過量表達(dá)RdreB1BI對草莓果實(shí)品質(zhì)及相關(guān)基因的影響

閻依超，萬春雁，古咸彬，郭成寶，陳月紅，高志紅

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過量表達(dá)對草莓果實(shí)品質(zhì)及相關(guān)基因的影響

閻依超1，萬春雁2，古咸彬1，郭成寶3，陳月紅3，高志紅1

（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，南京 210095；2江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇鎮(zhèn)江 212400；3南京市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，南京 210000）

【】研究外源基因轉(zhuǎn)入對‘紅頰’草莓果實(shí)品質(zhì)及相關(guān)基因表達(dá)的影響，揭示在草莓果實(shí)品質(zhì)調(diào)控中的作用及分子機(jī)理?！尽恳?個(gè)轉(zhuǎn)株系及非轉(zhuǎn)基因‘紅頰’草莓全紅期果實(shí)為材料，測定果實(shí)縱橫徑、單果重、可溶性糖、可溶性蛋白、抗壞血酸等風(fēng)味物質(zhì)及花青苷、總黃酮、總酚等著色物質(zhì)的含量。應(yīng)用BLASTn、GENEFINDER和PlantCARE等生物信息學(xué)方法分析外源基因和7個(gè)次生代謝產(chǎn)物合成途徑相關(guān)基因（、、、、、、和）的結(jié)構(gòu)，并預(yù)測基因啟動(dòng)子作用元件。采用qRT-PCR定量法檢測相關(guān)基因表達(dá)量，應(yīng)用7300 system軟件和2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。對生理生化及分子數(shù)據(jù)進(jìn)行方差及相關(guān)性分析，綜合討論的轉(zhuǎn)入對‘紅頰’草莓果實(shí)品質(zhì)及相關(guān)基因表達(dá)的影響?！尽哭D(zhuǎn)基因‘紅頰’草莓株系與野生型果實(shí)單果重的范圍為11.75—15.42 g，縱徑和橫徑的范圍分別為35.12—40.42 mm及28.73—32.6 mm，僅株系8果實(shí)縱徑顯著大于株系7，其余指標(biāo)間差異不顯著。其中轉(zhuǎn)基因株系1和7的花青苷含量顯著高于野生型；轉(zhuǎn)基因株系1、7及8總黃酮含量顯著高于野生型；各轉(zhuǎn)基因株系的總酚含量均顯著高于野生型。轉(zhuǎn)基因株系1、7和8果實(shí)的可溶性糖含量顯著高于野生型（21.70 mg·g-1FW），分別為野生型的2.87、3.39和3.35倍。可溶性固形物含量與可溶性糖含量呈正相關(guān)（=0.811*），但樣品果實(shí)的可溶性固形物含量間不存在顯著性差異。轉(zhuǎn)基因株系草莓成熟果實(shí)果肉中氨基酸含量為0.2580—0.3950 g/100 g FW，野生型果實(shí)的氨基酸含量為0.5151 g/100 g FW，顯著高于各轉(zhuǎn)基因株系草莓果實(shí)；轉(zhuǎn)基因株系1和7的可滴定酸含量顯著高于野生型；轉(zhuǎn)基因株系1果實(shí)的抗壞血酸含量為168.35 mg/100 g FW，顯著高于野生型（92.50 mg/100 g FW）。轉(zhuǎn)基因株系9及10果實(shí)的可溶性蛋白含量分別為25.97和25.86 mg·g-1FW，顯著高于野生型（22.93 mg·g-1FW）。（cinnamoyl-CoA reductase 2-like）和（myb-related protein 306）在各轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)量顯著高于野生型。分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因啟動(dòng)子區(qū)域包含多種高等植物順勢調(diào)控元件，主要有對真核生物起增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄效率的CAAT-box和核心啟動(dòng)子元件TATA-box。同時(shí)還包含G-Box、G-box、MBS、ARE、5UTR Py-rich stretch等能影響各基因?qū)獾捻憫?yīng)、在苯丙烷代謝途徑中起調(diào)節(jié)作用的順式作用元件。【】調(diào)控相關(guān)基因參與轉(zhuǎn)化體果實(shí)發(fā)育和成熟，提高光的有效性，活化黃酮類生物合成通路關(guān)鍵基因，差異基因中均包含大量光誘導(dǎo)響應(yīng)元件，及的表達(dá)促進(jìn)了總黃酮、酚類物質(zhì)及花青苷等次生代謝物的合成。轉(zhuǎn)入使草莓果實(shí)的多項(xiàng)營養(yǎng)成分和著色物質(zhì)含量顯著增加，改善了草莓的果實(shí)品質(zhì)。

草莓；；過量表達(dá)；果實(shí)品質(zhì)；啟動(dòng)子

0 引言

【研究意義】草莓（Duch）為薔薇科（Rosaceae）草莓屬（）多年生草本植物，分布范圍較廣，果實(shí)營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高。在溫度較低的冬春季節(jié)，低溫是制約其產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素，草莓能否安全越冬及培育耐寒品種是生產(chǎn)上急需解決的問題[1]。轉(zhuǎn)擬南芥的研究中，成功培育出具抗寒特性的轉(zhuǎn)基因株系[2]。但耐寒品種除了要增強(qiáng)其抗寒性外，還需要保持果實(shí)原有的品質(zhì)。果實(shí)色澤，是外觀品質(zhì)重要指標(biāo)之一，且著色程度與果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)密切相關(guān)。影響著色的物質(zhì)主要有花青苷、黃酮類化合物和酚類物質(zhì)，色素的積累是色澤形成的基礎(chǔ)。其中花青苷的積累水平能夠評價(jià)果實(shí)品質(zhì)及成熟度，還能提供有益健康的元素，具有營養(yǎng)藥理價(jià)值[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】CBF/DREB轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族，通常認(rèn)為其能識(shí)別并結(jié)合順式作用元件，參與對低溫、高鹽和干旱等的分子應(yīng)答。近年來也有研究指出，番茄中的過量表達(dá)能夠誘導(dǎo)果實(shí)成熟相關(guān)基因的表達(dá)，如、、等果實(shí)軟化相關(guān)基因、和等色素合成相關(guān)基因，并且調(diào)控果實(shí)發(fā)育和植物生長代謝[4]。將HB柚中的在番茄（）中超表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，35S-line5和35S-line19果實(shí)大小及單果重顯著小于野生型，且轉(zhuǎn)基因株系果實(shí)中有機(jī)酸、糖類和脂肪酸含量顯著高于野生型番茄的含量，表明在果實(shí)成熟過程中起調(diào)控初生代謝物含量的重要作用[5]。研究香蕉（）后發(fā)現(xiàn)，、、及在香蕉果實(shí)成熟過程中起調(diào)控作用，在乙烯誘導(dǎo)成熟香蕉中、、及的表達(dá)量都隨著乙烯量的增加、果實(shí)成熟而不斷升高[6]。甜瓜中的能與識(shí)別并結(jié)合GCCGAC序列，意味著DREB轉(zhuǎn)錄因子能夠通過調(diào)節(jié)乙烯生物合成來調(diào)控乙烯形成[7]。將油椰子（）中轉(zhuǎn)入番茄中發(fā)現(xiàn)，果實(shí)中該基因的表達(dá)與乙烯、脫落酸合成及果實(shí)成熟相關(guān)[8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】大量研究表明，DREB轉(zhuǎn)錄因子能夠提高植物對非生物逆境的抗性，但其轉(zhuǎn)入后對轉(zhuǎn)基因草莓果實(shí)的影響鮮有研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以草莓品種‘紅頰’及其轉(zhuǎn)株系為試材，對全紅期的成熟果實(shí)中酚類物質(zhì)、總黃酮、花青苷含量等著色物質(zhì)及可溶性固形物、可溶性糖、維生素C含量、可滴定酸等風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，并對轉(zhuǎn)錄水平下差異基因的表達(dá)及差異基因的啟動(dòng)子進(jìn)行初步研究，為調(diào)控草莓果實(shí)品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年1—4月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為通過潮霉素抗性篩選及分子檢測的轉(zhuǎn)水稻草莓株系[9]及‘紅頰’草莓。采收全紅期（轉(zhuǎn)紅著色面積達(dá)到100%）轉(zhuǎn)株系及‘紅頰’草莓果實(shí)各10個(gè)，去除果皮及種子，取65 g混合均勻的皮下2 mm厚果肉，根據(jù)各試驗(yàn)用量分裝后液氮速凍，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫▓D1）。

圖1 野生型及轉(zhuǎn)RdreB1BI‘紅頰’草莓全紅期果實(shí)

1.2 果實(shí)大小及單果重的測定

隨機(jī)選取10個(gè)全紅期草莓果實(shí)，用天平稱單果重，用手持式游標(biāo)卡尺測出縱、橫徑，并記錄數(shù)據(jù)。

1.3 花青苷含量的測定

參照Wrolstadde[10]的方法，用pH差示法測定花青苷含量，取5 g速凍樣品，重復(fù)取樣3次，分別加入10 mL 1% HCl研磨，沖洗研缽并定容至25 mL，12 000 r/min離心20 min，取上清至25 mL容量瓶，浸提至無色過濾后取濾液，定容至25 mL避光待測。分別用緩沖溶液和一水檸檬酸及十二水合磷酸氫二鈉緩沖溶液混勻反應(yīng)完全后，在510 nm波長下測定光密度值，重復(fù)測定3次。

1.4 氨基酸含量的測定

參照楊遠(yuǎn)帆等[11]的方法并稍作修改，用茚三酮法測定氨基酸含量，取1 g速凍樣品，重復(fù)取樣3次，分別加入5 mL 80%乙醇研磨，80℃水浴浸提30 min，冷卻后10 000 r/min離心30 min，沉淀加入80%乙醇重復(fù)上述操作，提取液用80%乙醇定容至25 mL。取1 mL于10 mL刻度試管中，加2 mL含茚三酮的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液及7 mL蒸餾水混勻，80℃水浴30 min，冷卻后用蒸餾水定容至15 mL，以蒸餾水為對照，在570 nm波長下測定光密度值。

1.5 總酚含量的測定

參考DJERIDANE等[12]的方法并稍作修改，取1.5 g速凍樣品，重復(fù)取樣3次，分別加入10 mL 80%乙醇及1 mL 10%三氯酸研磨，勻漿轉(zhuǎn)入15 mL容量瓶，用80%乙醇定容靜置30 min。過濾后吸取1 mL濾液，加5 mL蒸餾水試劑，1 mL FC顯色劑及3 mL 7.5%碳酸鈉溶液，混勻，常溫靜置2 h后，以蒸餾水為對照，在765 nm波長下測定光密度值，以沒食子酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其含量，單位為mg?g-1。

1.6 總黃酮含量的測定

參照藥典[13]的方法并改進(jìn)，取2 g速凍樣品，重復(fù)取樣3次，分別加入16 mL 95%乙醇研磨，浸提后過濾，取1 mL濾液置10 mL試管，用70%乙醇補(bǔ)至5 mL，然后分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，混勻放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，混勻放置6 min，再加4% NaOH溶液2 mL，混勻放置10 min后，以蒸餾水為對照，在510 nm波長下測定光密度值。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其含量，單位為mg?g-1。

1.7 可溶性糖、可溶性蛋白及可溶性固形物含量的測定

蒽酮比色法測定可溶性糖含量[14]，考馬斯亮藍(lán)G-250法測定可溶性蛋白質(zhì)含量[14]，阿貝折射儀測定果實(shí)可溶性固形物含量。

1.8 總酸及抗壞血酸含量的測定

采用2,6-二氯酚靛酚滴定法測定抗壞血酸含量，采用NaOH滴定法測定總酸含量[14]。

1.9 轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)基因分析

1.9.1 總RNA的提取及cDNA的合成 取全紅期轉(zhuǎn)株系及‘紅頰’草莓果實(shí)，采用改良CTAB法[14]提取草莓果實(shí)RNA。cDNA合成根據(jù)qPCR RT試劑盒（TaKaRa）說明書進(jìn)行。將合成的cDNA用TE緩沖液稀釋到統(tǒng)一濃度后，保存至-20℃冰箱備用。

1.9.2 轉(zhuǎn)錄水平差異基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR分析 在對轉(zhuǎn)基因株系果實(shí)及野生型‘紅頰’草莓果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析后，得到6個(gè)差異表達(dá)基因[9]。以轉(zhuǎn)基因草莓株系及未轉(zhuǎn)基因草莓果實(shí)cDNA為模板，以草莓保守作為內(nèi)參基因[15]，為目的基因，轉(zhuǎn)錄水平差異基因?yàn)榇郎y基因，分別設(shè)計(jì)引物。外源及內(nèi)參基因的熒光定量引物見表1。

采用熒光定量PCR法測定基因表達(dá)量，PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板（50 ng?μL-1）1 μL，SYBR? Premix Ex Taq?（TaKaRa）10 μL，上、下游引物（10 mmol?μL-1）各0.2 μL，RNase Free ddH2O加至20 μL。每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火20 s，72℃延伸40 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，在60℃進(jìn)行熒光信號(hào)采集，繪制溶解曲線。數(shù)據(jù)分析采用7300 system軟件和2-△△Ct方法。

1.10 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016計(jì)算試驗(yàn)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及平均值，并用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，在＜0.05水平及＜0.01水平對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，Tukey HSD多重比較和相關(guān)性分析，所有試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.11 啟動(dòng)子序列分析

根據(jù)已知的差異表達(dá)基因，在草莓?dāng)?shù)據(jù)庫中通過BLAST找到該基因ATG前約2 000 bp左右的片段，再利用GENEFINDER、PlantCARE等網(wǎng)站對序列進(jìn)行預(yù)測分析，預(yù)測該片段是否為啟動(dòng)子區(qū)域，以及啟動(dòng)子可能包含的順式作用元件。

表1 熒光定量引物設(shè)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 RdreB1BI表達(dá)對果實(shí)大小的影響

如表2所示，各轉(zhuǎn)基因‘紅頰’草莓株系與野生型果實(shí)單果重的范圍為11.75—15.42 g，縱徑和橫徑的范圍分別為35.12—40.42 mm及28.73—32.6 mm，僅株系8果實(shí)縱經(jīng)顯著大于株系7，其余指標(biāo)間差異不顯著。

表2 野生型與轉(zhuǎn)基因各株系草莓果實(shí)大小指標(biāo)

同列中不同字母表示處理間差異顯著（＜0.05）。下同

Different letters in the same column are significantly different at＜0.05. The same as below

2.2 RdreB1BI表達(dá)對著色物質(zhì)的積累

如表3所示，株系1及7全紅期果實(shí)果肉的花青苷含量分別為100.74、104.09 μg?g-1，顯著高于野生型；株系1、7及8總黃酮含量分別為788.30、921.97和1 040.22 μg?g-1，顯著高于野生型；各株系的總酚含量顯著或極顯著高于野生型，分別為10.87、8.66、9.17、5.26及5.38 mg?g-1（＜0.05及＜0.01）。

隨著果實(shí)的生長發(fā)育，在全紅期時(shí)，花青苷累積至一定程度后，其合成速率下降，并且底物開始轉(zhuǎn)化合成酚類物質(zhì)和總黃酮，而總黃酮同時(shí)也在酶的催化下作用，不斷轉(zhuǎn)化形成花青苷。較高的酚類物質(zhì)及總黃酮含量，能夠延緩果實(shí)的衰老。

2.3 RdreB1BI表達(dá)對風(fēng)味物質(zhì)的積累

如表4所示，各轉(zhuǎn)基因株系草莓成熟果實(shí)果肉中可溶性固形物、可溶性糖含量的范圍分別為7.53%—11.53%和17.51—73.6 mg?g-1FW，轉(zhuǎn)基因株系1和7的可溶性固形物含量顯著高于株系10，轉(zhuǎn)基因株系1、7及8可溶性糖含量為62.35、73.6和72.8 mg?g-1FW，顯著高于野生型的21.70 mg?g-1FW，為野生型的2.87、3.39和3.35倍，其中轉(zhuǎn)基因株系7可溶性糖的含量最高（＜0.05）。可溶性固形物含量與可溶性糖含量之間的相關(guān)系數(shù)為0.811，且其在雙側(cè)顯著性0.05上顯著，因此可溶性固形物含量與可溶性糖含量之間存在顯著正相關(guān)性。

表3 野生型和轉(zhuǎn)基因株系草莓果實(shí)中色素含量

同列中不同大寫字母表示處理間差異極顯著（＜0.01）

Different capital letters in the same column are extremely significant difference at＜0.01

各轉(zhuǎn)基因株系草莓成熟果實(shí)果肉的氨基酸含量為0.2580—0.3950 g/100 g FW，野生型果實(shí)的氨基酸含量為0.5151 g/100 g FW，顯著高于各轉(zhuǎn)基因株系草莓果實(shí)，分別為其1.3、1.43、1.33、1.82和2倍；樣品果肉的可滴定酸及抗壞血酸含量分別在0.7595%—1.1333%和92.50—168.35 mg/100 g FW，轉(zhuǎn)基因株系1、7的可滴定酸含量為1.1333%和1.0664%，顯著高于野生型的0.8147%；轉(zhuǎn)基因株系1的抗壞血酸含量為168.35 mg/100 g FW，顯著高于野生型的92.50 mg/100 g FW，且各轉(zhuǎn)基因株系果實(shí)的抗壞血酸含量分別為野生型的1.82、1.26、1.23、1.21和1.35倍，其中轉(zhuǎn)基因株系1的可滴定酸及抗壞血酸含量最高（＜0.05）。

進(jìn)一步對供試樣品中可溶性蛋白含量進(jìn)行檢測，分析后發(fā)現(xiàn)各轉(zhuǎn)基因株系草莓成熟果實(shí)果肉 中可溶性蛋白含量在轉(zhuǎn)基因株系9及10果實(shí)的含量分別為25.97和25.86 mg?g-1FW，顯著高于野生型（＜0.05）。

表4 野生型和轉(zhuǎn)基因株系草莓果實(shí)中營養(yǎng)成分含量

2.4 RdreB1BI及轉(zhuǎn)錄差異基因表達(dá)分析

利用qRT-PCR技術(shù)對及轉(zhuǎn)錄差異基因在全紅期果實(shí)中的表達(dá)情況進(jìn)行分析（圖2）。結(jié)果表明，與野生型相比，在各株系轉(zhuǎn)基因草莓果實(shí)中的表達(dá)量顯著高于野生型，分別為野生型的263.9、233.3、386.9、153.3和58.53倍（圖2-Ⅰ）。

研究發(fā)現(xiàn)，外源的轉(zhuǎn)入，調(diào)控了一系列與成熟、代謝、色素合成、花芽分化等相關(guān)的基因表達(dá)。為進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)入‘紅頰’草莓后，對其果實(shí)發(fā)育的調(diào)控作用，對轉(zhuǎn)錄組分析差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。（cinnamoyl-CoA reductase 2-like）在各轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)量分別為野生型的8.798、3.305、5.071、1.557和2.522倍，株系1及8與野生型存在顯著差異（圖2-Ⅱ）。（myb- related protein 306）在株系1、8、9及10的表達(dá)量顯著高于野生型，表達(dá)量分別為野生型的1.674、1.862、4.279、1.735倍（圖2-Ⅲ）。轉(zhuǎn)基因株系8的全紅期果實(shí)中（cinnamate-4- hydroxylase）表達(dá)為野生型的2.127倍，差異顯著（圖2-Ⅳ）。（dihydroflavonol 4-reductase）在野生型果實(shí)中的表達(dá)顯著高于株系1、9及10（圖2-Ⅴ）；（WD repeat-containing protein LWD1-like）、（naringenin, 2-oxoglutarate 3-dioxygenase）和（probable glutathione S-transferase）在野生型果實(shí)中的表達(dá)顯著高于各株系（圖2-Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ）。

2.5 轉(zhuǎn)錄差異表達(dá)基因啟動(dòng)子初步分析

根據(jù)二倍體草莓參考基因組數(shù)據(jù)庫，預(yù)測差異表達(dá)基因的啟動(dòng)子序列，運(yùn)用PlantCARE（http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對差異表達(dá)基因啟動(dòng)子區(qū)域調(diào)控元件進(jìn)行分析。如表5所示，發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子區(qū)域包含多種高等植物順勢調(diào)控元件，主要有對真核生物起增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄效率的CAAT-box和核心啟動(dòng)子元件TATA-box。同時(shí)還包含在基因轉(zhuǎn)錄過程中起重要調(diào)節(jié)作用的順式作用元件G-Box、G-box、MBS、ARE、5UTR Py-rich stretch，影響各基因?qū)獾捻憫?yīng)，在苯丙烷代謝途徑中起調(diào)節(jié)作用。

運(yùn)用Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/）對起始密碼子上游長度為1 500 bp的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明，除含有核心啟動(dòng)子元件CAAT-box和TATA-box元件外，還包含3個(gè)ARE抗氧化反應(yīng)元件、1個(gè)AT-rich element ATBP-1結(jié)合相關(guān)元件、1個(gè)CAT-box分生組織特異性元件、1個(gè)CGTCA-motif茉莉酸響應(yīng)有關(guān)的順式調(diào)節(jié)元件、2個(gè)GARE-motif 赤霉素響應(yīng)元件、1個(gè)GC-motif厭氧反應(yīng)順式作用元件、3個(gè)MBS干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件，MYB結(jié)合位點(diǎn)、1個(gè)Skn-1_motif胚乳表達(dá)所需元件、1個(gè)TC-rich repeats防御與脅迫響應(yīng)元件、1個(gè)TGA-element生長素響應(yīng)元件、1個(gè)TGACG-motif茉莉酸甲酯響應(yīng)及大量光響應(yīng)元件等多種順式作用元件。對啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，其包含大量與相同的元件外，還存在1個(gè)RY-element種子特異性表達(dá)元件、1個(gè)5UTR Py-rich stretch高水平轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及Box 4、Box I、I-box、as-2-box等保守光調(diào)控及光感應(yīng)順式作用元件（表5）。

圖2 RdreB1BI及轉(zhuǎn)錄差異基因的相對表達(dá)量

3 討論

極低的乙烯釋放量能夠催化草莓果實(shí)中花青苷的合成，增加總糖含量，并調(diào)控果實(shí)成熟進(jìn)程中風(fēng)味、質(zhì)地、色澤等果實(shí)品質(zhì)[16-17]。已有研究表明，DREB轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)節(jié)乙烯生物合成來調(diào)控乙烯形成。本研究結(jié)果表明，表達(dá)量和總黃酮、總酚、花青苷、可溶性固形物及可溶性糖含量呈正相關(guān)，說明在轉(zhuǎn)化體中的表達(dá)能夠調(diào)控果實(shí)品質(zhì)，與前人研究結(jié)果一致。

表5 差異表達(dá)基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件序列、來源、特性及分布

的表達(dá)可能促進(jìn)植物體內(nèi)酚類物質(zhì)和木質(zhì)素的合成，增強(qiáng)植物抵御生物與非生物脅迫的能力[18-20]。轉(zhuǎn)基因楊樹中下調(diào)能夠通過調(diào)控可發(fā)酵糖的含量來促進(jìn)木質(zhì)生長[21]。高粱中比更能激活對香豆酰-輔酶A產(chǎn)生木質(zhì)素以抵御病菌脅迫，提高植株對生物逆境的抗性[22]。玉米突變體中木質(zhì)素單體與阿魏酸結(jié)合形成木質(zhì)素，并提供生物燃料底物[23]。在擬南芥[24]、三葉草[25]、洋蔥[26]、蘋果[27]等植物的研究中發(fā)現(xiàn)，R2R3-MYB蛋白中的Sg6亞家族能夠激活花青苷結(jié)構(gòu)基因，調(diào)控合成并積累花青苷[28-29]。轉(zhuǎn)大豆煙草中的類黃酮含量顯著增加[30-31]。R2R3-MYB蛋白中的Sg4亞家族中，超表達(dá)蘋果煙草中花青苷及總黃酮的合成受到催化，花色變深[32]。草莓中研究較少，煙草的表達(dá)與程序性細(xì)胞死亡相關(guān)，其可能阻止程序性細(xì)胞死亡并協(xié)調(diào)植株對非生物逆境的抗性[33]。金魚草中能夠激活、和啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄[34]。有研究指出，的表達(dá)參與調(diào)控了諸如花青苷合成等生理代謝[35]。是木質(zhì)素合成途徑的上游基因，是木質(zhì)素合成途徑的下游基因[36]。和在成熟期‘麗江山荊子’果肉中表達(dá)量最低[37]。由本研究可知，轉(zhuǎn)草莓全紅期果實(shí)中、及表達(dá)量顯著低于野生型，與總黃酮、總酚類及花青苷含量存在相關(guān)性；和的表達(dá)顯著高于野生型，且分別與總黃酮、總酚類及花青苷含量呈正相關(guān)（=0.584，0.921*，0.704；=0.310，0.585，0.314）。花青苷合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因在野生型、轉(zhuǎn)基因株系7和8全紅期果實(shí)中的表達(dá)量顯著高于株系1、9和10，但株系1的花青苷含量卻顯著高于株系8及野生型。在蘋果果皮[38]和荔枝果皮[39]的研究中發(fā)現(xiàn)，活性與花青苷的積累趨勢不一致。本研究相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)草莓株系中的表達(dá)量與花青苷含量呈正相關(guān)（=0.249），但不存在顯著性，說明果實(shí)花青苷的含量與活性沒有密切關(guān)系?；ㄇ嘬蘸铣上嚓P(guān)結(jié)構(gòu)基因在野生型全紅期果實(shí)中的表達(dá)量顯著高于轉(zhuǎn)基因株系，但野生型的花青苷含量卻顯著低于轉(zhuǎn)基因株系。獼猴桃中的表達(dá)變化與果皮著色趨勢不具有一致性，的表達(dá)與著色存在對應(yīng)關(guān)系，可見在花青素合成途徑中同一催化酶可能存在不同轉(zhuǎn)錄本[40]。本研究中的表達(dá)量與總黃酮、總酚和花青苷含量呈負(fù)相關(guān)。這些調(diào)控差異說明，次生代謝物合成過程具有復(fù)雜的機(jī)制，同家族不同基因在功能上存在差異，具體影響有待進(jìn)一步研究，由此推測轉(zhuǎn)基因植株中的花青素苷的合成與和不存在顯著相關(guān)性。

從本研究可知，轉(zhuǎn)基因株系中包含大量光誘導(dǎo)響應(yīng)元件的及上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)了碳水化合物的吸收，提高了果實(shí)中可溶性糖含量。黃酮類生物合成和光合作用通路是果實(shí)著色過程中主要的影響因子[41]，含大量光誘導(dǎo)響應(yīng)元件基因的表達(dá)促進(jìn)相關(guān)物質(zhì)合成，使轉(zhuǎn)草莓果實(shí)的風(fēng)味物質(zhì)含量及色澤品質(zhì)優(yōu)于野生型。說明外源的轉(zhuǎn)入能夠提高光的有效性，活化及的表達(dá)，以促進(jìn)著色物質(zhì)在果實(shí)中的形成及積累，與前人研究一致。已有研究表明DREB轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控乙烯形成，催化初生及次生代謝物的合成，并且光照還能進(jìn)一步影響可溶性蛋白、糖、抗壞血酸等初生代謝物合成。乙烯可能與光一同調(diào)控增加了轉(zhuǎn)果實(shí)中可溶性糖、花青苷等風(fēng)味、色澤物質(zhì)含量。調(diào)控相關(guān)基因參與轉(zhuǎn)化體發(fā)育和成熟的進(jìn)程，為深入揭示功能及草莓果實(shí)成熟調(diào)控的因子及分子機(jī)理提供了理論參考。

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)株系與野生型草莓果實(shí)的花青苷、總黃酮及總酚含量存在顯著差異。可溶性固形物含量與可溶性糖含量成正比，轉(zhuǎn)基因株系果實(shí)的可溶性糖含量顯著高于野生型。轉(zhuǎn)基因株系草莓成熟果實(shí)果肉的氨基酸含量顯著高于轉(zhuǎn)基因株系；轉(zhuǎn)基因株系1和7果實(shí)的可滴定酸含量、轉(zhuǎn)基因株系1果實(shí)的抗壞血酸含量、轉(zhuǎn)基因株系9及10果實(shí)的可溶性蛋白含量顯著高于野生型。在轉(zhuǎn)基因株系草莓果實(shí)中的表達(dá)量顯著高于野生型；和在轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)顯著高于野生型。差異表達(dá)基因啟動(dòng)子區(qū)域包含多種高等植物順勢調(diào)控元件，主要有對真核生物起到增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄效率的CAAT-box和核心啟動(dòng)子元件TATA-box。同時(shí)還包含G-Box、G-box、MBS、ARE、5UTR Py-rich stretch等能影響各基因?qū)獾捻憫?yīng)及在苯丙烷代謝途徑中起調(diào)節(jié)作用的順式作用元件。調(diào)控相關(guān)基因參與轉(zhuǎn)化體果實(shí)發(fā)育和成熟，提高光的有效性，活化黃酮類生物合成通路關(guān)鍵基因，差異基因中均包含大量光誘導(dǎo)響應(yīng)元件，及的表達(dá)促進(jìn)了總黃酮、酚類物質(zhì)及花青苷等次生代謝物的合成。外源的轉(zhuǎn)入促進(jìn)著色物質(zhì)在果實(shí)中的形成與積累。

[1] 張勇, 湯浩茹, 羅婭, 王小蓉, 陳清, 劉澤靜. 草莓基因的克隆及表達(dá)分析. 園藝學(xué)報(bào), 2014, 41(2): 240-248.

ZHANG Y, TANG H R, LUO Y, WANG X R, CHEN Q, LIU Z J. Isolation and expression analysis of a CRT/DRE-binding factor genefrom., 2014, 41(2): 240-248. (in Chinese)

[2] Bajwa V S, Shukla M R, Sherif S M, Susan J M, Praveen K S. Role of melatonin in alleviating cold stress in., 2014, 56(3): 238-245.

[3] 趙佳, 劉榮, 楊帆, 李鑫, 劉厚生, 嚴(yán)倩, 肖月華. 月季花青素苷相關(guān)R2R3-MYB蛋白基因的克隆和表達(dá)分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(7): 1392-1404.

ZHAO J, LIU R, YANG F, LI X, LIU H S, YAN Q, XIAO Y H. Cloning and expression analysis of R2R3-MYB genes related to anthocyanin biosynthesis in rose., 2015, 48(7): 1392-1404. (in Chinese)

[4] 李辰, 范意娟, 紀(jì)文龍, 魏靈芝, 姜金鑄, 李冰冰, 賈文鎖.過量表達(dá)可促進(jìn)番茄果實(shí)發(fā)育及成熟. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 19(3): 73-79.

LI C, FAN Y J, JI W L, WEI L Z, JIANG J Z, LI B B, JIA W S. Over-expression ofpromotes fruit development and ripening in ‘Micro-Tom’ plant., 2014, 19(3): 73-79. (in Chinese)

[5] Nishawy E, Sun X, Ewas M, Ziaf K, Xu R, Wang D, Amar M, Zeng Y, Cheng Y. Overexpression ofDREB gene in tomato affects fruit size and accumulation of primary metabolites., 2015, 192: 460-467.

[6] KUANG J F, CHEN J Y, LIU X C, HAN Y C, XIAO Y Y, SHAN W, TANG Y, WU K Q, HE J X, LU W J. The transcriptional regulatory network mediated by banana () dehydration- responsive element binding () transcription factors in fruit ripening., 2017, 214(2): 762-781.

[7] MIZUNO S, HIRASAWA Y, SONODA M, NAKAGAWA H, SATO T. Isolation and characterization of three DREB/ERF-type transcription factors from melon ()., 2006. 170(6): 1156-1163.

[8] EBRAHIMI M, ABDULLAH S N, ABDUL AZIZ M, NAMASIVAYAM P. Oil palmconferred stress tolerance in transgenic tomato plants through modulation of the ethylene signaling pathway., 2016, 202: 107-120.

[9] GU X, CHEN Y, GAO Z, QIAO Y, WANG X. Transcription factors and anthocyanin genes related to low-temperature tolerance intransgenic strawberry., 2015, 89: 31-43.

[10] WROLSTAD R E, CULBERTSON J D, CORNWELL C J, MATTICK L R. Detection of adulteration in blackberry juice concentrates and wines., 1982, 65(6): 1417-1423.

[11] 楊遠(yuǎn)帆, 倪輝, 吳黎明. 茚三酮法測定蜂蜜及果葡糖漿中的氨基酸含量. 中國食品學(xué)報(bào), 2013, 13(2): 171-176.

YANG Y F, NI H, WU L M. Determination of Amino ACID in honey and high fructose corn syruo (HFCS) by the method of ninhydrin colorization., 2013, 13(2): 171-176. (in Chinese)

[12] DJERIDANE A, YOUSFI M, NADJEMI B, BOUTASSOUNA D, STOCKER P, VIDAL N. Antioxidant activity of some Algerian medicinal plants extracts containing phenolic compounds., 2006, 97(4): 654-660.

[13] 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典(一部).北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010.

Chinese Pharmacopoeia Commission.. Beijing: China Medical Science Press, 2010. (in Chinese)

[14] 蔡慶生. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn). 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2013.

CAI Q S.. Beijing: China Agricultural University Press, 2013. (in Chinese)

[15] BLANCH M, ROSALES R, PALMA F, SANCHEZ-BALLESTA M T, ESCRIBANO M I, MERODIO C. CO2-driven changes in energy and fermentative metabolism in harvested strawberries., 2015, 110: 33-39.

[16] VILLARREAL N M, BUSTAMANTE C A, CIVELLO P M, MARTíNEZ G A. Effect of ethylene and 1-MCP treatments on strawberry fruit ripening., 2010, 90(4): 683-689.

[17] TRAINOTTI L, PAVANELLO A, CASADORO G. Different ethylene receptors show an increased expression during the ripening of strawberries: Does such an increment imply a role for ethylene in the ripening of these non-climacteric fruits?, 2005, 56(418): 2037-2046.

[18] LAUVERGEAT V, LACOMME C, LACOMBE E, LASSERRE E, ROBY D, GRIMA-PETTENATI J. Two cinnamoyl-CoA reductase (CCR) genes fromare differentially expressed during development and in response to infection with pathogenic bacteria., 2001, 57(7): 1187-1195.

[19] DERIKVAND M M, SIERRA J B, RUEL K, POLLET B, DO C T, THéVENIN J, BUFFARD D, JOUANIN L, LAPIERRE C. Redirection of the phenylpropanoid pathway to feruloyl malate inmutants deficient for cinnamoyl-CoA reductase 1., 2008, 227(5): 943-956.

[20] ZHOU R, JACKSON L, SHADLE G, NAKASHIMA J, TEMPLE S, CHEN F, DIXON R A. Distinct cinnamoyl CoA reductases involved in parallel routes to lignin in., 2010, 107(41): 17803-17808.

[21] VAN ACKER R, LEPLE J C, AERTS D, STORME V, GOEMINNE G, IVENS B, LEGEE F, LAPIERRE C, PIENS K, VAN MONTAGU M C E, SANTORO N, FOSTER C E, RALPH J, SOETAERT W, PILATE G, BOERJAN W. Improved saccharification and ethanol yield from field-grown transgenic poplar deficient in cinnamoyl-CoA reductase., 2014, 111(2): 845-850.

[22] SATTLER S A, WALKER A M, VERMERRIS W, SATTLER S E, KANG C. Structural and biochemical characterization of cinnamoyl- CoA reductases., 2017, 173(2): 1031-1044.

[23] SMITH R A, CASS C L, MAZAHERI M, SEKHON R S, HECKWOLF M, KAEPPLER H, LEON N, MANSFIELD S D, KAEPPLER S M, SEDBROOK J C. Suppression ofincreases the level of monolignol ferulates incorporated into maize lignins., 2017, 10(1): 109.

[24] TOHGE T, NISHIYAMA Y, HIRAI M Y, YANO M, NAKAJIMA J, AWAZUHARA M, INOUE E, TAKAHASHI H, GOODENOWE D B, KITAYAMA M. Functional genomics by integrated analysis of metabolome and transcriptome ofplants over-expressing an MYB transcription factor., 2005, 42(2): 218-235.

[25] ALBERT N W, GRIFFITHS A G, COUSINS G R, VERRY I M, WILLIAMS W M.Anthocyanin leaf markings are regulated by a family ofgenes in the genus., 2015, 205(2): 882-893.

[26] Kathy E S, Hanh N, Fernand K, David A B, Nick W A, John A M, Meeghan P J, Ross N C, Colin E, Kevin M D. The onion (L.)generegulates anthocyanin biosynthesis., 2016, 7: 1865.

[27] WANG N, XU H, JIANG S, ZHANG Z, LU N, QIU H, QU C, WANG Y, WU S, CHEN X. MYB12 and MYB22 play essential roles in proanthocyanidin and flavonol synthesis in red-fleshed apple (f.)., 2017, 90(2): 276-292.

[28] BUER C S, IMIN N, DJORDJEVIC M A. Flavonoids: New roles for old molecules., 2010, 52(1): 98-111.

[29] KOES R, VERWEIJ W, QUATTROCCHIO F. Flavonoids: A colorful model for the regulation and evolution of biochemical pathways., 2005, 10(5): 236-242.

[30] 楊文杰, 杜海, 方芳, 楊婉身, 吳燕民, 唐益雄. 大豆兩個(gè)MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及表達(dá)分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 41(4): 961-970.

YANG W J, DU H, WAN F, YANG W S, WU Y M, TANG Y X. Cloning and characterization of two new MYB transcription factor genes from soybean., 2008, 41(4): 961-970. (in Chinese)

[31] 楊文杰, 吳燕民, 唐益雄. 大豆轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)及功能分析. 遺傳, 2009, 31(6): 645-653.

YANG W J, WU Y M, TANG Y X. Expressing and functional analysis offrom soybean., 2009, 31(6): 645-653. (in Chinese)

[32] Vimolmangkang S, Han Y, Wei G, KORBAN S S. An apple MYB transcription factor,, is involved in regulation of anthocyanin biosynthesis and flower development., 2013, 13(1): 176.

[33] BAHIELDIN A, ATEF A, EDRIS S, GADALIA N O, ALI H M. Ethylene responsive transcription factor ERF109 retards PCD and improves salt tolerance in plant., 2016, 16(1): 216.

[34] MOYANO E, MARTINEZ-GARCIA J F, MARTIN C. Apparent redundancy in MYB gene function provides gearing for the control of flavonoid biosynthesis in antirrhinum flowers., 1996, 8(9): 1519-1532.

[35] Jackson D, Martin C. Expression patterns of MYB genes fromflowers., 1991, 3(2): 115-125.

[36] 黃杰恒, 李威, 曲存民, 劉列釗, 徐新福, 王瑞, 李加納. 甘藍(lán)型油菜不同抗倒性材料中木質(zhì)素代謝途徑關(guān)鍵基因表達(dá)特點(diǎn). 作物學(xué)報(bào), 2013, 39(8): 1339-1344.

HUANG J H, LI W, QU C M, LIU L Z, XU X F, WANG R, LI J N. Expression characteristics of key genes in lignin pathway among different lodging resistance lines ofL., 2013, 39(8): 1339-1344. (in Chinese)

[37] 周蘭. 蘋果果實(shí)發(fā)育中類黃酮含量變化及相關(guān)基因的研究[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2013.

ZHOU L. Study on the concentration changes and related genes of flavonoids in apple [D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2013. (in Chinese)

[38] JU Z G, YUAN Y B, LIU C L, WANG Y Z, TIAN X P. Dihydroflavonol reductase activity and anthocyanin accumulation in ‘Delicious’, ‘Golden Delicious’ and ‘Indo’ apples., 1997, 70(1): 31-43.

[39] 王惠聰, 黃旭明, 胡桂兵, 黃輝白. 荔枝果皮花青苷合成與相關(guān)酶的關(guān)系研究. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2004, 37(12): 2028-2032.

WANG H C, HUANG X M, HU G B, HUANG H B. Studies on the relationship between anthocyanin biosynthesis and related enzymes in litchi pericarp., 2004, 37(12): 2028-2032. (in Chinese)

[40] Montefiori M, Espley R V, Stevenson D, Cooney J, Datson P M, Saiz A, Atkinson R G, Hellens R P, Allan A C.Identification and characterisation ofand, two glycosyltransferases responsible for anthocyanin biosynthesis in red-fleshed kiwifruit ()., 2011, 65(1): 106-118.

[41] 何平, 李林光, 王海波, 常源升, 李慧峰. 遮光性套袋對桃果實(shí)轉(zhuǎn)錄組的影響. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 50(6): 1088-1097.

HE P, LI L G, WANG H B, CHANG Y S, LI H F. Effects of shading fruit with opaque paper bag on transcriptome in peach., 2017, 50(6): 1088-1097. (in Chinese)

（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Effect ofGene Overexpression on Fruit Quality and Related Gene Expression in Strawberry

YAN YiChao1, WAN ChunYan2, GU XianBin1, GUO ChengBao3, CHEN YueHong3, GAO ZhiHong1

(1Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;2Zhenjiang Institute of Agricultural Science, Zhenjiang 212400, Jiangsu;3Nanjing Institute of Agricultural Science, Nanjing 210000)

【】The effect of exogenoustransformation to the fruit quality and related gene expression in ‘Benihoppe’ strawberry were analyzed to reveal the function and molecular mechanism of quality regulation in transgenic strawberry fruit.【】The edible organs on fivetransgenic strawberry lines and non-transgenic ‘Benihoppe’ strawberries (fruits in full red stage) were used as material to test and determine the vertical diameter, transverse diameter, weight, contents of flavor substance (soluble sugar, soluble protein, ascorbic acid) and coloring materials (anthocyanin, flavonoids and total phenol). The structure of the exogenous gene and seven secondary metabolites synthesis pathway-related genes (,,,,,,and) and the elements of gene promoter were analyzed and were predicted by bioinformatics methods such as BLASTn, GENEFINDER, and PlantCARE. The expression of related genes was detected by qRT-PCR. The data were analyzed by 7300 system software and 2-△△Ctmethod. The variance and correlation analysis of physiological, biochemical and molecular data were analyzed. The effects ofon the fruit quality and related gene expression of ‘Benihoppe’ strawberry were discussed comprehensively. 【】The fresh weight of transgenic and non-transgenic strawberries was ranging from 11.75 to 15.42 g. The vertical andtransverse diameters were ranging from 35.12 to 40.42 mm and 28.73 to 32.6 mm, respectively.Only the volume diameter of transgenic line 8 was significantly higher than that of line 7, and there were no significant differences between the other samples. The contents of anthocyanin in line 1 and line 7 were significantly higher than those of the control. The contents of total phenol in transgenic line1 and line 7 were significantly higher than that in control. The contents of total phenol in each line were significantly higher than that in the control. The soluble sugar contents in the transgenic line 1, line 7 and line 8 were significantly higher than that of the control (21.70 mg?g-1FW), which were 2.87, 3.39 and 3.35 times of the control. There was a positive correlation between soluble solids contents and soluble sugar contents (=0.811*), but there was no significant difference in the soluble solids contents of the samples. The contents of amino acids in the fruiting fruits of the transgenic lines were ranging from 0.2580 to 0.3950 g/100 g FW. The content of amino acids in the control was 0.5151 g/100 g FW, which was significantly higher than that of the transgenic lines. The contents of titratable acid in the transgenic line 1 and line 7 were significantly higher than that in the control. The content of ascorbic acid in line 1 was 168.35 mg/100 g FW, which was significantly higher than that of the wild-type of 92.50 mg/100 g FW. The contents of soluble protein in transgenic line 9 and line 10 were 25.97 and 25.86 mg?g-1FW, respectively, which was significantly higher than that of control (22.93 mg?g-1FW). The expression levels of,(cinnamoyl-CoA reductase 2-like) and(myb-related protein 306) in the transgenic lines were significantly higher than that of the wild-type. It was found that the promoter region of differentially expressed genes contained a variety of higher plant cis-acting elements, mainly were CAAT-box and TATA-box, which had enhanced transcription efficiency of eukaryotes.It also included some the cis-acting elements such as G-Box, G-box, MBS, ARE, 5UTR Py-rich stretch, which can affect the response of each gene to light and play a regulatory role in the phenylpropane metabolic pathway.【】regulated the related genes involved in the development and maturation of transformants, improved the effectiveness of light, activated the key genes of flavonoid biosynthetic pathway. Differentially expressed genes contained a large quantity of light-induced response elements. The expression ofandpromoted the synthesis of secondary metabolites such as flavonoids, phenols, anthocyanins and total phenols. The transformation ofgene resulted in a significant increase in the nutrient and coloring material contents and improved the fruit quality in strawberry.

strawberry (Duch.);; overexpression; fruit quality; promotor

2017-08-31；

2017-11-14

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目（CX(12)5065）、江蘇省六大人才高峰人才項(xiàng)目（NY068）

閻依超，E-mail：2014104020@njau.edu.cn。萬春雁，E-mail：254071691@qq.com。閻依超與萬春雁為同等貢獻(xiàn)作者。

高志紅，Tel：025-84395724；E-mail：gaozhihong @njau.edu.cn