用ZBED6基因敲除豬研究心臟發(fā)育的分子機(jī)制

王丹丹，唐雨婷，馬月輝，王立剛，潘登科，蔣琳

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用ZBED6基因敲除豬研究心臟發(fā)育的分子機(jī)制

王丹丹，唐雨婷，馬月輝，王立剛，潘登科，蔣琳

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

【】ZBED6基因是一個(gè)調(diào)控肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子，為了探討 ZBED6 在心肌生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制，利用RNA Sequencing（RNA-Seq）技術(shù)比較ZBED6基因敲除巴馬小型豬（ZBED6-KO)和同日齡正常巴馬小型豬（ZBED6-WT)的心臟組織轉(zhuǎn)錄組，挖掘ZBED6基因的敲除對(duì)家豬心臟組織發(fā)育及基因表達(dá)的影響?！尽坷胻-test對(duì)ZBED6-KO豬和ZBED6-WT豬心臟組織大小的表型特征進(jìn)行顯著性分析，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)ZBED6基因的靶基因IGF2的表達(dá)量進(jìn)行定量。通過(guò)制作石蠟組織切片對(duì)心肌進(jìn)行組織學(xué)分析，比較其組織結(jié)構(gòu)的差異。提取ZBED6-KO豬和ZBED6-WT豬心臟組織的總RNA，以Illumina Hiseq 2000平臺(tái)進(jìn)行RNA-Seq分析。以豬Sus_scrofa10.2為參考序列，用轉(zhuǎn)錄組的標(biāo)準(zhǔn)流程篩選ZBED6-KO豬和ZBED6-WT豬心臟組織中的差異表達(dá)基因，對(duì)差異基因進(jìn)行GO和IPA富集分析。隨機(jī)選擇9個(gè)差異表達(dá)基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證RNA-Seq結(jié)果的可靠性?！尽縕BED6-KO豬心臟重以及IGF2表達(dá)量均顯著高于ZBED6-WT豬（＜0.05），與ZBED6-WT豬相比，ZBED6-KO豬肌纖維的寬度較寬，結(jié)締組織較少，ZBED6基因的敲除對(duì)家豬心臟的生長(zhǎng)發(fā)育有一定的促進(jìn)作用；測(cè)序結(jié)果顯示，各樣本獲得至少10 G的數(shù)據(jù)量，每個(gè)樣本clean ratio、Q30 data均達(dá)到90%以上，其中62.8%-80.1%的reads能比對(duì)到豬的基因組上，表明測(cè)序飽和度良好，測(cè)序數(shù)據(jù)真實(shí)可靠；對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選到 184個(gè)差異基因，其中上調(diào)的基因114個(gè)，下調(diào)的基因70個(gè)，注釋的141個(gè)，未注釋的43個(gè)；差異基因?qū)哟尉垲惙治鲲@示，ZBED6-KO組（x1、x3、x6）的3個(gè)個(gè)體表達(dá)模式相似，ZBED6-WT組（x2、x4、x5）的3個(gè)個(gè)體表達(dá)模式相似；GO和IPA富集分析得到13個(gè)顯著的GO條目，33條顯著的pathway通路，差異基因主要富集在免疫反應(yīng)、肌肉發(fā)育和RhoA信號(hào)等相關(guān)的通路；qRT-PCR 檢測(cè)9個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)模式與RNA-Seq分析結(jié)果一致，證實(shí)了RNA-Seq結(jié)果的可靠性?！尽渴状我訸BED6-KO巴馬小型豬為模型，利用RNA-Seq技術(shù)探究了ZBED6敲除對(duì)心臟發(fā)育和功能的影響，豐富了ZBED6 對(duì)心臟發(fā)育和功能的研究。

ZBED6；基因敲除；RNA-Seq；心肌發(fā)育；差異表達(dá)基因

0 引言

【研究意義】豬肉是人類攝取蛋白質(zhì)的第一來(lái)源，尤其對(duì)于中國(guó)而言，更是在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中有著至關(guān)重要的地位。但是中國(guó)對(duì)家豬育種改良起步比較晚，在此方面比較落后。巴馬小型豬是地方選育出來(lái)的小型豬品系，其心臟等各臟器結(jié)構(gòu)與人極為相似，因此作為重要的大動(dòng)物模型被應(yīng)用于生命科學(xué)研究，并且得到了較好的開(kāi)發(fā)利用[1]。ZBED6是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)能夠調(diào)控IGF2表達(dá)和肌肉生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)節(jié)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育等功能引起了廣泛關(guān)注[2-3]。ZBED6已經(jīng)被證明是包括人類在內(nèi)的胎盤(pán)類哺乳動(dòng)物的進(jìn)化物，并且與發(fā)育類疾病相關(guān)[3-4]。本試驗(yàn)以ZBED6基因敲除巴馬小型豬為試驗(yàn)載體，從體內(nèi)水平研究轉(zhuǎn)錄因子ZBED6在心肌中的功能，進(jìn)一步解析該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控肌肉生長(zhǎng)發(fā)育等重要生物學(xué)功能的分子機(jī)理，從而為研究相關(guān)疾病提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為瘦肉型家豬的育種改良做出貢獻(xiàn)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在家豬中，IGF2基因的內(nèi)含子3檢測(cè)到一個(gè)突變位點(diǎn)G→A，該突變導(dǎo)致骨骼肌中IGF2的表達(dá)量上調(diào)3倍，IGF2的上調(diào)對(duì)肌肉生長(zhǎng)、心臟大小以及脂肪沉淀有重要的影響[3, 5]。ZBED6在不同物種的細(xì)胞和成體水平都有一定的研究，細(xì)胞水平研究顯示，ZBED6能抑制小鼠和牛肌原細(xì)胞中IGF2的表達(dá)水平，抑制肌管的形成，最終導(dǎo)致肌肉細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育受阻[2, 6-11]；成體水平上的研究顯示，ZBED6基因的遺傳變異與綿羊的眼肌面積、尾脂重、背部肌肉厚、背最長(zhǎng)肌重等主要胴體性狀顯著相關(guān)[12]。【本研究切入點(diǎn)】目前ZBED6基因在家豬方面的研究比較缺乏，ZBED6基因影響家豬心肌發(fā)育的分子機(jī)制，目前尚未有相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本試驗(yàn)以ZBED6基因敲除巴馬小型豬為載體，對(duì)ZBED6-KO豬和ZBED6-WT豬的心臟組織進(jìn)行表型特征鑒定、組織學(xué)分析以及轉(zhuǎn)錄組水平分析，以期揭示ZBED6在心臟發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步揭示ZBED6的分子調(diào)控機(jī)制提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016—2017 年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所畜禽遺傳資源創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)中的ZBED6基因敲除（ZBED6-KO）巴馬小型豬和同日齡正常巴馬小型豬（ZBED6-WT）來(lái)自于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所大興豬場(chǎng)實(shí)驗(yàn)基地，ZBED6基因的敲除由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所潘登科課題組利用CRISPR/Cas9技術(shù)完成。

1.2 樣品采集及表型特征鑒定

對(duì)3頭ZBED6-KO豬（x1、x3、x6）和3頭ZBED6-WT豬（x2、x4、x5）進(jìn)行屠宰，稱取心臟重量，同時(shí)采集心臟組織樣品，一份置于RNA-later中，用于RNA的提??；一份于4%多聚甲醛中固定，用于組織切片的制作。

1.3 q-PCR分析IGF2在心臟組織中的相對(duì)表達(dá)量

1.3.1 心臟組織總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 使用Qiagen公司的組織RNA提取試劑盒進(jìn)行心臟組織RNA的提取，操作步驟參照該試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。將每個(gè)樣品的1 μg RNA采用TaKaRa公司的RT-PCR kit試劑盒（TaKaRa，大連，中國(guó)）進(jìn)行反轉(zhuǎn)得到cDNA。

1.3.2 定量引物的設(shè)計(jì)及合成 下載NCBI網(wǎng)站上IGF2基因mRNA序列，同時(shí)選用GAPDH作為內(nèi)參基因，利用軟件primer 5.0設(shè)計(jì)引物（表1）。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3.3 qRT-PCR 用SYBR Green Master Mix（TaKaRa，大連，中國(guó)）試劑，cDNA作為模板，利用ABI7500 實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x（Applied Biosystems, Forest City, CA, SA）對(duì)cDNA進(jìn)行基因表達(dá)分析，每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)基因（包括內(nèi)參）的3個(gè)Ct值的平均值作為該基因的平均Ct值；差異表達(dá)基因的qRT-PCR表達(dá)量計(jì)算采用2-ΔΔct方法。

1.4 石蠟組織切片的制備

將心肌組織切割成大小約1 cm3小組織塊，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，然后進(jìn)行修塊、脫水、石蠟包埋，將石蠟包埋組織作4 μm厚的連續(xù)切片，H.E染色，中性樹(shù)膠封片，切片鏡檢拍照[13]。

1.5 RNA-seq

1.5.1 總RNA提取 RNA提取方法同1.3.1，通過(guò)Agilent 2100 bioanalyzer檢測(cè)RNA的濃度和RIN值，濃度＞100 ng·μl-1，總量≥2.0 μg，且RIN值＞8.0，則可用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析。

1.5.2 RNA-seq建庫(kù)及測(cè)序 根據(jù)Illumina TruSeq RNA樣品制備試劑盒操作說(shuō)明書(shū)[14]進(jìn)行RNA-seq測(cè)序所需的cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。

嚴(yán)格按照TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS試劑盒說(shuō)明，使用cBot Cluster Generation系統(tǒng)對(duì)含有索引接頭的樣品進(jìn)行聚類。形成cluster之后在Illumina Hiseq 2500測(cè)序平臺(tái)分別對(duì)上述樣品進(jìn)行讀長(zhǎng)為125bp的雙末端測(cè)序。

1.5.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序原始數(shù)據(jù)的質(zhì)控 原始數(shù)據(jù)質(zhì)控：使用NGSQC Toolkit v2.3.3軟件對(duì)原始reads進(jìn)行過(guò)濾，去除接頭序列，reads末端的低質(zhì)量堿基（Phred質(zhì)量值＜20），以及過(guò)濾后長(zhǎng)度小于25 bp的reads。

1.5.4 測(cè)序reads的比對(duì)與拼接 reads比對(duì)與拼接：從Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)下載豬參考基因組以及基因組注釋文件。用TopHat v2.0.11軟件[15]將質(zhì)控后的clean data比對(duì)到參考基因組上。然后用Cufflink軟件[16]進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本的組裝。用Cuffmerge將所有樣本的轉(zhuǎn)錄本及參考基因組組裝成新的注釋文件，用于后續(xù)分析。

表1 本研究采用的 qRT-PCR 鑒定引物

1.5.5 差異表達(dá)基因的篩選及層次聚類分析 用Cufflink軟件的Cuffdiff包對(duì)ZBED6-KO豬和對(duì)ZBED6-WT豬心臟組織進(jìn)行差異基因分析。用FDR法進(jìn)行多重校正，篩選同時(shí)滿足FDR＜0.05和Fold change＞2的基因作為顯著表達(dá)基因。

利用R包中的聚類分析程序?qū)BED6-KO豬和ZBED6-WT豬心臟組織差異表達(dá)的基因進(jìn)行層次聚類分析[17]。

1.5.6 差異表達(dá)基因的GO和IPA富集分析 采用g：Profiler在線分析軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因GO富集分析[18]，按照富集倍數(shù)（Fold-enrichment）從小到大的原則，使用＜0.05作為顯著富集基因的閾值；將差異表達(dá)基因?qū)隝PA軟件，通過(guò)“Core Analysis”和“Enrichment Analysis”獲得pathway通路，根據(jù)-ln (-value)值的大小進(jìn)行排序，使用-ln(-value)＞1.30(＜0.05)作為顯著富集基因的閾值。

1.6 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證

隨機(jī)選取9個(gè)差異表達(dá)基因采用qRT-PCR方法，檢驗(yàn)RNA-seq結(jié)果的準(zhǔn)確性。方法同1.3。

2 結(jié)果

2.1 表型特征的鑒定結(jié)果

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如圖1所示，ZBED6-KO豬的心臟重高于ZBED6-WT豬，且差異顯著（＜0.05），由此可知ZBED6基因的敲除對(duì)家豬心臟的生長(zhǎng)發(fā)育有一定的促進(jìn)作用。

2.2 IGF2在心臟組織中的相對(duì)表達(dá)量

IGF2在ZBED6-KO豬和ZBED6-WT豬心臟組織中的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果如圖2所示，ZBED6-KO組IGF2的表達(dá)量高于ZBED6-WT組，且差異顯著（＜0.05）。

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2.3 組織學(xué)分析結(jié)果

心臟組織的H.E染色（圖3）結(jié)果表明，與ZBED6- WT豬相比，ZBED6-KO豬的肌纖維較寬，結(jié)締組織較少，說(shuō)明ZBED6的敲除在一定程度上促進(jìn)家豬心肌的發(fā)育。

??

2.4 RNA-seq 原始測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

各樣本的測(cè)序所得原始數(shù)據(jù)組成如表2所示。每個(gè)樣本測(cè)序獲得至少10 G的數(shù)據(jù)量，各樣本clean ratio和Q30 data都在90%以上。測(cè)序數(shù)據(jù)符合后續(xù)生物信息分析要求。

2.5 參考基因組比對(duì)

通過(guò)Tophat比對(duì)，mapping結(jié)果如表3，62.8%—80.1%的reads能比對(duì)到豬的基因組上，可以進(jìn)行下一步分析。

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測(cè)分析

圖3 心肌切片（H.E染色 100×）

表3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基因組比對(duì)分析

2.6 差異表達(dá)基因的篩選

本研究共鑒定到25 213個(gè)基因，以FDR＜0.05，F(xiàn)old Change＞2的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，得到184個(gè)差異基因，篩選結(jié)果如圖4所示，其中上調(diào)的基因114個(gè)，下調(diào)的基因70個(gè)，注釋的（已知）141個(gè)，未注釋的（未知）43個(gè)。

2.7 差異表達(dá)基因的聚類分析

利用ZBED6-KO豬和ZBED6-WT豬心臟組織之間的差異基因進(jìn)行聚類分析。結(jié)果如圖5所示：x4和x5首先聚在一起，然后和x2再聚在一起，x1和x3首先聚在一起，然后和x6再聚在一起。這表明ZBED6-KO組（x1、x3、x6）的3個(gè)個(gè)體表達(dá)模式更相似，ZBED6-WT組（x2、x4、x5）的3個(gè)個(gè)體表達(dá)模式更相似，證明實(shí)驗(yàn)樣品和RNA-seq數(shù)據(jù)都是可靠的。

2.8 差異表達(dá)基因的GO和IPA富集分析

對(duì)獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和通路富集分析，共富集到13個(gè)顯著的GO條目，33條顯著的pathway通路。GO term中篩選到了肌肉發(fā)育相關(guān)和免疫反應(yīng)相關(guān)等生物學(xué)進(jìn)程（表4）。根據(jù)IPA分析篩選到RhoA信號(hào)、Cdc42信號(hào)、肝纖維化、上皮連接信號(hào)、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的信號(hào)等相關(guān)的pathway通路（表5）。

圖4 差異表達(dá)基因數(shù)統(tǒng)計(jì)

圖5 184個(gè)差異表達(dá)基因的聚類結(jié)果

表4 差異基因富集的前10個(gè)GO分類

2.9 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA-seq測(cè)序得到數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選取IFIT3、MX1、ISG12(A)、P2RY1、TNNT1、MYL7、XAF1、CEL、ATP1A2共9個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，以GAPDH作為內(nèi)參基因，結(jié)果如圖6所示。RNA-seq測(cè)序得到的各樣品基因表達(dá)的FPKM值是由Reads比對(duì)數(shù)統(tǒng)計(jì)得來(lái)，qRT-PCR得到基因表達(dá)量是目的基因相對(duì)內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量，這兩種結(jié)果無(wú)法直接比較，且無(wú)法計(jì)算兩種方法得到的表達(dá)量相關(guān)性。但ZBED6-KO組和ZBED6-WT組之間的差異倍數(shù)是具有可比性的，本研究將RNA-seq得到的FPKM值進(jìn)行校正，即log2(fold_change)。因此根據(jù)兩種方法得到的差異表達(dá)倍數(shù)來(lái)計(jì)算RNA-seq和qRT-PCR之間的相關(guān)性，判斷兩種方法的結(jié)果是否一致，結(jié)果如圖6所示，qRT-PCR得到的9個(gè)基因的表達(dá)模式與RNA-seq得到的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了RNA-seq測(cè)序的準(zhǔn)確性。

表5 差異基因IPA富集前14條代謝信號(hào)通路

qRT-PCR 中的誤差線表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）

3 討論

ZBED6作為新的轉(zhuǎn)錄因子，自2009年被首次發(fā)現(xiàn)后，該基因就獲得了高度關(guān)注[2, 3]。在小鼠、肉牛、綿羊等不同物種上對(duì)ZBED6的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制以及功能進(jìn)行了不同程度的研究[2, 6-11]，但在豬上的研究仍是空白，ZBED6影響心肌生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制也不是很清楚；近年來(lái)隨著高通量測(cè)序和基因編輯技術(shù)CRISPR/ Cas9的發(fā)展及成熟，使得以轉(zhuǎn)基因豬為模型研究ZBED6的分子功能成為可能[19-21]。

前人研究顯示ZBED6基因能夠抑制IGF2的表達(dá)，IGF2表達(dá)量的上調(diào)對(duì)心肌大小有重要的影響[3]。本研究利用qRT-PCR分析IGF2在心臟組織中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，ZBED6-KO組IGF2的表達(dá)量顯著高于ZBED6-WT組，與小鼠、肉牛中的結(jié)果一致[2, 6-11, 22]；表型特征鑒定結(jié)果顯示ZBED6-KO豬的心臟比ZBED6-WT豬重，組織學(xué)分析結(jié)果顯示ZBED6的敲除使家豬心肌肌纖維變粗，結(jié)締組織減少，都說(shuō)明了ZBED6的敲除在一定程度能夠促進(jìn)家豬心臟的生長(zhǎng)發(fā)育。通過(guò) RNA-seq 測(cè)序，在ZBED6-KO豬和ZBED6-WT豬心臟組織中得到184個(gè)差異表達(dá)基因，這些基因主要參與了肌肉系統(tǒng)進(jìn)程、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、RhoA 通路及免疫反應(yīng)等與肌肉發(fā)育相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程和通路。

在肌肉發(fā)育相關(guān)途徑中的上調(diào)基因主要有：CSRP3、LMCD1、ATP1A2、TNNT1，下調(diào)基因主要有：NPPA、P2RY1、HMCN2、KCNA5、PTGER3、MYL4、MYL7，說(shuō)明ZBED6基因可能通過(guò)影響上述基因及其所在的通路調(diào)控心臟組織的發(fā)育和功能。

CSRP3是一個(gè)與心肌生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)的基因，編碼CRP3蛋白，表達(dá)與橫紋肌及與肌源性分化相關(guān)組織，因此在心肌和骨骼肌組織中特異性表達(dá)[23-25]。CSRP3的表達(dá)與肌分化過(guò)程一致，是一個(gè)肌發(fā)生的正調(diào)節(jié)因子[23-25]，并且其表達(dá)與肌分化過(guò)程一致，是一個(gè)肌發(fā)生的正調(diào)節(jié)因子[24]。細(xì)胞質(zhì)CRP3 作為支架蛋白，與α肌動(dòng)蛋白[26]、β-血影蛋白表達(dá)（t-cap）[23]及肌原纖維（Z-線）[27]相互作用，具備肌肉發(fā)育監(jiān)管的結(jié)構(gòu)特性。研究顯示，CSRP3 缺陷小鼠顯示擴(kuò)張型心肌?。―CM）特征性癥狀的心衰[24]、增生性心肌炎及心臟功能紊亂的臨床特征[24, 28]。本試驗(yàn)中CSRP3在ZBED6-KO豬心臟組織中的表達(dá)量是ZBED6-WT豬的1.96倍，推測(cè)ZBED6基因的敲除使家豬心臟組織中CSRP3 基因表達(dá)量明顯升高，促進(jìn)肌纖維和心肌的發(fā)育。

NPPA在肌肉系統(tǒng)進(jìn)程及免疫反應(yīng)等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程和通路都有富集到，該基因在人上稱為心房鈉尿肽（ANP），在心臟中表達(dá)量最高，目前已經(jīng)有研究顯示，ANP在拮抗心臟肥大、減弱心肌收縮、利鈉和利尿、血管舒張和重塑、脂類代謝等方面有重要作用[29-30]。ANP通過(guò)拮抗心臟成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-H（TGF-h），進(jìn)而抑制心肌纖維化和肥大。ANP通過(guò)與心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合，引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)一磷酸鳥(niǎo)苷（cGMP）水平上調(diào)，抑制外源性Ca2+內(nèi)流和肌漿網(wǎng)Ca2+釋放，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+減少導(dǎo)致血管擴(kuò)張和減弱心肌收縮[31]。NPPA在ZBED6-WT豬心臟組織中表達(dá)量是ZBED6-KO豬的8.56倍，推測(cè)ZBED6基因的敲除導(dǎo)致家豬NPPA表達(dá)量明顯降低，從而促進(jìn)心臟組織心肌的發(fā)育及收縮。

RhoA作為信號(hào)分子開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)一系列生物學(xué)功能，具有調(diào)控細(xì)胞骨架重排、誘導(dǎo)心肌肥厚、心肌細(xì)胞分化和血管平滑肌肥大等功能[32-33]，其中MYL7、MYL4、CDC42EP2是RhoA通路中的關(guān)鍵基因。MYL7、MYL4都屬于肌球蛋白（心肌收縮蛋白），在心臟發(fā)育和收縮功能中起著至關(guān)重要的作用，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖分化[34]。Cdc42 是一個(gè)由CDC42EP2基因編碼，與腎素相關(guān)的小G蛋白，在心臟、肝臟、腫瘤組織、胰腺中均有表達(dá)，Cdc42主要促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和增殖，通過(guò)控制肌動(dòng)蛋白的骨架重組來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架[35-36]。在小鼠中發(fā)現(xiàn)，將其神經(jīng)脊細(xì)胞Cdc42 特異性敲除時(shí)，可以引起細(xì)胞骨架的重構(gòu)受阻，而且細(xì)胞的遷移也變得緩慢[37]；在Cdc42 敲除小鼠中發(fā)現(xiàn)Cdc42 對(duì)肌動(dòng)蛋白絲狀偽足的形成以及遷移功能具有重要的調(diào)節(jié)作用，Cdc4在 AngiotensinⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大模型中有促肥大的作用[38-39]。本試驗(yàn)中MYL7和MYL4在ZBED6-KO豬心臟組織中的表達(dá)量均顯著低于ZBED6-WT豬，與前人研究以及ZBED6-KO豬心臟重高于ZBED6-WT豬的表型鑒定結(jié)果不一致；CDC42EP2在ZBED6-KO豬心臟組織中的表達(dá)量是ZBED6-WT豬的2.16倍，推測(cè)ZBED6基因的敲除導(dǎo)致家豬CDC42EP2表達(dá)量明顯上調(diào)，CDC42EP2通過(guò)編碼Cdc42 蛋白，從而促進(jìn)家豬心臟的生長(zhǎng)發(fā)育，與前人研究結(jié)果一致；MYL7、MYL4、CDC42EP2基因表達(dá)量的變化說(shuō)明ZBED6基因敲除對(duì)心臟發(fā)育和功能的影響較為復(fù)雜，其調(diào)控機(jī)制需進(jìn)一步研究。

差異基因富集分析顯示，ZBED6基因敲除后影響了家豬免疫反應(yīng)相關(guān)的生物學(xué)進(jìn)程，富集到的主要基因有MYH6、OAS1和OAS2。2-5'寡腺苷合成酶OAS是細(xì)胞內(nèi)的抗病毒蛋白，在哺乳動(dòng)物先天性免疫系統(tǒng)中有重要作用[40-41]。研究顯示，豬源OAS1和OAS2蛋白能抑制腦炎病毒在細(xì)胞中的增殖活性，而且能有效抑制子代病毒感染細(xì)胞，抑制子代病毒的增殖，降低子代病毒的數(shù)量，具有顯著抑制病毒感染細(xì)胞的生物學(xué)特性[41-42]。本試驗(yàn)中OAS1、OAS2在ZBED6-KO豬心臟組織中的表達(dá)量分別是ZBED6-WT豬的2.21倍、2.29倍，推測(cè)ZBED6基因的敲除導(dǎo)致家豬OAS1、OAS2表達(dá)量上調(diào)，能夠增強(qiáng)家豬抗病毒的能力。

按照功能將組成心臟的蛋白分為收縮蛋白和調(diào)節(jié)蛋白，其中肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白屬于收縮蛋白，原肌球蛋白和肌鈣蛋白屬于調(diào)節(jié)蛋白[43]。MYH6是肌球蛋白重鏈，對(duì)心肌肥厚和心肌病有著重大影響[44]。有研究表明，在肥厚性心肌病和擴(kuò)張性心肌病人體中MYH6的表達(dá)量下調(diào)1.74和2.88倍[44]；本試驗(yàn)中，MYH6在ZBED6-KO豬心臟組織中的表達(dá)量均低于ZBED6-WT豬，這可能是導(dǎo)致ZBED6-KO豬心臟重量高于ZBED6-WT豬的重要原因。

4 結(jié)論

與ZBED6-WT豬相比，敲除ZBED6基因顯著提高了家豬心臟重量，引發(fā)心臟組織發(fā)育的關(guān)鍵基因IGF2的表達(dá)量顯著升高，心肌肌纖維變粗，結(jié)締組織減少。RNA-Seq結(jié)果顯示ZBED6基因敲除巴馬小型豬和正常巴馬小型豬共篩選到184個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因114個(gè)，下調(diào)基因70個(gè)；差異表達(dá)基因的GO分析和IPA富集分析顯示肌肉發(fā)育、免疫反應(yīng)、RhoA信號(hào)和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的信號(hào)等相關(guān)的通路被顯著富集到。因此，ZBED6基因可能通過(guò)上述生物學(xué)過(guò)程和通路影響了心臟組織的發(fā)育和功能。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Studying the Molecular Mechanism of Heart Development by Using ZBED6 Gene Knockout Pig

WANG DanDan, TANG YuTing, MA YueHui, WANG LiGang, PAN DengKe, JIANG Lin

(Beijing Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193)

【】The ZBED6 gene is a transcription factor that regulates muscle growth and development. In order to investigate the regulatory mechanism of ZBED6 in myocardium growth and development, this study was designed to compare the transcriptome of cardiac tissue obtained from Bama miniature pig between the ZBED6 knockout group (ZBED6-KO) and the wild type group (ZBED6-WT) and to find out the effect of ZBED6 gene knockout on the development and gene expression profile of pig heart tissue. 【】The phenotypic characteristics of ZBED6-KO and ZBED6-WT pig tissues were analyzed by t-test and the expression level of the target gene IGF2 of the ZBED6 gene was quantified by real-time quantitative PCR (q-PCR). Comparing the differences in histological level of tissue structure were performed by paraffin section method. The total RNA was isolated from ZBED6-KO group and ZBED6-WT group. RNA-Seq analysis was performed on Illumina Hiseq 2000 platform. The differentially expressed genes between ZBED6-KO and ZBED6-WT heart tissues were screened by the method of RNA-Seq Pig Sus_scrofa10.2 was used as the reference sequence. Differentially expressed genes were enriched and analyzed with IPA software. 9 differentially expressed genes were randomly selected to verify the reproducibility of RNA-Seq results by q-PCR. 【】The heart of ZBED6-KO pig had a larger measured data in weight than ZBED6-WT, which also had a higher expression profile of IGF2 than the latter. Compared with ZBED6-WT pig, ZBED6-KO pig had wide muscle fiber width and less connective tissue. The results suggested that the knockout of ZBED6 gene could promote the growth and development of porcine heart. The sequencing results showed that at least 10 G data were obtained and the clean ratio, Q30 data were more than 90%, of which 62.8% -80.1% of the reads mapped to the pig genome. All of these indicated sequencing was well saturation and the sequencing data was reliable. By analyzing sequencing data, 184 different genes were indicated which contained 114 up-regulated genes and 70 down-regulated genes. Among the 184 genes, there were 141 intact function annotation genes and 43 non-annotated genes. Differential gene hierarchical clustering analysis showed that, the similar expression pattern was detected in ZBED6-KO group (x1, x3, x6), which was also happen to ZBED6-WT group (x2, x4, x5). GO and IPA enrichment analysis obtained 13 significant GO terms, 33 pathways. The difference gene was mainly enriched in the immune response, muscle development, RhoA signal and other related channels. The expression pattern of 9 differentially expressed genes was consistent with the results of RNA-Seq analysis. 【】In this study, ZBED6-KO Bama miniature pig was first time to use as the model. We used RNA-Seq technique to explore the effects of ZBED6 gene knockout on cardiac development, which enriched the research of ZBED6 on myocardium development and function.

ZBED6; gene knockout; RNA-Seq; myocardial development; differentially expressed genes

2017-09-01；

2018-01-05

北京市自然科學(xué)基金（6164040）

王丹丹，Tel：13051379070；E-mail：2462568500@qq.com。

潘登科，Tel：13911961972；E-mail：pandengke2002@163.com。通信作者蔣琳，Tel：18612147071；E-mail：jianglin@caas.cn