溫度和土壤水分與Bt棉鈴殼中殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)關(guān)系及其氮代謝生理機(jī)制

張祥，王劍，彭盛，芮秋治，李麗楠，陳媛，陳源，陳德華

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溫度和土壤水分與Bt棉鈴殼中殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)關(guān)系及其氮代謝生理機(jī)制

張祥，王劍，彭盛，芮秋治，李麗楠，陳媛，陳源，陳德華

（揚(yáng)州大學(xué)/江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009）

【】明確溫度和土壤水分對(duì)Bt棉殺蟲(chóng)蛋白含量及其氮代謝活性的影響，為生產(chǎn)中Bt棉抗蟲(chóng)性的安全穩(wěn)定利用提供理論參考?！尽?016—2017年以轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)基因抗蟲(chóng)棉常規(guī)品種泗抗1號(hào)（SK1）和雜交種泗抗3號(hào)（SK3）為材料，采用盆栽法，設(shè)置29℃、32℃、35℃、38℃ 4個(gè)溫度水平，土壤最大持水量的80%、70%、60%、50%、40% 5個(gè)土壤水分水平，觀察溫度和土壤水分對(duì)Bt棉鈴殼殺蟲(chóng)蛋白含量的影響，各處理持續(xù)脅迫4 d。2016年主要研究各處理對(duì)Bt棉鈴殼中殺蟲(chóng)蛋白含量的影響；在此基礎(chǔ)上，2017年進(jìn)一步探討各處理對(duì)鈴殼中可溶性蛋白含量、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、蛋白酶、肽酶活性的影響?！尽縎K1和SK3殺蟲(chóng)蛋白含量均在32℃、最大持水量為60%時(shí)最高，分別達(dá)到471.1 ng·g-1FW和351.7 ng·g-1FW。在同一土壤水分條件下，32℃最利于SK1和SK3殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)；同一溫度條件下，最大持水量60%利于SK1和SK3殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)。對(duì)殺蟲(chóng)蛋白含量與溫度和土壤水分關(guān)系進(jìn)行二元多項(xiàng)式回歸分析發(fā)現(xiàn)，Bt棉殺蟲(chóng)蛋白含量（Y）與溫度（X2）和土壤水分（X1）呈二元二次方程關(guān)系，其中SK1、SK3相關(guān)方程分別為Y=-3230.2+17.2X1+199.1X2-0.3X12-3.7X22-0.7X1X2（＝0.829**）、Y=-3322.0+40.7X1+145.2X2-0.3X12-2.0X22-0.3X1X2（＝0.739**）。SK1的殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)量最大的溫度和土壤水分條件為31.8℃、57.8%，SK3為33.2℃、60.8%。氮代謝相關(guān)生理特征表明，SK1和SK3均表現(xiàn)為在32℃和土壤含水量為60%處理下，棉鈴中可溶性蛋白含量、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性較高，蛋白酶、肽酶活性較低；殺蟲(chóng)蛋白含量與可溶性蛋白和GOT活性呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（＝0.613**；＝0.735**），與蛋白酶活性和肽酶活性呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（＝-0.724**；＝-0.738**）?！尽繙囟群屯寥浪滞ㄟ^(guò)調(diào)控蛋白質(zhì)分解和合成，共同影響B(tài)t棉殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)，且與其含量呈二元二次方程關(guān)系。

Bt棉；溫度；土壤水分；殺蟲(chóng)蛋白；氮代謝

0 引言

【研究意義】1997年起中國(guó)開(kāi)始在生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用（Bt）棉，自那以來(lái)中國(guó)的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉種植面積不斷擴(kuò)大。據(jù)統(tǒng)計(jì)，Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的種植面積已經(jīng)達(dá)到中國(guó)總植棉面積的80%以上[1-2]。但目前為止，Bt棉的殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)不穩(wěn)定的觀點(diǎn)受到國(guó)內(nèi)外一致認(rèn)同。其中環(huán)境因素的脅迫對(duì)抗蟲(chóng)性表達(dá)具有較大的影響，明確環(huán)境因素對(duì)Bt棉殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)影響及其機(jī)制，可為逆境下Bt棉抗蟲(chóng)性安全應(yīng)用和合理防治棉鈴蟲(chóng)提供科學(xué)依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在不良的環(huán)境條件脅迫下，Bt棉顯著表現(xiàn)為抗蟲(chóng)性下降或不抗蟲(chóng)的現(xiàn)象[3-5]。溫度是影響B(tài)t棉抗蟲(chóng)性表達(dá)的重要因素[6-7]。Zhang等[8]、夏蘭芹等[9]研究表明高溫逆境可導(dǎo)致Bt殺蟲(chóng)蛋白含量急劇降低。Wang等[10]進(jìn)一步明確38℃是導(dǎo)致Bt棉棉蕾中Bt殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)量顯著下降的臨界溫度。在水分方面，王留明等[11]的研究表明，在花鈴期進(jìn)行的田間淹水澇漬或土壤缺水干旱處理可導(dǎo)致棉株各個(gè)器官中Bt蛋白表達(dá)含量顯著降低，其中缺水干旱能夠更強(qiáng)地抑制器官中Bt殺蟲(chóng)蛋白的合成。Benedict等[12]發(fā)現(xiàn)土壤含水量下降，引起土壤水分壓力降低，從而導(dǎo)致Bt棉植株中總可溶性蛋白及Bt殺蟲(chóng)蛋白含量減低?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人的研究或推測(cè)主要是以單個(gè)因子為主，而棉花生育過(guò)程并非僅受簡(jiǎn)單的單因素影響，而是受自然環(huán)境條件中溫度和土壤水分等數(shù)個(gè)條件互作綜合影響，因此單因子往往不能完全反映自然溫度（高溫或低溫）和土壤水分（水分過(guò)多或過(guò)少）互作條件下對(duì)Bt棉抗蟲(chóng)性表達(dá)的影響。此外，雖然前人主要研究了環(huán)境因子中溫度和土壤水分對(duì)Bt棉殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)影響，但并未能明確它們與殺蟲(chóng)蛋白含量的數(shù)量關(guān)系，這限制了上述研究成果對(duì)生產(chǎn)中的實(shí)際指導(dǎo)作用?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本文擬通過(guò)人工模擬棉花生育過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)的溫度與土壤水分互作條件，探討B(tài)t棉殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)量的變化，明確Bt棉殺蟲(chóng)蛋白含量與溫度和土壤水分?jǐn)?shù)量關(guān)系及其生理機(jī)制，從而為逆境條件下，Bt棉抗蟲(chóng)性安全應(yīng)用提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2016—2017年在揚(yáng)州大學(xué)江蘇省作物遺傳生理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育點(diǎn)盆栽試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行。選擇來(lái)源于中國(guó)的轉(zhuǎn)Bt基因棉品種泗抗1號(hào)（常規(guī)種）和泗抗3號(hào)（雜交種）為材料，由江蘇省宿遷市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，抗蟲(chóng)基因均為。

試驗(yàn)采用盆栽法，所用盆缽直徑40 cm，盆高50 cm，每盆裝20 kg過(guò)篩的砂壤土（取自試驗(yàn)田）。采用育苗移栽方式種植，于4月6日播種，出苗41 d后，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的壯苗移栽至盆缽中，每盆1株。其他生長(zhǎng)管理措施按大田高產(chǎn)栽培要求進(jìn)行。

于盛鈴期設(shè)溫度與土壤水分2個(gè)試驗(yàn)因子，其中溫度設(shè)4個(gè)水平（24 h恒溫）：29℃、32℃、35℃、38℃；土壤水分設(shè)5個(gè)水平：土壤含水量分別為土壤最大持水量的80%、70%、60%、50%、40%，分別用80%、70%、60%、50%、40%表示。每個(gè)處理重復(fù)3次，供試土壤最大田間持水量為23.5%。2016年主要研究溫度和土壤水分對(duì)Bt殺蟲(chóng)蛋白含量影響，2017年在2016年結(jié)果基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究其對(duì)氮代謝相關(guān)指標(biāo)影響。

應(yīng)用人工氣候室（北京易盛泰和科技有限公司，北京）控制溫度水平（精度±0.5℃），采用菲利普T5燈和美國(guó)GE農(nóng)用鈉燈控制光源，光照30 000 Lux。各處理在盛鈴期前10 d（2016年和2017年均為7月30日），標(biāo)記棉株內(nèi)圍第1—2果節(jié)當(dāng)日花。同時(shí)控制澆水，如遇下雨，將處理盆缽移入室內(nèi)。使用WET土壤三參數(shù)速測(cè)儀監(jiān)測(cè)土壤水分，用稱(chēng)重法控制土壤水分，即當(dāng)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)土壤水分低于設(shè)計(jì)值時(shí)，分別于6：00、14：00、22：00進(jìn)行定量補(bǔ)水。在到達(dá)預(yù)期水分指標(biāo)后，將盆栽棉株移入人工氣候箱進(jìn)行處理。處理持續(xù)4 d，脅迫結(jié)束后分別取樣標(biāo)記的相同日齡的鈴，液氮冷凍后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

1.2 測(cè)定內(nèi)容和方法

1.2.1 Bt殺蟲(chóng)蛋白含量 采用酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）測(cè)定，試劑盒由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。測(cè)定方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[13]。

1.2.2 氮代謝相關(guān)酶活性和物質(zhì)含量 測(cè)定鈴殼中谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、蛋白酶、肽酶活性、可溶性蛋白含量。GOT、蛋白酶、肽酶活性用鄒琦[14]方法測(cè)定，可溶性蛋白含量用張憲政[15]方法測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，使用SPSS10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用MATLAB軟件進(jìn)行殺蟲(chóng)蛋白與溫度和土壤水分二元二次方程（Y=-b0+b1X1+ b2X2+b3X12+b4X22+b5X1X2）模擬及作圖。

2 結(jié)果

2.1 溫度和土壤水分對(duì)生理指標(biāo)影響方差分析

從表1的雙因素方差分析結(jié)果可以看出，單獨(dú)溫度、水分以及溫度與水分交互作用均對(duì)供試品種鈴殼中殺蟲(chóng)蛋白和可溶性蛋白含量，GOT、蛋白酶和肽酶活性具有顯著或極顯著影響。

表1 雙因素方差分析

值代表均方和；*和**分別代表顯著相關(guān)（＜0.05）和極顯著相關(guān)（＜0.01）；SK1和SK3分別代表泗抗1號(hào)和泗抗3號(hào)

Value indicates mean square; *, ** indicate significance at 0.05 and 0.01 levels, respectively. SK1 and SK3 indicate Sikang 1 and Sikang 3, respectively

2.2 溫度和土壤水分對(duì)殺蟲(chóng)蛋白含量影響

圖1表明，在同一溫度條件下，Bt棉棉鈴中殺蟲(chóng)蛋白含量均隨著土壤水分含量的增加而呈先增加后下降的趨勢(shì)。總體而言，SK1和SK3均表現(xiàn)為土壤水分含量為最大持水量的60%時(shí)，棉鈴中殺蟲(chóng)蛋白含量最高。在同一土壤水分條件下，棉鈴中殺蟲(chóng)蛋白含量也隨著溫度的升高呈先上升再下降趨勢(shì)，在32℃達(dá)峰值。從溫度和土壤水分綜合效應(yīng)來(lái)看，在32℃和土壤含水量為60%條件下時(shí)，SK1和SK3棉鈴殺蟲(chóng)蛋白含量最高，分別為471.1 ng·g-1FW和351.7 ng·g-1FW，且總體顯著高于其他處理，說(shuō)明此環(huán)境條件最有利于SK1和SK3殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)。

圖中小寫(xiě)字母表示同一品種各處理間在5%水平差異顯著。下同

對(duì)Bt棉鈴殼中殺蟲(chóng)蛋白含量（Y）與土壤水分含量（X1）和溫度（X2）進(jìn)行建模擬合發(fā)現(xiàn)，SK1和SK3殺蟲(chóng)蛋白含量與土壤水分含量和溫度均呈二元二次方程關(guān)系（圖2），擬合方程分別為：Y=-3230.2+17.2X1+ 199.1X2-0.3X12-3.7X22-0.7X1X2；Y=-3322.0+40.7X1+ 145.2X2-0.3X12-2.0X22-0.3X1X2。相關(guān)系數(shù)分別為0.829、0.739，均達(dá)到極顯著水平，說(shuō)明上述方程擬合效果很好。根據(jù)上述方程計(jì)算，最有利于SK1和SK3棉鈴中Bt蛋白表達(dá)的溫度和土壤水分含量分別為31.2℃、最大持水量的57.8%和33.2℃、最大持水量的60.8%。

2.3 溫度和土壤水分對(duì)Bt棉氮代謝生理特征影響

2.3.1 可溶性蛋白含量 方差分析表明（表1），溫度和土壤水分均對(duì)SK1和SK3棉鈴中可溶性蛋白表達(dá)具有顯著或極顯著影響，且兩者存在著極顯著互作關(guān)系。由圖3可知，在同一溫度條件下，Bt棉棉鈴中可溶性蛋白含量均隨著土壤水分含量的增加而呈先增加后下降的趨勢(shì)?？傮w而言，SK1和SK3均表現(xiàn)為土壤水分含量為最大持水量的50%—70%時(shí)，棉鈴中可溶性蛋白含量較高。在同一土壤水分條件下，棉鈴中可溶性蛋白含量也隨著溫度的升高呈先上升后下降規(guī)律，在32℃達(dá)峰值。從溫度和土壤水分綜合效應(yīng)來(lái)看，2個(gè)品種均在32℃和土壤含水量為60%處理時(shí)，棉鈴中可溶性蛋白含量較高，分別為2.87 mg·g-1FW和2.64 mg·g-1FW。

圖2 溫度和土壤水分與Bt棉鈴殼的殺蟲(chóng)蛋白的關(guān)系（2016）

圖3 溫度和水分對(duì)Bt棉可溶性蛋白含量影響（2017）

2.3.2 GOT活性 溫度和土壤水分對(duì)棉鈴中GOT活性影響與可溶性蛋白趨勢(shì)基本一致（圖4）。表1表明，單獨(dú)溫度和土壤水分均極顯著影響SK1和SK3棉鈴中GOT活性，且兩者存在著極顯著互作關(guān)系。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在同一溫度條件下，Bt棉棉鈴中GOT活性均隨著土壤水分含量的增加而呈先增加后下降的趨勢(shì)?？傮w而言，SK1和SK3均表現(xiàn)為土壤水分含量為最大持水量的60%時(shí)，棉鈴中GOT活性較高。在同一土壤水分含量條件下，GOT活性也隨著溫度的增加呈先上升，至32℃達(dá)最高，后下降的趨勢(shì)。從溫度和土壤水分綜合效應(yīng)來(lái)看，2個(gè)供試品種均在32℃和土壤含水量為60%條件下棉鈴中GOT活性最高，分別達(dá)2.14 mol·g-1·30min-1和2.44 mol·g-1·30min-1，且顯著高于其他處理。綜合圖3和圖4而言，32℃和土壤含水量為60%處理最利于SK1和SK3氮代謝合成能力提高。

2.3.3 蛋白酶活性 方差分析（表1）表明，單獨(dú)溫度和土壤水分均極顯著影響SK1和SK3棉鈴中蛋白酶活性，且兩者存在著極顯著互作關(guān)系。但溫度和土壤水分對(duì)棉鈴中蛋白酶活性影響與可溶性蛋白、GOT活性變化趨勢(shì)相反（圖5）。其中，在同一溫度條件下，Bt棉棉鈴中蛋白酶活性均隨著土壤水分含量的增加而呈先降低后上升的趨勢(shì)?？傮w而言，SK1和SK3均表現(xiàn)為土壤水分含量為最大持水量的50%—60%時(shí)，棉鈴中蛋白酶活性最低。在同一土壤水分含量條件下，棉鈴中蛋白酶活性也隨著溫度的升高呈先上升再下降趨勢(shì)。在不同土壤水分條件下，均以32℃條件下活性較低。從溫度和土壤水分綜合效應(yīng)來(lái)看，2個(gè)品種均在32℃和土壤含水量為60%處理時(shí)，棉鈴中蛋白酶活性最低，分別僅為0.41 mg·g-1·h-1和0.05 mg·g-1·h-1，且顯著低于其他處理。

圖4 溫度和水分對(duì)Bt棉GOT活性影響（2017）

2.3.4 肽酶活性 溫度和水分對(duì)棉鈴中肽酶活性影響與蛋白酶活性變化趨勢(shì)相似（圖6）。單獨(dú)溫度和土壤水分均極顯著影響SK1和SK3棉鈴中肽酶活性，且兩者存在著極顯著互作關(guān)系（表1）。在同一溫度條件下，Bt棉棉鈴中肽酶活性均隨著土壤水分含量的增加而呈先降低后上升的趨勢(shì)?？傮w而言，SK1和SK3均表現(xiàn)為土壤水分含量為最大持水量的50%—60%時(shí)，棉鈴中肽酶活性最低。在同一土壤水分含量條件下，29℃和32℃條件下，肽酶活性總是保持在一個(gè)較低的水平。從溫度和土壤水分綜合效應(yīng)來(lái)看，2個(gè)品種均在32℃和土壤含水量為60%處理時(shí)，棉鈴中肽酶活性最低，且顯著低于其他處理。綜合圖5和圖6結(jié)果表明，32℃和土壤含水量為60%時(shí)SK1和SK3氮代謝分解能力最低。

圖5 溫度和水分對(duì)Bt棉蛋白酶活性影響（2017）

2.4 殺蟲(chóng)蛋白含量與氮代謝相關(guān)酶活性相關(guān)性

圖7表明，不同溫度和土壤水分條件下，2個(gè)類(lèi)型品種盛鈴期棉鈴中殺蟲(chóng)蛋白含量與可溶性蛋白和GOT活性呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（＝0.613**；＝0.735**），與蛋白酶活性和肽酶活性呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（＝-0.724**；＝-0.738**）。以上結(jié)果說(shuō)明在不同溫度和土壤水分條件下，棉鈴中殺蟲(chóng)蛋白含量與氮代謝密切相關(guān)，增強(qiáng)棉鈴中蛋白合成能力，降低蛋白分解能力有利于Bt棉殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)量增加。

3 討論

3.1 協(xié)調(diào)溫度和土壤水分可利于Bt棉殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)

前人研究表明，外界環(huán)境因子對(duì)Bt棉殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)具有明顯影響[16-17]，但其研究或推測(cè)主要是以單個(gè)因子進(jìn)行的，而棉花生育過(guò)程中是受溫度和土壤水分等多種因素的綜合影響，因此單因子往往不能完全反映自然環(huán)境中溫度和土壤水分虧缺互作條件下對(duì)Bt棉抗蟲(chóng)性表達(dá)的影響。Chen等[18]研究高溫逆境對(duì)Bt棉Bt殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)量影響的結(jié)果表明，在溫度為37℃時(shí)，花鈴期Bt棉葉片中殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)量在48 h后顯著下降。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這樣的結(jié)果是發(fā)生在相對(duì)濕度為50%的高溫低濕條件下，當(dāng)相對(duì)濕度提高至70%，溫度仍為37℃時(shí)，Bt殺蟲(chóng)蛋白含量下降明顯減少，僅為50%相對(duì)濕度時(shí)的一半，說(shuō)明溫度與濕度對(duì)Bt抗蟲(chóng)蛋白表達(dá)的影響存在互作效應(yīng)。Zhou等[19]則明確認(rèn)為溫度與土壤水分互作可明顯影響B(tài)t棉抗蟲(chóng)性表達(dá)，說(shuō)明溫度與土壤水分對(duì)Bt棉殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)的影響存在互作效應(yīng)。本文研究結(jié)果也證實(shí)溫度和土壤水分對(duì)Bt棉棉鈴中殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)具有顯著或極顯著的互作作用。其中，在本試驗(yàn)溫度和土壤水分范圍內(nèi)，泗抗1號(hào)和泗抗3號(hào)在32℃和土壤含水量為最大持水量的60%條件下，棉鈴中殺蟲(chóng)蛋白含量最高。進(jìn)一步對(duì)泗抗1號(hào)和泗抗3號(hào)鈴殼的殺蟲(chóng)蛋白含量與溫度、土壤水分含量之間的關(guān)系進(jìn)行回歸分析和建立模型發(fā)現(xiàn)，殺蟲(chóng)蛋白與溫度和土壤水分含量呈二元二次方程關(guān)系。而且擬合的方程相關(guān)系數(shù)均達(dá)到極顯著水平（＝0.829**、0.739**），說(shuō)明該方程擬合效果很好，計(jì)算明確最有利于SK1和SK3棉鈴中Bt蛋白表達(dá)的溫度和土壤水分含量分別為31.2℃、最大持水量的57.8%和33.2℃、最大持水量的60.8%。因此，在生產(chǎn)中，我們可利用該方程計(jì)算出不同溫度和土壤水分情況下Bt棉殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)量，明確Bt棉自身對(duì)田間害蟲(chóng)的控制效果，進(jìn)而為田間農(nóng)藥施用量提供依據(jù)。此外，田間管理中人們還可以利用開(kāi)溝排水或合理灌溉等方法緩解高溫和干旱的影響，從而利于Bt棉自身殺蟲(chóng)性的表達(dá)。

圖6 溫度和水分對(duì)Bt棉肽酶活性影響（2017）

圖7 Bt棉殺蟲(chóng)蛋白含量與氮代謝相關(guān)酶活性相關(guān)性（2017）

3.2 Bt棉殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)水平受蛋白質(zhì)分解和合成能力調(diào)節(jié)

雖然環(huán)境影響B(tài)t棉抗蟲(chóng)性表達(dá)的機(jī)理目前還未明確，但主要有以下幾種推斷：第一種推斷認(rèn)為逆境使得Bt的啟動(dòng)子甲基化失活，從而導(dǎo)致Bt表達(dá)關(guān)閉（switch off）[20-21]；第二種推斷認(rèn)為不良的環(huán)境條件下棉株體內(nèi)的殺蟲(chóng)蛋白與產(chǎn)生的單寧等物質(zhì)結(jié)合而失活[22-23]；第三種推斷認(rèn)為不良環(huán)境條件下蛋白質(zhì)合成下降，導(dǎo)致殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)量下降[24-25]。其中GOT活性及可溶性蛋白是植物體內(nèi)氮代謝合成的關(guān)鍵酶和物質(zhì)，而蛋白酶和肽酶則是氮代謝分解關(guān)鍵酶。張桂玲等[26]研究表明短期鹽脅迫后，Bt棉內(nèi)游離氨基酸含量與Bt殺蟲(chóng)蛋白含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，可溶性蛋白含量與Bt殺蟲(chóng)蛋白呈極顯著正相關(guān)。王永慧等[27]發(fā)現(xiàn)，濕度脅迫會(huì)導(dǎo)致盛鈴期葉片Bt殺蟲(chóng)蛋白含量的下降，這可能是因?yàn)槊{迫導(dǎo)致Bt 殺蟲(chóng)蛋白的合成能力下降、分解能力上升。陳德華等[28]研究也發(fā)現(xiàn)Bt棉氮代謝活性顯著影響殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)的影響。在本文中，筆者發(fā)現(xiàn)在32℃和土壤含水量為最大持水量的60%條件下，供試品種泗抗1號(hào)和泗抗3號(hào)GOT活性和可溶性蛋白含量均顯著高于其他處理，而蛋白酶和肽酶活性則顯著低于其他處理。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在不同溫度和土壤水分條件下，GOT活性和可溶性蛋白含量與Bt棉棉鈴中殺蟲(chóng)蛋白含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；蛋白酶和肽酶活性則與殺蟲(chóng)蛋白含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（圖7）。由此可見(jiàn)，溫度和土壤水分環(huán)境主要是通過(guò)調(diào)節(jié)Bt棉蛋白質(zhì)合成和分解來(lái)影響棉鈴中殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)。但不同品種間相比，泗抗3號(hào)殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)量最高時(shí)的溫度和土壤水分含量均高于泗抗1號(hào)，這可能是由于雜交種具有較高的抗逆性（如高溫等）[29]，其在逆境下仍能保持較高的氮代謝合成能力和較低的氮代謝分解能力，這與前人研究基本一致[30-31]。因此，在Bt棉生長(zhǎng)過(guò)程中，我們應(yīng)通過(guò)相應(yīng)的栽培措施，促進(jìn)棉鈴中蛋白質(zhì)合成相關(guān)酶活性或物質(zhì)含量，降低與蛋白質(zhì)分解相關(guān)酶活性或物質(zhì)含量，來(lái)提高Bt棉殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)和其自身抗蟲(chóng)性。

4 結(jié)論

Bt棉鈴殼中殺蟲(chóng)蛋白含量與溫度和土壤水分含量呈二元二次函數(shù)關(guān)系，且最有利于泗抗1號(hào)（SK1）和泗抗3號(hào)（SK3）棉鈴中Bt蛋白表達(dá)的溫度和土壤水分含量分別為31.2℃、最大持水量的57.8%和33.2℃、最大持水量的60.8%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)溫度和土壤水分主要是通過(guò)調(diào)控蛋白質(zhì)分解與合成能力影響殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)。

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（責(zé)任編輯 楊鑫浩）

Relationship between Temperature, Soil Moisture, and Insecticidal Protein Content in Bt Cotton Boll Shell and the Mechanism of Nitrogen Metabolism

ZHANG Xiang, WANG Jian, PENG Sheng, RUI QiuZhi, LI LiNan, CHEN Yuan, CHEN Yuan, CHEN DeHua

(Yangzhou University/Jiangsu Provincial Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology, Yangzhou 225009, Jiangsu)

【】 The effects of different temperature and soil moisture on the insecticidal protein contents in(Bt) cotton boll shell were investigated to provide a theoretical reference for the safe and stable utilization of Bt cotton in production.【】The study was undertaken on two Bt cotton cultivars Sikang 1 (SK1, a conventional cultivar) and Sikang 3 (SK3, a hybrid cultivar) during 2016 and 2017 growing seasons at Yangzhou University Farm, Yangzhou, China. The study was arranged with two factors that consisted of four temperature (29, 32, 35, and 38℃) and five soil moisture content (40%, 50%, 60%, 70% and 80% field capacity). The potted cotton plants were exposed to the twenty treatments for 4 days. In 2016, the effects of temperature and soil moisture on the insecticidal protein contents in boll shell were determined, and the soluble protein contents, glutamate oxaloacetate transaminase (GOT) activities, protease and peptidase activities were further studied in 2017. 【】The highest contents of insecticidal protein for SK1 and SK3 were both observed under the treatment of 32℃/60% field capacity, which was 471.1 ng·g-1FW and 351.7 ng·g-1FW, respectively. Under the same soil moisture, the insecticidal protein contents for SK1 and SK3 at 32℃ were significantly higher than those for other three temperature conditions. Under the same temperature, the insecticidal protein content under 60% field capacity for SK1 and SK3 was higher. Polynomial regression analysis showed a quadratic relationship between the insecticidal protein contents and the temperature and soil moisture. The binary quadric fitting equations for SK1 and SK3 were: Y=-3230.2+17.2X1+199.1X2-0.3X12-3.7X22-0.7X1X2(＝0.829**), Y=-3322.0+40.7X1+145.2X2- 0.3X12-2.0X22-0.3X1X2(＝0.739**), respectively, where Y stands for insecticidal protein contents, and X1is soil moisture, X2is temperature. Based on the equations, the maximum insecticidal protein contents would be obtained under the combination of 31.8℃/57.8% for SK1 and 33.2℃/60.8% for SK3, respectively. The physiological characteristics of nitrogen metabolism showed that the soluble protein contents and the GOT activities were highest in the boll shell for SK1 and SK3 under the combination of 32℃/60% field capacity, whereas the lowest protease and peptidase activities were also detected under this condition. The correlation analysis showed that there was a significant positive correlation between the insecticidal protein contents with soluble protein content and GOT activity (= 0.613**;= 0.735**), while the insecticidal protein was negatively correlated with protease activity and peptidase activity (= -0.724**;= -0.738**).【】 The temperature and soil moisture affected the expression of Bt insecticidal protein by regulating the protein synthesis and degradation. And the relationship between Bt protein contents and temperature and soil moisture could be quantified by a binary quadric fitting equation.

Bt cotton; temperature; soil moisture; insecticidal protein; nitrogen metabolism

2017-08-02；

2017-11-17

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171479，31301263，31471435）、國(guó)家博士后基金項(xiàng)目（2016M591934）、江蘇省博士后基金（1601116C）、江蘇省高等學(xué)校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目（17KJA210003）、江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目、江蘇高校品牌專(zhuān)業(yè)建設(shè)工程、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（植棉技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化團(tuán)隊(duì)）（2016PCTS-1）、江蘇省“雙創(chuàng)博士”

張祥，E-mail：yzzhangxiang@163.com。

陳德華，Tel：0514-87979357；E-mail：cdh@yzu.edu.cn