蘋果生長素響應(yīng)因子MdARF5的克隆與功能鑒定

安建平，宋來慶，趙玲玲，由春香，王小非，郝玉金

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蘋果生長素響應(yīng)因子的克隆與功能鑒定

安建平1，宋來慶2，趙玲玲2，由春香1，王小非1，郝玉金1

（1山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院/作物生物學國家重點實驗室，山東 泰安 271018；2煙臺市農(nóng)業(yè)科學研究院，山東 煙臺 265599）

【】分離蘋果生長素響應(yīng)因子（Auxin Response Factor 5），分析其對生長素的響應(yīng)，鑒定其在調(diào)節(jié)花青苷合成過程中的作用，揭示的生物學功能，為進一步研究生長素對花青苷的調(diào)節(jié)提供理論依據(jù)?！尽恳浴吕O果（בRoyal Gala’）為材料，利用同源克隆技術(shù)，克隆得到一個ARF（Auxin Response Factor）轉(zhuǎn)錄因子，并將其命名為。利用MEGA5.0軟件構(gòu)建多物種間系統(tǒng)進化樹。通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織。比較野生型和轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織花青苷積累的差異。利用煙草葉片瞬時轉(zhuǎn)化試驗，分析對的轉(zhuǎn)錄調(diào)控?！尽靠寺～@得蘋果生長素響應(yīng)因子（序列號：MDP0000143749），該基因CDS為2 691 bp，編碼含有896個氨基酸的蛋白。系統(tǒng)進化樹分析表明，蘋果MdARF5與梨PbARF5同源性最高。基因表達分析顯示，該基因響應(yīng)生長素處理，并且與花青苷合成相關(guān)基因表現(xiàn)出相反的表達模式。在蘋果愈傷組織中超表達，其花青苷積累較野生型顯著降低，表明在調(diào)控花青苷積累過程中發(fā)揮重要作用。對蘋果啟動子序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其序列包含一個的結(jié)合位點。煙草瞬時表達試驗顯示，能夠抑制的表達?！尽客茰y蘋果可能通過直接抑制的表達負調(diào)節(jié)花青苷的積累。

蘋果；生長素；ARF轉(zhuǎn)錄因子；花青苷

0 引言

【研究意義】生長素是一類重要的植物激素，參與植物生長發(fā)育的許多方面，涉及細胞分裂與伸長、形態(tài)建成、環(huán)境脅迫響應(yīng)等[1-3]。然而，對生長素介導的花青苷積累研究較少。明確生長素調(diào)節(jié)花青苷的機理，對研究生長素信號途徑和調(diào)節(jié)果樹生長發(fā)育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】自從生長素（吲哚乙酸）在20世紀30年代被首次發(fā)現(xiàn)以來，人們對生長素信號轉(zhuǎn)導的分子機制已經(jīng)進行了廣泛研究。遺傳分析和生理生化試驗表明，TIR1（Transport Inhibitor Response 1）作為生長素受體感知生長素信號[4]。Aux/IAA阻遏蛋白能夠與生長素響應(yīng)因子相互作用，抑制其蛋白活性，進而負調(diào)節(jié)生長素信號[5]。此外，SCFTIR1泛素連接酶復合體在生長素信號途徑中扮演核心調(diào)控者的角色，它能夠通過泛素化降解Aux/IAA阻遏蛋白傳遞生長素信號[6-7]。當植物感受到生長素信號，TIR1蛋白復合體降解Aux/IAA阻遏蛋白，釋放生長素響應(yīng)因子，從而實現(xiàn)生長素介導的植物生長[8-9]。其中，ARF（auxin response factor）被鑒定為一類重要的生長素響應(yīng)調(diào)控因子[10]，ARF轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)生長素響應(yīng)基因的表達[5]。迄今為止，在擬南芥和水稻中分別鑒定了23和25個[11-12]。通過對ARF氨基酸序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)ARF蛋白都含有一個保守的DNA綁定結(jié)構(gòu)域（DBD）和一個保守的羧基末端二聚化結(jié)構(gòu)域（CTD）[13]。作為轉(zhuǎn)錄因子，ARF蛋白能夠通過結(jié)合下游靶基因的AuxRE序列（TGTCTC/GAGACA）調(diào)節(jié)基因的表達，進而影響多種植物生長發(fā)育過程[14-15]。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子參與植物多種發(fā)育過程。在擬南芥中，參與植物胚胎形成（、）[16]、根系生長（、、、）[17-18]、花器官發(fā)育（、、、）[19-20]及衰老過程（、）[21]。但水稻的功能不同于擬南芥，參與根系形成和種子萌發(fā)[22]，影響植株對鐵離子的吸收和積累[23]。最近的研究顯示，調(diào)節(jié)葉片傾斜角度[24]。李慧峰等[25]對蘋果ARF全基因組進行了初步分析。王意程等[26]研究發(fā)現(xiàn)，響應(yīng)生長素處理，并且可能參與生長素介導的花青苷積累過程?！颈狙芯壳腥朦c】作為多年生木本植物，蘋果中關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子的功能研究較少。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗從‘嘎拉’蘋果中鑒定并分離一個蘋果ARF基因，并通過轉(zhuǎn)基因分析和煙草瞬時表達試驗，揭示在調(diào)節(jié)蘋果花青苷積累過程中的重要作用，為揭示轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)花青苷積累提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗于2017年3—8月在山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院果樹分子生物學實驗室進行。

1.1 試驗材料

試驗所用的植物材料有蘋果‘嘎拉’（Royal Gala）幼苗和‘王林’（Orin）蘋果愈傷組織。

對長勢一致的盆栽‘嘎拉’蘋果幼苗用不同濃度的生長素（IAA）進行處理（0、2.5、5、7.5和10 μmol?L-1）。溶液少量多次澆灌至完全浸透，處理6 h后取樣，液氮速凍后保存?zhèn)溆谩?/p>

‘王林’蘋果愈傷組織用來進行遺傳轉(zhuǎn)化。蘋果愈傷組織放置在繼代培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+1.5 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA）室溫（24℃）、暗處培養(yǎng)。每隔15 d更新繼代一次。

采用本氏煙草（）進行瞬時表達試驗。

1.2 基因克隆

根據(jù)在蘋果（‘金冠’）參考基因組數(shù)據(jù)庫中檢索到的序列設(shè)計引物MdARF5-F/R（表1），以‘嘎拉’蘋果幼苗的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，34個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳并回收目的條帶，連接到克隆載體pMD18-T進行測序。所用的定量引物見表1。

1.3 RNA的提取與實時熒光定量PCR分析

蘋果幼苗及愈傷組織的RNA提取采用天根生化科技有限公司的Plus植物總RNA提取試劑盒（DP437）。以提取的RNA為模板，按照Clontech SMARTTMLibrary試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。以（GenBank accession number: CN938024）為內(nèi)參基因，使用Ultra SYBR Mixture試劑盒（康為世紀）進行實時熒光定量PCR分析。熒光定量PCR使用的儀器為BIO-RAD IQ5，所有PCR都設(shè)3個循環(huán)。PCR反應(yīng)體系：2×UltraSYBR Mixture 10.0 μL，cDNA 1.0 μL，加去離子水至20 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預變性10 min，94℃變性15 s，56℃退火15 s，65℃延伸15 s，40個循環(huán)，每次循環(huán)第2步進行熒光采集。最后采用2-△△CT法進行定量數(shù)據(jù)分析。所用定量引物見表1。

表1 基因克隆和載體構(gòu)建所用的引物序列

1.4 蘋果愈傷組織轉(zhuǎn)化和鑒定

構(gòu)建-pCAMBIA-1300超表達載體，并將其轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。取15 d左右生長狀態(tài)良好的蘋果愈傷組織與轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌室溫孵育20—30 min。將愈傷組織用紗網(wǎng)過濾并吸干表面的菌液，置于繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)1—2 d。隨后，將蘋果愈傷組織轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基（繼代培養(yǎng)基+100 mg·L-1潮霉素+500 mg·L-1頭孢霉素）。PCR檢測得到的陽性轉(zhuǎn)基因愈傷組織，在篩選培養(yǎng)基上繼代3代以上，進行后續(xù)試驗。

1.5 蘋果愈傷組織著色試驗

選擇生長狀態(tài)一致的野生型（WT）和轉(zhuǎn)基因（-L1和-L2）蘋果愈傷組織進行著色試驗。將愈傷組織放置到持續(xù)強光（光子通量密度約為100 μmol·s-1·m-2）、低溫（16℃）培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，觀察愈傷著色情況。

用花青苷提取液（95%無水乙醇+1.5 mol·L-1HCl）提取蘋果愈傷組織內(nèi)的花青苷[27]。提取過程在暗處進行。使用分光光度計（UV-1600，島津公司，日本），在530、620和650 nm波長下檢測樣品吸光度并計算花青苷含量[27]。計算公式：OD=（A530-A620）-0.1×(A650-A620)。

1.6 煙草瞬時表達試驗

本氏煙草葉片用來進行瞬時表達試驗。的ORF序列連接到pGreenII 62-SK載體（- pGreen 62-SK）。結(jié)合位點序列連接pGreen 0800-LUC（-pGreen 0800-LUC）?；铙w成像系統(tǒng)被用來檢測熒光強度。具體方法參照An等[27]。啟動子序列及潛在NAC結(jié)合位點見圖1。

1.7 統(tǒng)計學分析

使用R（3.0.2）軟件進行統(tǒng)計學分析。每個試驗至少重復3次，所有結(jié)果都是基于3個平行試驗的平均值。

2 結(jié)果

2.1 蘋果MdARF5的克隆及進化樹分析

通過RT-PCR技術(shù)克隆獲得一條大約2 500 bp的條帶（圖2）。對克隆得到的片段測序分析，結(jié)果顯示，該基因片段的開放閱讀框（ORF）長度為2 691 bp，編碼一個含896個氨基酸的蛋白質(zhì)。

將蘋果MdARF5蛋白序列與擬南芥、梨、桃等8個不同物種的ARF5蛋白序列進行分析并構(gòu)建進化樹（圖3）。進化樹分析結(jié)果表明，蘋果MdARF5與梨PbARF5親緣關(guān)系最近，同源性最高。

2.2 生長素對MdARF5及花青苷合成相關(guān)基因的影響

實時熒光定量PCR分析對生長素的響應(yīng)。結(jié)果顯示，在不同濃度生長素素處理下（0、2.5、5、7.5和10 μmol?L-1IAA），表達量顯著上調(diào)（圖4-A）。同時，花青苷合成相關(guān)基因（、、、、、）表達下調(diào)（圖4-B）。

灰色標注表示潛在NAC結(jié)合位點

圖2 蘋果MdARF5RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳

2.3 超表達MdARF5抑制花青苷積累

為了進一步研究的功能，構(gòu)建- pCAMBIA-1300植物超表達載體（圖5-A）。將重組超表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化侵染蘋果愈傷組織。定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因株系表達量（圖5-B）。獲得L1和L2兩個轉(zhuǎn)基因株系。

對獲得的轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織進行強光、低溫處理，10 d后，轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織（- L1和-L2）比野生型愈傷積累的花青苷少（圖4-C、D）。

實時熒光定量PCR檢測花青苷合成基因的表達。結(jié)果顯示，超表達明顯抑制花青苷合成結(jié)構(gòu)基因的表達（圖4-E）。

2.4 MdARF5轉(zhuǎn)錄因子抑制MdMYB1的表達

利用PlantCARE軟件（http://bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html/）對啟動子序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其序列包含一個轉(zhuǎn)錄因子的潛在結(jié)合位點（圖6-A、圖1）。為了驗證對的調(diào)控作用，構(gòu)建-pGreen 62-SK和-pGreen 0800 LUC載體，并轉(zhuǎn)化煙草葉片。如圖6-B、C所示，由于自主激活作用，轉(zhuǎn)化- pGreen 0800 LUC載體，葉片表現(xiàn)出較強的熒光強度。而同時轉(zhuǎn)化-pGreen 62-SK和-pGreen 0800 LUC，葉片的熒光強度顯著降低。這些結(jié)果說明，能夠直接抑制的表達。

圖3 蘋果MdARF5及其同源基因的進化樹分析

圖4及花青苷合成相關(guān)基因?qū)ιL素的響應(yīng)

Fig. 4 Analysis ofand anthocyanin biosynthesis genes expression in response to IAA

*差異顯著（＜0.05），**差異極顯著（＜0.01）。下同

* indicate significant difference (＜0.05), ** indicate very significant difference (＜0.01). The same as below

3 討論

蘋果（）是世界上最重要的經(jīng)濟作物之一。中國蘋果種植和產(chǎn)量常年居于世界前列[28]。通常紅皮蘋果更受人們歡迎[29]，花青苷作為一種重要的次生代謝產(chǎn)物，有助于果皮的著色[30-32]。轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)被鑒定能夠通過激活花青苷合成相關(guān)基因的表達，促進花青苷的積累[33]?；ㄇ嘬盏纳锖铣墒艿蕉喾N植物激素信號的影響。其中，生長素在調(diào)節(jié)花青苷的生物合成過程中發(fā)揮重要作用[34]。雖然前人的研究已經(jīng)表明，生長素抑制植物花青苷的合成[35-36]，但是，生長素在調(diào)節(jié)花青苷積累過程中的作用及其潛在的分子機制還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)響應(yīng)生長素處理，并且通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)驗證了在蘋果愈傷組織中超量表達抑制花青苷積累。

轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合下游靶基因的AuxRE序列調(diào)節(jié)基因的表達[37]。通過對啟動子序列進行分析[27]，發(fā)現(xiàn)其序列包含一個轉(zhuǎn)錄因子的潛在結(jié)合位點。同時，煙草瞬時表達試驗也驗證了確實可以直接抑制的表達。后期將通過酵母雙雜交試驗（Y2H）和電泳凝膠遷移率試驗（EMSA）[38]，進一步驗證MdARF5蛋白對啟動子的結(jié)合。

4 結(jié)論

克隆獲得蘋果生長素響應(yīng)因子基因，能夠響應(yīng)生長素處理。轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織表現(xiàn)出抑制花青苷積累的表型。煙草瞬時轉(zhuǎn)化試驗表明直接抑制的表達。研究結(jié)果為深入研究轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)植物花青苷積累提供了參考。

A：MdARF5-pCAMBIA-1300結(jié)構(gòu)示意圖；B：定量PCR分析MdARF5在轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織L1和L2中的表達水平；C：野生型（WT）和轉(zhuǎn)基因（MdARF5-L1和MdARF5-L2）蘋果愈傷組織花青苷積累情況分析；D：檢測花青苷含量；E：定量PCR檢測花青苷合成基因的表達，其在WT中的表達量設(shè)定為1

A：圖示MdMYB1啟動子包含一個潛在的MdARF5的結(jié)合位點。B：煙草葉片瞬時表達試驗。a：混合注射pGreen 62-SK和pGreen 0800 LUC菌液；b：混合注射pGreen 62-SK和MdMYB1-pGreen 0800 LUC菌液；c：混合注射MdARF5-pGreen 62-C:SK和MdMYB1-pGreen 0800 LUC菌液。C：相對發(fā)光強度，c的熒光強度設(shè)定為1

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（責任編輯 趙伶俐）

Cloning and Functional Characterization of an Auxin Response Factor Gene

AN JianPing1, SONG LaiQing2, ZHAO LingLing2, YOU ChunXiang1, WANG XiaoFei1, HAO YuJin1

(1College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology, Tai’an271018, Shandong;2)

【】The objective of this study is to isolate an apple auxin response factor gene, to analyze its expression of exposing to auxin, to identify its role in regulating anthocyanin biosynthesis, then to reveal its biological functions and to provide a theoretical basis for auxin-mediated anthocyanin accumulation. 【】The apple auxin response factor genewas cloned by PCR technology from apple (בRoyal Gala’). The phylogenetic tree was constructed by MEGA 5.0 software. The transgenic apple calli were generated via-mediated transformation. The differences in the anthocyanin accumulation were compared between wild-type and transgenic apple calli. The transient expression assays in tobacco leaves were carried out to test the transcriptional regulation ofgene by. 【】gene (MDP0000143749) was obtained. The open reading frame (ORF) ofcontained 2 691 bp, encoding a protein of 896 amino acid residues. Phylogenetic tree analysis showed that the homology of MdARF5 was close to the PbARF5. The transcriptional analysis results indicated thatwas induced by auxin treatment. On the contrary, the expression levels of anthocyanin biosynthesis genes were repressed. The-overexpressing apple calli exhibited decreased anthocyanin content, suggesting thatgene might play an important role in regulating anthocyanin accumulation. The sequence ofpromoter region was analyzed and a putative ARF binding motif was found. Meanwhile, the transient expression assays were performed inleaves and the results showed that MdARF5 could repress the expression of. 【】It is speculated that MdARF5 down-regulates anthocyanin accumulation by directly repressing the transcript of.

apple; auxin; ARF transcription factor; anthocyanin

2017-08-13；

2017-10-13

國家自然科學基金（31601742）、教育部創(chuàng)新團隊支持計劃（IRT15R42）、山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（SDAIT-06-03）

安建平，E-mail：1393427413@qq.com。宋來慶，E-mail：slq_zh@163.com。安建平和宋來慶為同等貢獻作者。

郝玉金，E-mail：haoyujin@sdau.edu.cn。通信作者王小非，E-mail：xfwang2004@163.com