茶樹(shù)兒茶素合成相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子生物信息學(xué)分析

張玥，胡雲(yún)飛，王樹(shù)茂，柯子星，林金科

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茶樹(shù)兒茶素合成相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子生物信息學(xué)分析

張玥，胡雲(yún)飛，王樹(shù)茂，柯子星，林金科*

福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建 福州 350002

從茶樹(shù)（）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得6個(gè)與兒茶素合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)其進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)、核定位信號(hào)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析，通過(guò)同源分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，與兒茶素合成相關(guān)的6個(gè)MYB蛋白都屬于親水性的非分泌蛋白，定位在葉綠體、線(xiàn)粒體和細(xì)胞核上，其空間結(jié)構(gòu)主要是α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角；保守結(jié)構(gòu)域的分析發(fā)現(xiàn)除了comp159173_c0基因，其余5個(gè)都屬于SANT超家族基因成員。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示6個(gè)MYB蛋白形成4個(gè)分支，顯示出各自間較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。差異表達(dá)分析的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了6個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子與兒茶素合成代謝的相關(guān)性。

兒茶素；MYB轉(zhuǎn)錄因子；生物信息學(xué)

茶葉中的兒茶素是2-苯基苯并吡喃的衍生物，是茶樹(shù)中最主要的黃烷醇類(lèi)化合物，屬于類(lèi)黃酮物質(zhì)[1]。兒茶素含量占茶樹(shù)鮮葉干重的12%~25%，是茶葉中多酚類(lèi)物質(zhì)的主體成分，它們既是決定茶葉品質(zhì)的關(guān)鍵因素，也是茶葉抗癌、抗炎癥等保健功效的主要成分[2]。近年來(lái)，隨著茶葉保健功效的闡明，對(duì)茶樹(shù)兒茶素和原花色素的生物合成途徑及分子調(diào)控機(jī)理的研究已成為國(guó)內(nèi)外茶樹(shù)次生代謝領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)植物中普遍存在的調(diào)節(jié)蛋白，又稱(chēng)為反式作用因子，即通過(guò)識(shí)別或結(jié)合真核基因啟動(dòng)子區(qū)域中的順式作用元件，來(lái)激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育[3-5]、生物與非生物脅迫應(yīng)答[6-7]、激素應(yīng)答[8]、次生代謝[9-11]等過(guò)程中起到調(diào)節(jié)和控制的作用。MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在植物的次生代謝中主要在苯丙素代謝途徑中發(fā)揮作用，該途徑的起始物質(zhì)莽草酸通過(guò)莽草酸途徑產(chǎn)生苯丙氨酸，苯丙氨酸又在限速酶苯丙氨酸解氨酶的作用下，產(chǎn)生許多不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括兒茶素類(lèi)化合物[12]。

迄今為止，茶樹(shù)兒茶素合成途徑中一些關(guān)鍵酶的基因已經(jīng)被克隆，例如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查爾酮異構(gòu)酶（CHI）、查爾酮合成酶（CHS）、二氫黃酮醇還原酶（DFR）、花青素還原酶（ANR）、花青素合成酶（ANS）、黃烷酮3-羥基化酶（F3H）等，并對(duì)這些酶與多酚合成之間的關(guān)系進(jìn)行了初步的研究[13-17]。但兒茶素類(lèi)化合物的種類(lèi)多樣，合成途徑受到大量關(guān)鍵酶基因的影響，而這些酶基因的表達(dá)則受到相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[18]。

諸多調(diào)控類(lèi)黃酮次生代謝的MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物中被發(fā)現(xiàn)。前期的研究在草莓、番茄、蘋(píng)果、土豆等植物中分離并克隆得到了調(diào)控花青素合成途徑的MYB蛋白[19-22]，在豆科植物、柿樹(shù)、楊樹(shù)等植物中分離克隆得到了調(diào)控原花色素合成代謝的MYB轉(zhuǎn)錄因子[23-25]，在擬南芥和葡萄中還克隆得到了一些調(diào)控黃酮醇代謝途徑的MYB轉(zhuǎn)錄因子[26-28]，最近的研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入MYB、bHLB還可以激活黃烷醇類(lèi)次生代謝途徑上結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[29]。茶樹(shù)中關(guān)于類(lèi)黃酮合成相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究主要集中在對(duì)花青素合成代謝相關(guān)途徑的調(diào)控[30-31]，對(duì)兒茶素合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能研究則未見(jiàn)報(bào)道。本研究在前期對(duì)高酯型兒茶素轉(zhuǎn)錄組信息分析的基礎(chǔ)上，對(duì)之前課題組篩選出的6個(gè)與兒茶素總量、酯型兒茶素含量的關(guān)聯(lián)系數(shù)均在0.75以上的MYB轉(zhuǎn)錄因子[32]，采用生物信息學(xué)的方法，分析其蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系、結(jié)構(gòu)功能以及差異表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究茶樹(shù)兒茶素合成過(guò)程中相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

茶樹(shù)MYB序列來(lái)源于本課題組構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI：SRP059658），通過(guò)基因功能注釋和前期“茶樹(shù)芽葉兒茶素含量與轉(zhuǎn)錄因子MYB、bHLH關(guān)聯(lián)分析”[32]的研究，獲得6條與兒茶素總量、酯型兒茶素含量關(guān)聯(lián)系數(shù)均在0.75以上的MYB蛋白基因（表1）。

1.2 方法

1.2.1 茶樹(shù)兒茶素合成相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子生物信息學(xué)分析

利用在線(xiàn)工具ProtParam （http：//web.expasy. org/protparam）對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)分析，并用PSIPRED（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred）在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)SWISS- MODEL（https://www.swissmodel. expasy.org）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行MYB蛋白三維結(jié)構(gòu)的同源建模預(yù)測(cè)，登錄SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP）完成MYB蛋白的信號(hào)肽分析，采用TargetP-1.1（http://www.cbs.dtu.dk/ services/TargetP）和BaCello（http://gpcr.biocomp. unibo.it/bacello）在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；通過(guò)NCBI served Domains 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）在線(xiàn)分析MYB蛋白保守結(jié)構(gòu)域。

表1 基于轉(zhuǎn)錄組篩選的與兒茶素合成相關(guān)的茶樹(shù)MYB序列

注：“-”基因功能未注釋。Note: Gene function was not annotated.

表2 茶樹(shù)兒茶素合成相關(guān)MYB蛋白理化性質(zhì)

1.2.2 茶樹(shù)兒茶素合成相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子同源性分析

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Blast工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對(duì)茶樹(shù)兒茶素合成相關(guān)的6個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，使用DNAMAN構(gòu)建6個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 茶樹(shù)兒茶素合成相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子差異表達(dá)分析

參照GB/T 8318—2008茶葉中茶多酚和兒茶素含量的檢測(cè)方法，對(duì)高酯型兒茶素新品系“1005”（E）及其父本黃旦（M）、母本福云七號(hào)（F）的芽頭、二葉、四葉進(jìn)行兒茶素含量檢測(cè)，并對(duì)其進(jìn)行雜交優(yōu)勢(shì)分析。

中親優(yōu)勢(shì)=（E－雙親均值）/雙親均值í100%

超親優(yōu)勢(shì)=（E－高親本值）/高親本值í100%

負(fù)向超親優(yōu)勢(shì)=（E－低親本值）/低親本值í100%

利用高酯型兒茶素新品系“1005”（E）及其父本黃旦（M）、母本福云七號(hào)（F）不同發(fā)育時(shí)期的鮮葉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析6個(gè)與兒茶素合成相關(guān)的MYB基因在茶樹(shù)葉片不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異，以及在親代遺傳上的表達(dá)規(guī)律。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)兒茶素合成相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子理化性質(zhì)分析

采用Open Reading Frame Finder將6個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子的cDNA序列翻譯成氨基酸，利用ProtParam分析MYB蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)表2。6個(gè)與兒茶素合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白相對(duì)分子量在8~53?ku之間，其中comp150334_c1、comp130756_c0、comp109329_c0和comp159173_c0 4個(gè)為酸性蛋白（理論等電點(diǎn)<7），comp143073_c0和comp166178_c0為堿性蛋白（理論等電點(diǎn)>7）。穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，comp166178_c0的不穩(wěn)定指數(shù)為38.36，小于40，判定其為穩(wěn)定蛋白[33]，其余均為不穩(wěn)定蛋白（Ⅱ>40）。平均親水指數(shù)均小于0，說(shuō)明6個(gè)MYB蛋白均為親水性蛋白。

2.2茶樹(shù)兒茶素合成相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白的生物功能除了受氨基酸序列的影響之外，其空間結(jié)構(gòu)通常也可以幫助我們理解蛋白質(zhì)的功能單位。利用PSIPRED在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)茶樹(shù)6個(gè)與兒茶素合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)（圖1），發(fā)現(xiàn)這些基因編碼的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)基本都是由α-螺旋和無(wú)規(guī)則的卷曲組成，其中comp150334_c1、comp143073_c0、comp130756_c0、comp109329_c0和comp166178_c0編碼的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋（Helix）比例分別為24.54%、11.31%、38.38%、41.49%、53.33%，無(wú)規(guī)則卷曲（Disordered）所占的比例分別為75.46%、83.74%、61.62%、58.11%、46.67%，在comp143073_c0編碼的蛋白中發(fā)現(xiàn)有4.95%的β-折疊（Sheet）。在comp159173_c0中僅發(fā)現(xiàn)3個(gè)構(gòu)成α-螺旋的氨基酸殘基，7個(gè)構(gòu)成β-折疊的氨基酸殘基，其余均為無(wú)規(guī)則的卷曲，占到氨基酸總量的91.53%。登錄swiss-model數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)6個(gè)基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源建模預(yù)測(cè)分析，預(yù)測(cè)得到的蛋白3D模型如圖2，其構(gòu)象與蛋白的理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖1 茶樹(shù)兒茶素合成相關(guān)MYB蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖2 茶樹(shù)兒茶素合成相關(guān)MYB蛋白空間構(gòu)象

2.3茶樹(shù)兒茶素合成相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)肽與亞細(xì)胞定位分析

信號(hào)肽是指位于分泌蛋白N端的一段由15~30個(gè)氨基酸殘基組成的疏水性短肽鏈，其功能主要是引導(dǎo)蛋白質(zhì)多肽鏈完成跨膜轉(zhuǎn)移。通過(guò)信號(hào)肽的分析不僅可以判斷一個(gè)蛋白質(zhì)是否為分泌蛋白，還能推測(cè)一個(gè)蛋白質(zhì)或新生肽鏈的細(xì)胞定位。利用SignalP 4.1 Server數(shù)據(jù)庫(kù)分析本研究涉及的6條蛋白質(zhì)序列，按照默認(rèn)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型和隱馬爾可夫模型進(jìn)行信號(hào)肽分析，結(jié)果顯示全部6條序列均不存在信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白，即6個(gè)MYB蛋白均在細(xì)胞內(nèi)完成相關(guān)生物功能。

為進(jìn)一步研究這些蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布，采用TargetP在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)6條氨基酸序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示comp143073_c0和comp159173_c0編碼的蛋白定位在葉綠體的概率為0.64和0.765，其余4個(gè)基因定位在其他細(xì)胞器（表3）。采用BaCello進(jìn)一步進(jìn)行定位分析，結(jié)果顯示這4個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)均定位在細(xì)胞核上。信號(hào)肽預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位分析的結(jié)果均排除了這6個(gè)基因編碼的蛋白為分泌蛋白，在細(xì)胞外發(fā)揮作用的可能，預(yù)測(cè)其在細(xì)胞內(nèi)完成相關(guān)生物學(xué)功能。

表3 茶樹(shù)兒茶素合成相關(guān)MYB蛋白亞細(xì)胞定位

注：置信度分類(lèi)從1到5，1表示最高的預(yù)測(cè)可靠度，difference>0.8; 2: 0.8>difference>0.6; 3:0.6>difference>0.4; 4: 0.4>difference>0.2; 5: 0.2>difference。定位：C葉綠體；M線(xiàn)粒體；_其他任何位置；*未知位置。

Note: Confidence level ranged from 1 to 5, and 1 shows the highest predicted reliability, difference>0.8. 2: 0.8>difference>0.6. 3:0.6>difference>0.4. 4: 0.4>difference>0.2. 5: 0.2>difference. Location: C, Chloroplast. M, Mitochondria. _, Other location.*, Unknown location

2.4茶樹(shù)兒茶素合成相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子保守基序分析

利用NCBI 序列分析工具Open Reading Frame Finder分析6條MYB基因的蛋白序列，將翻譯出的蛋白序列進(jìn)行BLASTP同源比對(duì)，對(duì)MYB蛋白進(jìn)行保守基序的分析（圖3）。結(jié)果顯示在comp150334_c1、comp143073_c0、comp109329_c0和comp166178_c0均發(fā)現(xiàn)1~2個(gè)高度保守的SANT結(jié)構(gòu)域（SWI, ADA, N-CoR and TFIIIB），說(shuō)明這4個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子都屬于典型的SANT家族基因。在comp150334_c1氨基酸序列的第9~125位置發(fā)現(xiàn)一個(gè)REB結(jié)構(gòu)域，屬于MYB超家族蛋白；在comp143073_c0氨基酸序列的第106~151位置發(fā)現(xiàn)一個(gè)COG結(jié)構(gòu)域，為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物（SAGA/ADA）亞基ADA的保守結(jié)構(gòu)域；在comp109329_c0氨基酸序列的第29~68位置發(fā)現(xiàn)一個(gè)PLN保守結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)為轉(zhuǎn)錄阻遏型因子MYB5的保守結(jié)構(gòu)域。另外在comp130756_c0氨基酸序列上發(fā)現(xiàn)兩個(gè)GT1保守結(jié)構(gòu)域，分別位于第98~160和391~456位置，為MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域，屬于SANT類(lèi)超家族基因；在氨基酸序列的第241~398位置發(fā)現(xiàn)一個(gè)PRK結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)為DNA聚合酶III的亞基保守結(jié)構(gòu)域。在comp159173_c0的氨基酸序列中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何保守基序。

2.5 茶樹(shù)兒茶素合成相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子同源性分析

將茶樹(shù)6個(gè)與兒茶素合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列通過(guò)NCBI在線(xiàn)BLASTP，獲得的同源比對(duì)結(jié)果表明，comp150334_c1與白樺（，AMR97400.1）相似性70%、可可（，EOY03526.1）相似性69%；comp143073_c0與茶樹(shù)（，AJF46887.1）相似性99%、亞洲棉（，KHG05222.1）相似性78%；comp130756_c0與麻風(fēng)樹(shù)（，XP_012089242.1）相似性53%、木薯（，XP_021620176.1）相似性52%；comp109329_c0與橡膠（，XP_021635948.1）相似性96%、核桃（，XP_018813014.1）相似性93%；comp159173_c0與葡萄（，XP_010651953.1）相似性56%、麻風(fēng)樹(shù)（，XP_018807434.1）相似性54%；comp166178_c0與其他物種間的相似性均低于50%。由此推測(cè)茶樹(shù)兒茶素合成相關(guān)的6個(gè)MYB蛋白可能屬于不同的亞型，具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。

為進(jìn)一步探究這6個(gè)MYB蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，利用DNAMAN軟件構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4），6個(gè)蛋白序列在進(jìn)化發(fā)育樹(shù)上形成了4個(gè)分支，comp150334_c1和comp109329_c0聚為一類(lèi)；comp143073_c0與comp159173_c0聚為一類(lèi)，另外兩個(gè)蛋白各占據(jù)一個(gè)分支。結(jié)合序列相似性和保守基序的分析可以發(fā)現(xiàn)，聚類(lèi)在一起蛋白comp150334_c1和comp109329_c0擁有大致相同的保守基序位置，在序列相似性上表現(xiàn)較低的兩個(gè)蛋白自成一簇，推測(cè)這兩個(gè)蛋白的基因可能來(lái)自不同的演化途徑，其親緣關(guān)系較較遠(yuǎn)，也有可能是目前可檢索到的這兩個(gè)蛋白的同源序列背景較少。

2.6 茶樹(shù)兒茶素合成相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子差異表達(dá)分析

參照《GB/T 8318—2008茶葉中茶多酚和兒茶素含量的檢測(cè)方法》，對(duì)高酯型兒茶素新品系“1005”（E）及其父本“黃旦”（M）、母本“福云七號(hào)”（F）的芽頭、二葉、四葉進(jìn)行兒茶素含量檢測(cè)，并對(duì)其進(jìn)行雜交優(yōu)勢(shì)分析，結(jié)果見(jiàn)表4。在子代“1005”的茶芽和二葉期，酯型兒茶素的含量超出四葉期2.6~3.6倍，兒茶素總量也超出四葉期1.8~2.2倍，同時(shí)兒茶素合成的雜交優(yōu)勢(shì)也主要體現(xiàn)在茶芽和二葉期。酯型兒茶素在茶樹(shù)鮮葉發(fā)育的各個(gè)時(shí)期都表現(xiàn)出超高親和部分超親的優(yōu)勢(shì)，而非酯型兒茶素則表現(xiàn)出負(fù)向超親優(yōu)勢(shì)，僅在四葉期表現(xiàn)出部分超親優(yōu)勢(shì)，兒茶素總量的雜交優(yōu)勢(shì)同酯型兒茶素的變化類(lèi)似。

圖3 茶樹(shù)兒茶素合成相關(guān)MYB蛋白的保守結(jié)構(gòu)域

圖4 茶樹(shù)兒茶素合成相關(guān)MYB蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

表4茶樹(shù)新品系“1005”及其父母本鮮葉不同發(fā)育時(shí)期兒茶素含量與雜交優(yōu)勢(shì)

Table4 Catechin contents and heterosis of ‘huangdan’, ‘fuyun 7’ and ‘1005’ tea plant in different leaf developmental stages

注：同一指標(biāo)中不同小寫(xiě)字母表示差異達(dá)到1%顯著水平，大寫(xiě)字母表示差異達(dá)到0.5%顯著水平，“- -”和“-”分別表示負(fù)向完全優(yōu)勢(shì)和負(fù)向中親優(yōu)勢(shì)，“++”和“+”分別表示超親優(yōu)勢(shì)和中親優(yōu)勢(shì)

Note: In the same index, the different alphabet of small letters indicates difference to 1% significant level, and capital letters indicates 0.5%. The items of “--” and “-” indicate negative complete advantage and negative mid-parent heterosis, respectively. The items of “++” and “+” indicate over-parent heterosis and mid-parent heterosis, respectively.

基因決定表型是生物遺傳的規(guī)律，為了進(jìn)一步探究?jī)翰杷睾颗c茶樹(shù)兒茶素合成相關(guān)的6個(gè)MYB因子之間的關(guān)系，本研究利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析這6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在茶樹(shù)葉片不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異，用RPKM（Reads Per Kilo bases per Million mapped reads）來(lái)估算基因的表達(dá)量[34]。

差異表達(dá)的結(jié)果顯示，只有comp166178_c0基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量無(wú)顯著差異。進(jìn)一步分析其余5個(gè)基因在子代和父母本的鮮葉不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異（圖5）發(fā)現(xiàn)在茶樹(shù)嫩芽中，5個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因在子代“1005”中都表現(xiàn)出超高親優(yōu)勢(shì)。在子代“1005”的二葉中，comp150334_c1基因表現(xiàn)出超高親優(yōu)勢(shì)，而comp109329_c0基因表現(xiàn)出負(fù)向完全優(yōu)勢(shì)，comp143073_c0、comp130756_c0和comp159173_c0則表現(xiàn)出中親優(yōu)勢(shì)。在第四葉當(dāng)中的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，5個(gè)基因在母本福云七號(hào)中的表達(dá)量顯著高于在父本黃旦和子代“1005”中的表達(dá)量，comp150334_c1、comp109329_c0和comp159173_c0基因在子代中表現(xiàn)出負(fù)向中親優(yōu)勢(shì)，comp143073_c0基因表現(xiàn)出中親優(yōu)勢(shì)，而comp130756_c0基因則表現(xiàn)出負(fù)向完全優(yōu)勢(shì)。

圖5 茶樹(shù)新品系“1005”及其父母本鮮葉不同發(fā)育時(shí)期MYB基因表達(dá)差異

3 討論

植物MYB轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、生理代謝、細(xì)胞形態(tài)和模式建成等生理過(guò)程相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，在植物中普遍存在，同時(shí)也是植物中最大的轉(zhuǎn)錄家族之一[12]。兒茶素的生物合成是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程，受到大量關(guān)鍵酶基因的直接影響，而這些酶基因的表達(dá)又受到相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[18]。本研究基于高通量測(cè)序和基因功能分析發(fā)現(xiàn)的茶樹(shù)新品系及其父母本鮮葉不同發(fā)育時(shí)期與兒茶素合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，利用生物信息學(xué)的方法對(duì)這些轉(zhuǎn)錄因子基因的理化特征、結(jié)構(gòu)功能、進(jìn)化特征和表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子都屬于親水性的非分泌蛋白，說(shuō)明其發(fā)揮生物學(xué)功能的位置可能在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，與茶樹(shù)其他MYB家族蛋白的理化性質(zhì)類(lèi)似[35]，其中5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子帶有SANT保守位點(diǎn)。SANT結(jié)構(gòu)域的存在揭示了這些MYB蛋白在調(diào)控靶標(biāo)基因時(shí)可能是其中一個(gè)SANT結(jié)構(gòu)域與靶DNA結(jié)合，同時(shí)另一個(gè)SANT結(jié)構(gòu)域起到蛋白-蛋白相互作用的功能，或者通過(guò)SANT結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步增強(qiáng)MYB蛋白與靶標(biāo)DNA的相互作用[36]。系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果顯示這6個(gè)MYB蛋白可能屬于不同的亞型，推測(cè)其在功能上存在較顯著的差異，可能涉及到兒茶素代謝途徑的全過(guò)程。通過(guò)分析兒茶素含量和基因表達(dá)量之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)6個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量與兒茶素在鮮葉中的合成量呈正相關(guān)，說(shuō)明這6個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子在兒茶素的合成中起到正向調(diào)控的作用。

在植物中還存在著MYB、bHLH和WD40 3種蛋白的復(fù)合體結(jié)構(gòu)，簡(jiǎn)稱(chēng)MBW復(fù)合體。這些復(fù)合體也參與類(lèi)黃酮物質(zhì)的生物合成。擬南芥中的MBW復(fù)合體TT2/TT8/TTG1能夠調(diào)控種皮中原花青素的合成[37-38]。在矮牽牛中發(fā)現(xiàn)的 AN2/AN1/AN11復(fù)合體則通過(guò)調(diào)控花青素代謝途徑中重要的結(jié)構(gòu)基因DFR和CHSJ的表達(dá)從而控制花冠中花青素的合成[39-41]。本課題組前期的工作在高酯型茶樹(shù)新品系“1005”及其父母本不同發(fā)育時(shí)期的葉片中發(fā)現(xiàn)了顯著差異表達(dá)的MYB和bHLH兩類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，但是這些差異表達(dá)的基因與兒茶素含量的關(guān)聯(lián)系數(shù)卻很低，這表明它們可能對(duì)兒茶素的合成起到負(fù)調(diào)控作用或者需要與其他轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體協(xié)同調(diào)節(jié)兒茶素的合成代謝[32]。因此，繼續(xù)深入發(fā)掘MYB轉(zhuǎn)錄因子及其復(fù)合體在兒茶素合成代謝中的功能，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)茶樹(shù)兒茶素代謝的合成及調(diào)控過(guò)程，為茶樹(shù)育種和改良方式提供理論依據(jù)，這些將是今后研究的重點(diǎn)。

[1] 宛曉春. 茶葉生物化學(xué)[M]. 3 版. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2003: 9-18.

[2] Cabrera C, Aatacho R, and Gimenez R. Beneficial effects of green tea-a review [J]. J Am Coll Nutr, 2006, 25(2): 79-99.

[3] Lee M M, Schiefelbein J. Cell pattern in theroot epidermis determined by lateral inhibition with feedback [J]. Plant Cell, 2002, 14(3): 611-618.

[4] Zhang Y, Cao G, Qu LJ, et al. Characterization ofMYB transcription factor gene AtMYB17 and its possible regulation by LEAFY and AGL15 [J]. J Genet. Genomics, 2009, 36(2): 99-107.

[5] Fornalé S, Lopez E, Salazar-Henao J E, et al. AtMYB7: a new player in the regulation of UV-sunscreens in[J]. Plant Cell Physiol, 2014, 55(3): 507-516.

[6] Raffaele S, Rivas R, Roby D. An essential role for salicylic acid in AtMYB30-mediated control of the hypersensitive cell death program in[J]. FEBS Lett, 2006, 580(14): 3498-3504.

[7] Li M, Dong XJ, Peng JQ, et al. De novo transcriptome sequencing and gene expression analysis reveal potential mechanisms of seed abortion in dove tree (Baill.) [J]. BMC Plant Biol, 2016, 16(82): 1-21.

[8] Park MY, Kang JY, Kim SY. Overexpression of AtMYB52 confers ABA hypersensitivity and drought tolerance [J]. Mol Cells, 2011, 31(5): 447-454.

[9] Vom Endt D, Kijne JW, Memelink J. Transcription factors controlling plant secondary metabolism: what regulates the regulators[J]. Phytochemistry, 2002, 61(2): 107-114.

[10] Song SS, Qi TC, Huang H, et al. The Jasmonate-ZIM domain proteins interact with the R2R3-MYB transcription factors MYB21 and MYB24 to affect Jasmonate-regulated stamen development in[J]. Plant Cell, 2011, 23(3): 1000-1013.

[11] Schwinn KE, Murray MR, Bradley JM, et al. MYB and bHLH transcription factor transgenes increase anthocyanin pigmentation in petunia and lisianthus plants, and the petunia phenotypes are strongly enhanced under field conditions [J]. Front Plant Sci, 2014, 5: 603.

[12] 牛義嶺, 姜秀明, 許向陽(yáng). 植物轉(zhuǎn)錄因子MYB基因家族的研究進(jìn)展[J]. 分子植物育種, 2016, 14(8): 2050-2059.

[13] 成浩, 李素芳. 茶樹(shù)中的類(lèi)黃酮物質(zhì)及其生物合成途徑[J]. 中國(guó)茶葉, 1999, 6(1): 6-8.

[14] 馬春雷, 喬小燕, 陳亮. 茶樹(shù)無(wú)色花色素還原酶基因克隆及表達(dá)分析[J]. 茶葉科學(xué), 2010, 30(1): 27-36.

[15] 馬春雷, 陳亮. 茶樹(shù)黃酮醇合成酶基因的克隆與原核表達(dá)[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2009, 28(3): 433-438.

[16] Mamati G E, Liang Y, and Lu J. Expression of basic genes involved in tea polyphenol synthesis in relation to accumulation of catechins and total tea polyphenols [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2006, 86: 459-464.

[17] 馬春雷. 茶樹(shù)查爾酮異構(gòu)酶、黃酮醇合成酶和無(wú)色花色素還原酶等基因的克隆與表達(dá)分析[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2007.

[18] 邢文, 金曉玲. 調(diào)控植物類(lèi)黃酮合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展[J]. 分子植物育種, 2015, 13(3): 689-696.

[19] Aharoni A, De Vos CH, Wein M, et al. The strawberry FaMYB1 transcription factor suppresses anthocyanin and flavonol accumulation in transgenic tobacco [J]. Plant J, 2001, 28(3): 319-332.

[20] Ballester AR, Molthoff J, de Vos R, et al. Biochemical and molecular analysis of pink tomatoes: deregulated expression of the gene encoding transcription factor SlMYB12 leads to pink tomato fruit color [J]. Plant Physiol, 2010, 152(1): 71-84.

[21] Espley RV, Hellens RP, Putterill J, et al. Red colouration in apple fruit is due to the activity of the MYB transcription factor, MdMYB10 [J]. Plant J, 2007, 49(3): 414-427.

[22] Jung CS, Grifliths HM, De Jong DM, et al. The potato developer(D) locus encodes an R2R3MYB transcription factor that regulates expression of multiple anthocyanin structural genes in tuber skin [J]. Theor Appl Genet, 2009, 120(1): 45-57.

[23] Yoshida K, Iwasaka R, Kaneko T, et al. Functional differentiation of lotus japonicus TT2s, R2R3-MYB transcription factors comprising a multigene family [J]. Plant Cell Physiol, 2008, 49(2): 157-169.

[24] Akagi T, Ikegami A, Tsujimoto T, et al. DkMyb4 is a Myb transcription factor involved in proanthocyanidin biosynthesis in persimmon fruit [J]. Plant Physiol, 2009, 151(4): 2028-2045.

[25] Mellway R D, Tran L T, Prouse M B, et al. The wound-, pathogen-, and ultraviolet B-responsive MYB134 gene encodes an R2R3 MYB transcription factor that regulates proanthocyanidin synthesis in poplar [J]. Plant Physiology, 2009, 150(2): 924-941.

[26] Mehrtens F, Kranz H, Bednarek P, et al. The Arabidopsis transcription factor MYB12 is a flavonol-specific regulator of phenylpropanoid biosynthesis [J]. Plant Physiol, 2005, 138(2): 1083-1096.

[27] Stracke R, Ishihara H, Huep G, et al. Differential regulation of closely related R2R3-MYB transcription factors controls fiavonol accumulation in different parts of theseedling [J]. Plant J, 2007, 50(4): 660-677.

[28] Czemmel S, Stracke R, Weisshaar B, et al. The grapevine R2R3-MYB transcription factor VvMYBF1 regulates fiavonol synthesis in developing grape berrie [J]. Plant Physiol, 2009, 151(3): 1513-1530.

[29] Bovy A, de Vos R, Kemper M, et al. High-flavonol tomatoes resulting from the heterologous expression of the maize transcription factor genes LC and C1 [J]. Plant Cell, 2002, 14(10): 2509-2526.

[30] 陳瑋, 趙賢倩, 吳亞會(huì), 等. 茶樹(shù)MYB7轉(zhuǎn)錄因子功能的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 42(6): 841-848.

[31] 孫彬妹. 茶樹(shù)MYB轉(zhuǎn)錄因子CsAN1調(diào)控花青素的作用機(jī)制研究[D]. 廣州: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.

[32] 葛國(guó)平, 吳亮宇, 張少雄, 等. 茶樹(shù)芽葉兒茶素含量與轉(zhuǎn)錄因子MYB、bHLH關(guān)聯(lián)分析[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 9: 28-32.

[33] 薛慶中. DNA和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)分析工具[M]. 3版. 北京: 科學(xué)出版社, 2010: 75-106.

[34] Mortazavi A, Williams B, Mccue K, et al. Apping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq [J]. Nature methods, 2008, 5(7): 621-628.

[35] 羅勇, 歐淑瓊, 陳絲, 等. 基于RNA-Seq的茶樹(shù)Cs-MYB生物信息學(xué)分析[J]. 分子植物育種, 2017, 15(6): 2119-2125.

[36] 諶章舟. CoREST SANT結(jié)構(gòu)域蛋白與非編碼小dsRNA相互作用模式的初步研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

[37] Debeaujon I, Nesi N, Perez P, et al. Proanthocyanidin-accumulating cells intesta: regulation of differentiation and role in seed development [J]. Plant Cell, 2003, 15(11): 2514-2431.

[38] Baudry A, Caboche M, Lepiniec L. TT8 controls its own expression in a feedback regulation involving TTG1 and homologous MYB and bHLH factors, allowing a strong and cell-specific accumulation of fiavonoids in[J]. Plant J, 2006, 46(5): 768-779.

[39] Quattrocchio F, Wing J F, Leppen HTC, et al. Regulatory genes controlling anthocyanin pigmentation are functionally conserved among plant species and have distinct sets of target genes [J]. Plant Cell, 1993, 5(11): 1497-1512.

[40] de Vetten N, Quattrocchio F, Mol J, et al. The an11 locus controlling fiower pigmentation in petunia encodes a novel WD-repeat protein conserved in yeast, plants, and animals [J]. Genes Dev, 1997, 11(11): 1422-1434.

[41] Spelt C, Quattrocchio F, Mol J, et al. ANTHOCYANIN1 of petunia controls pigment synthesis, vacuolar pH, and seed coat development by genetically distinct mech anisms [J]. Plant Cell, 2002, 14(9): 2121-2135.

Bioinformatic Analysis of MYB Transcription Factors Involved in Catechins Biosynthesis in Tea Plant ()

ZHANG Yue, HU Yunfei, WANG Shumao, KE Zixing, LIN Jinke*

Anxi College of Tea Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China

Six MYB transcription factors involved in the biosynthesis of catechins were obtained from the tea plant () transcriptome database. Bioinformatic analysis including the physicochemical properties and structural functions of proteins, nuclear localization signal (NLS), protein conserved domain (PCD) and phylogenetic tree analysis were performed. The results demonstrated that the 6 MYB proteins involved in the biosynthesis of catechins belong to hydrophilic non-secretory proteins and are predicted to be located in the chloroplasts, mitochondria and nucleus. The main spatial structures are α-helixes and β-turns. Except the comp159173_c0, the other 5 genes belong to SANT super-family group based on the PCD analysis. The phylogenetic tree analysis shows that 6 MYB proteins are classified into 4 groups, indicating a distant relationship between them. Differential gene expression analysis further confirmed the close correlation between the 6 transcription factors and the catechin biosynthesis.

catechins, MYB transcription factors, bioinformatics

S571.1；Q946.8

A

1000-369X(2018)02-162-12

2017-10-12

2017-11-03

福建省教育廳中青年教師教育科研項(xiàng)目（JAT170178）、福建農(nóng)林大學(xué)人才引進(jìn)科研啟動(dòng)基金（KXR15008A）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31170651）

張玥，女，講師，博士研究生，主要從事茶樹(shù)分子生物學(xué)研究，yaoyao86527@163.com。

ljk213@163.com