茶樹CsSnRK2.1、CsSnRK2.2基因的克隆及在非生物脅迫中的響應

張永恒，萬思卿，陳江飛，王偉東，周天山，肖斌，楊亞軍,2*，余有本*

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茶樹、基因的克隆及在非生物脅迫中的響應

張永恒1，萬思卿1，陳江飛1，王偉東1，周天山1，肖斌1，楊亞軍1,2*，余有本1*

1. 西北農(nóng)林科技大學園藝學院，陜西 楊凌 712100； 2. 中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所/國家茶樹改良中心/農(nóng)業(yè)部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，浙江 杭州 310008

蔗糖非酵解型蛋白激酶（SnRK）是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，其中SnRK2家族在植物非生物脅迫響應過程中起著十分重要的作用。為了探究茶樹家族基因響應逆境的分子機制，本研究克隆了兩個茶樹SnRK2家族基因，并分別命名為（GenBank登錄號：MG026837）和（GenBank登錄號：MF662805），生物信息學分析表明和分別編碼358個和337個氨基酸，與擬南芥和玉米SnRK2蛋白激酶的同源性很高，均具有保守的ATP結合位點和Ser/Thr激酶活性結構域。在高鹽、干旱和ABA脅迫下，均能被誘導表達，且呈現(xiàn)先升后降趨勢，而在低溫和高溫脅迫下表達量變化不大；能強烈響應高鹽脅迫，也能被高溫誘導上調(diào)表達；表明它們可能與茶樹抗逆密切相關。

茶樹；SnRK2s；克?。环巧锩{迫

蛋白激酶在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著十分重要的功能，廣泛參與植物細胞分化、物質(zhì)能量代謝以及逆境響應等一系列生理活動[1]。蔗糖非酵解型蛋白激酶（Sucrose non-fermenting-1-related protein kinase，SnRK）是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，根據(jù)其結構特點和功能可分為SnRK1、SnRK2、SnRK3三個家族[2]，其中SnRK2家族是植物中特有的蛋白激酶，在植物遭受逆境脅迫時起至關重要的作用。在玉米[3]、煙草[4]、小麥[5]、葡萄[6]、楊樹[7]等植物中，均廣泛參與了非生物脅迫的響應，且其表達水平與植物的抗逆能力密切相關[8]。譬如，過表達甘蔗的轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性顯著提升[9]，過表達楊樹和能大幅度增加擬南芥的耐鹽能力[10]，過表達小麥的擬南芥具有抗低溫、高鹽、干旱等多種抗性[11]。

植物應答逆境脅迫的過程十分復雜，涉及多種信號通路，根據(jù)是否有ABA參與可分為ABA依賴途徑和ABA非依賴途徑[12]。SnRK2在ABA依賴途徑和ABA非依賴途徑中均發(fā)揮重要調(diào)控作用，如在過表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥中，通過ABA非依賴途徑，增強了轉(zhuǎn)基因植株的耐旱、耐低溫能力[13]；在干旱條件下能響應體內(nèi)ABA信號，調(diào)控氣孔的關閉減少失水，增加擬南芥的抗旱能力[14]。目前，SnRK2參與ABA非依賴途徑的分子機制尚不清楚；而在ABA依賴途徑中，SnRK2蛋白激酶被證實為核心調(diào)控因子：當植物遭受逆境脅迫時，ABA在細胞內(nèi)快速積累，ABA受體特異性地感知ABA信號并與之結合，形成ABA-PYR/PYL/ RCAR復合體，該復合體進一步與A型PP2C結合，促使SnRK2激酶與PP2C分離，SnRK2的活性得以釋放。活性狀態(tài)下的SnRK2蛋白激酶能激活下游轉(zhuǎn)錄因子ABF/AREB或離子通道，誘導ABA應答基因的表達，從而增強植物抵抗逆境的能力[15-17]。

茶樹是我國重要的葉用經(jīng)濟作物，近年來部分茶區(qū)低溫、干旱等極端天氣頻發(fā)，茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)嚴重受損，比如，2013年夏天罕見的高溫干旱使浙江省13.86萬hm2茶園遭受危害，經(jīng)濟損失達到17.2億元[18]。所以探究茶樹的抗逆機制，培育新型抗逆茶樹品種迫在眉睫。然而，與其他植物相比，茶樹非生物脅迫方面的研究還比較薄弱，迄今還未見關于茶樹家族基因功能的研究報道。本研究克隆了兩個茶樹家族基因，并分析了它們在多種脅迫下的表達模式，以期為深入研究基因在茶樹非生物脅迫中的響應機制提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理方法

試驗材料為培養(yǎng)于西北農(nóng)林科技大學科研溫室的一年生龍井長葉茶樹品種水培茶苗，培養(yǎng)條件為白天25℃，晚上22℃，自然光照；選取生長健壯，長勢一致的茶苗分別用ABA（100?μmol·L-1），NaCl（200?mmol·L-1），20% PEG 6000，4℃，38℃處理；ABA處理時，先將ABA溶于少量95%乙醇，然后用蒸餾水配制成終濃度為100?μmol·L-1的溶液，均勻噴灑在水培茶苗葉片上，在處理后0、2、4、8、12、24?h時從至少3株茶苗幼嫩枝條頂端分別取2~3片幼嫩葉片混合后分成3份；PEG和NaCl處理時，向培養(yǎng)液中加入固體PEG和NaCl，攪拌至完全溶解后，將茶苗的根部完全浸沒在培養(yǎng)液中進行鹽脅迫和模擬干旱處理，在處理后0、2、4、8、12、24?h時按照ABA處理后同樣的方法進行取樣；高溫、低溫處理在光照培養(yǎng)箱中進行，當溫度達到設定值時迅速將水培茶苗移至光照培養(yǎng)箱中，在處理后0、2、4、8、12、24?h時按照ABA處理后同樣的方法進行取樣。另采集多株未處理水培茶苗的根、莖、葉和花等組織，所有樣品液氮速凍后保存于–80℃，用于提取RNA。

1.2 SnRK2基因的克隆

采用CTAB法提取茶樹葉片總RNA[19]，–80℃保存。cDNA第一鏈合成按照5×All-In-One RT MasterMix試劑盒（abm，加拿大）說明書進行。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分別設計兩對基因特異性引物（表1），以cDNA第一鏈為模板，進行PCR擴增；PCR擴增條件為：94℃、5?min；94℃、30?s，59℃、30?s，72℃、100?s，35個循環(huán)；72℃后延伸5?min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，目的片段按照PCR純化試劑盒Gel Extraction Kit（OMEGA，美國）進行回收，連接到pMDTm19-T Vetor（TAKARA，大連寶生物），然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，挑選陽性單克隆送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。

1.3 生物信息學分析

利用NCBI中的ORF finder進行ORF的查找和編碼氨基酸的推導；用ProtParam tool進行蛋白相對分子量及理論等電點的分析，用NetPhos 3.1 Server進行蛋白的磷酸化位點預測；用ProtScale分析疏水性，用WoLF PSORT進行蛋白亞細胞定位預測，用DNAMAN7.0進行多序列比對，用MEGA7.0進行進化樹的構建。

表1 引物序列

1.4 實時熒光定量PCR分析

2 結果分析

2.1 基因克隆及序列分析

以龍井長葉茶樹葉片cDNA為模板，用特異性引物F/R和F/R進行PCR擴增，分別得到長度為1?373?bp（圖1-A）和1?164?bp（圖1-B）的片段；測序結果表明，這兩條序列與本課題組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，將兩條序列提交到NCBI，登錄號分別為MG026837（）和MF662805（）。ORF finder分析表明的ORF框為1?077?bp，編碼358個氨基酸；的ORF框為1?014?bp，編碼337個氨基酸。

2.2 生物信息學分析

2.2.1 同源比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

將和的ORF序列在NCBI中分別進行BLASTX比對，結果表明它們都屬于SnRK2家族，并且與其他物種的SnRK2家族成員具有高度的相似性，其中與葡萄SRK2A（XP_002269221.1）、蘋果SnRK2.9（NP_001306943.1）、馬鈴薯SnRK2.4（NP_001274892.1）、煙草SRK2A（NP_001312448.1）等物種的SnRK2成員相似性均高達90%以上；與木薯SAPK2（XP_021600376.1）、麻風樹SAPK2（XP_012067903.1）等物種的SnRK2成員相似性也分別達到87%和85%。

注：M. marker, A. CsSnRK2.1擴增產(chǎn)物，B. CsSnRK2.2擴增產(chǎn)物。

圖2 CsSnRK2.1和CsSnRK2.2進化分析

圖3 茶樹CsSnRK2.1和CsSnRK2.2與其他植物SnRK2s的氨基酸序列比對

將和的氨基酸序列與擬南芥和水稻SnRK2家族成員的氨基酸序列在MEGA7.0中采用鄰接法進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結果表明與Group 1成員AtSnRK2.10和AtSnRK2.4聚在一簇，與Group 2成員AtSnRK2.8聚在一簇（圖2），表明它們分別屬于Group 1和Group 2家族，對比它們的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)它們在N端相似性很高，均含有保守的ATP結合位點DXGXGNFGVAXL和Ser/Thr激酶活性結構域（活化環(huán)）KICDFGYSKSXXXHGXPK（圖3）。

2.2.2 CsSnRK2.1和CsSnRK2.2蛋白磷酸化位點預測

SnRK2s蛋白屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，因此其活性受到絲氨酸/蘇氨酸的磷酸化調(diào)控。在NetPhos 3.1 Server中對兩個蛋白進行磷酸化位點預測，結果表明，兩個蛋白中均含有大量的磷酸化位點。有磷酸化位點29個，其中絲氨酸位點14個，蘇氨酸位點9個，酪氨酸位點6個（圖4-A）；有磷酸化位點27個，其中絲氨酸位點15個，蘇氨酸位點6個，酪氨酸位點6個（圖4-B）。

2.2.3和蛋白親水/疏水性分析及亞細胞定位預測

用ProtScale結合ProtParam tool對和進行親水/和疏水性分析，結果如圖5所示。從圖中可以看出，和均為親水蛋白，其中的平均疏水系數(shù)為–0.608，在191和192號氨基酸位置出現(xiàn)最大親水系數(shù)2.189，在335號氨基酸位置出現(xiàn)最小親水系數(shù)–3.5（圖5-A）；而平均疏水系數(shù)為–0.275，同樣在191和192號氨基酸位置出現(xiàn)最大親水系數(shù)，而最小親水系數(shù)則出現(xiàn)在40號氨基酸位置（圖5-B）。另外，WoLF PSORT中亞細胞定位預測定位于胞質(zhì)骨架上，而定位到細胞質(zhì)中。

圖4 CsSnRK2.1和CsSnRK2.2磷酸化位點預測

2.3 茶樹不同組織中CsSnRK2.1和CsSnRK2.2的表達分析

實時熒光定量結果表明，在嫩葉中表達量最高，其次是根，在花中表達量最低；而在根和葉片表達量相當且最高，其次是花，在莖中表達量最低（圖6）。

2.4 非生物脅迫對CsSnRK2.1和CsSnRK2.2的表達分析

熒光定量PCR法分析了非生物脅迫后兩個基因表達水平的變化情況，結果如圖7所示。從圖中可以看出，兩個基因在不同逆境脅迫下的表達模式有較大差異。

2.4.1 NaCl脅迫對茶樹基因表達的影響

從圖7-A中可以看出，NaCl處理后，和的表達量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，峰值均出現(xiàn)在2?h時左右；但各時間段的表達水平明顯高于，且在8?h后就降至正常值，而仍然穩(wěn)定在處理前2倍左右。

圖5 CsSnRK2.1和CsSnRK2.2蛋白親/疏水性分析

注：誤差線表示3次生物學重復的標準誤差。

2.4.2 溫度脅迫對茶樹基因表達的影響

從圖7-B和圖7-C中可以看出，高溫（38℃）脅迫24?h內(nèi)，的表達量沒有較大變化，而的表達量在8?h開始上升，12?h達到處理前2.5倍左右，然后又回落到處理前水平；低溫脅迫后，的表達量呈先升后降趨勢，4?h表達量最高，約為脅迫前的2.5倍左右，而對低溫似乎不敏感，僅在4?h時小幅上調(diào)。

注：誤差線表示3次生物學重復的標準誤差

2.4.3干旱脅迫和ABA處理對茶樹基因表達的影響

用20% PEG6000處理模擬干旱脅迫后，的表達量在24?h內(nèi)都比較穩(wěn)定，而的表達被強烈誘導，8?h達到峰值，約為處理前6倍左右（圖7-D）。

從圖7-E可知，ABA處理后，的表達不能被誘導，的表達量在2?h時上升至處理前的2.5倍左右，然后逐漸下降，12?h恢復到處理前水平。

3 討論

SnRK2是植物響應非生物脅迫的關鍵調(diào)控因子[8]，對它的研究有利于進一步揭示植物抗逆機制。目前SnRK2家族成員功能的研究主要集中在擬南芥、水稻、玉米等模式植物，而茶樹SnRK2家族成員的功能及其分子機制還有待研究。本研究從茶樹品種中克隆得到了兩個SnRK2基因，它們編碼的氨基酸序列與其他物種的SnRK2成員具有較高同源性，尤其是N端的ATP結合位點和活化環(huán)區(qū)域。目前已經(jīng)鑒定出了很多SnRK2的關鍵磷酸化位點，如擬南芥AtSnRK2.6[21]活化環(huán)中的Ser175，AtSnRK2.10[22]活化環(huán)中的Ser158，它們與激酶活性密切相關。和活化環(huán)內(nèi)的158位氨基酸均為Ser，與AtSnRK2.10一致，表明和的激酶活性可能也與Ser158密切相關。

已有的研究表明SnRK2家族基因廣泛參與植物的逆境響應過程[11,23-24]。本研究的結果亦證實和與茶樹的逆境響應密切相關。在鹽脅迫下，和的表達量均出現(xiàn)先升高后降低的變化，說明它們參與了茶樹對鹽脅迫的響應；而的表達量始終高于，表明它們對鹽脅迫的響應程度不同，這與馬鈴薯[25]、棉花[26]等作物中的研究結果相同；另外，擬南芥中和均被證實在鹽脅迫下能維持根部的生長及穩(wěn)定性[27]，系統(tǒng)進化樹表明與和親緣關系最近，推測在鹽脅迫下也可能與茶樹根部的生長相關。植物體內(nèi)往往有多個基因能被PEG激活，但它們響應PEG的快慢及受誘導程度有很大區(qū)別[28-29]。本研究中能迅速、強烈且持續(xù)地被PEG誘導上調(diào)表達，表明它在茶樹應對干旱脅迫過程中發(fā)揮了重要作用，的表達量在24?h時上升至處理前2倍，但24?h后其表達量變化情況還有待進一步研究。和受低溫誘導后都僅在4?h時上調(diào)表達，而在煙草[4]、小麥[30]等作物中與低溫密切相關的基因都被持續(xù)誘導，說明茶樹中和很可能不是響應低溫脅迫的關鍵基因。在高溫脅迫下，的表達量相對穩(wěn)定，表明它不響應高溫脅迫；而的表達量出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，與玉米[31]在高溫脅迫下的表達趨勢相同，推測它可能參與了茶樹對高溫的響應過程。

SnRK2參與非生物脅迫的信號通路可以分為ABA依賴途徑和ABA非依賴的兩種途徑[12]。Kobayashi等[15]研究表明10個水稻成員均受到高滲透脅迫的誘導，但只有Group 3亞家族成員（、和）能被ABA誘導；擬南芥的10個SnRK2成員中也只有Group 3亞家族成員（、和）能被ABA強烈激活[32]。本研究中和分別屬于Group 1、Group 2亞家族；ABA處理24?h內(nèi)，的表達量始終沒有明顯變化，說明它可能與小麥[11]、煙草[24]等作物中Gorup 2亞家族成員一樣，主要是通過ABA不依賴途徑參與植物抗逆反應；而能被ABA誘導上調(diào)表達，與擬南芥、水稻的研究結果不一致，但楊樹[7]中Gorup 1亞家族成員基因也能被ABA誘導上調(diào)表達，說明家族基因Group 1亞家族成員對ABA的響應可能具有物種特異性。然而茶樹是否參與了ABA依賴的信號途徑、其分子機制如何仍不清楚，這將是后期的研究重點。

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Cloning and Expression Analysis ofandGenes in Tea Plant () under Abiotic Stress

ZHANG Yongheng1, WANG Siqing1, CHEN Jiangfei1, WANG Weidong1, ZHOU Tianshan1, XIAO Bin1, YANG Yajun1,2*, YU Youben1*

1. College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Tea Research Institute of Chinese Academy, Agricultural Sciences/National Center for Tea Improvement / Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China

Sucrose non-fermenting-1-related protein kinase (SnRK) is a kind of serine/threonine protein kinases widely exist in plants. Among them, members of SnRK2 family play a vital role in plant response to stresses. In order to investigate the molecular mechanisms ofin response to abiotic stresses, twogenes from tea plant were cloned and named as(GenBank accession code: MG026837) and(GenBank accession code: MF662805) respectively. Bioinformatics analysis showedthat they contained 358 and 337 amino acids respectively, which harbored a conserved ATP binding site and Ser/Thr kinase domain and were highlysimilar to SnRK2 protein kinase ofand maize. The expression ofwas transiently induced and then decreased by high salinity (100?mmol·L-1NaCl), drought (20% PEG6000) and ABA(100?μmol·L-1) stress, but showed no significant changes under low (4℃) or high temperature treatments (38℃).By contrast,was strongly induced by high salt and temperature treatments. The results revealed thatandmight be closely related to stress responses in tea plant.

tea plant (), SnRK2s, cloning, abiotic stress

S571.1；Q52

A

1000-369X(2018)02-183-10

2017-06-05

2017-08-01

國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術體系、漢中綜合試驗站（CARS-23）、陜西省農(nóng)業(yè)專項資金項目（tg2015-099）、中國博士后科學基金面上項目（2016M602873）

張永恒，男，碩士研究生，主要從事茶樹分子育種研究。