(diào)節(jié)方面有一定作用[12]。腺苷受體中的A1受體主要分布在脊髓中，內(nèi)源性腺苷通過激活A1受體抑制病理性痛。本試驗模型組犬血清腺

苷含量明顯降低，在電針刺激后局部血液組織中的腺苷含量明顯升高，說明其可能與脊髓中A1受體相結(jié)合，從而減輕疼痛反應。推測犬血清腺苷含量升高和降低與犬疼痛癥狀出現(xiàn)和減輕相關。

綜上所述，電針環(huán)跳等穴可升高骨關節(jié)炎犬血清腺苷水平，降低炎癥反應，減緩疼痛，同時電針掠草等穴也能產(chǎn)生同樣治療效果，這可能與電針改善局部血液循環(huán)、緩解炎癥狀態(tài)及局部張力、提高痛閾有關，推測電針刺激可通過調(diào)節(jié)腺苷分泌的增多和減少，使膝關節(jié)的功能得以恢復。

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