慢性間歇性缺氧對(duì)大鼠肝臟糖代謝的影響及機(jī)制

余維，覃澤平，陳華嬌，張峰，李兵

睡眠呼吸疾病主要包括各種在睡眠狀態(tài)下出現(xiàn)呼吸障礙的疾病，其中，阻塞性睡眠呼吸暫停[1]、中樞性睡眠呼吸障礙及周期性睡眠呼吸障礙[2]三種睡眠呼吸疾病較為常見(jiàn)。睡眠呼吸疾病與糖代謝密切相關(guān)，其中胰島素抵抗(insulin resistance，IR)發(fā)揮著重要作用。睡眠呼吸疾病可獨(dú)立于肥胖、年齡、性別、生活習(xí)慣等因素而導(dǎo)致IR。肝臟是參與機(jī)體糖代謝的重要器官，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(glucose transporter 2，GLUT-2) 是肝細(xì)胞中最主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，具有低親和力和高運(yùn)轉(zhuǎn)能力，與葡萄糖激酶形成葡萄糖感受器，轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)一系列信號(hào)的傳遞調(diào)節(jié)胰島素的合成與分泌，維持血糖的穩(wěn)定。胰島素受體底物2(insulin receptor substrate 2， IRS-2)是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的上游分子，主要通過(guò)與其特異性受體結(jié)合來(lái)發(fā)揮生理作用促進(jìn)合成肝糖原，并阻礙葡萄糖輸出[3]，下調(diào)IRS-2的表達(dá)可能影響其下游PI3K信號(hào)的傳遞而引起IR[4]。瘦素(leptin)是由OB基因編碼的一種分泌蛋白，主要通過(guò)JAK-STAT途徑[5]與其受體緊密結(jié)合而發(fā)揮生理作用。瘦素與IR密切相關(guān)，且瘦素抵抗會(huì)明顯抑制胰島素受體的表達(dá)，從而加重機(jī)體IR程度。瘦素的主要作用是參與機(jī)體能量代謝，通過(guò)調(diào)節(jié)飲食的攝入、增加機(jī)體能量消耗、抑制脂肪合成等多種途徑來(lái)調(diào)節(jié)全身脂肪的分布情況。游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)是脂肪組織分解后的產(chǎn)物，可影響胰島素的分泌，干擾胰島素信號(hào)的傳導(dǎo)，與IR關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)睡眠呼吸疾病的病理生理學(xué)特征為慢性間歇性缺氧[6]，本研究通過(guò)建立慢性間歇性缺氧的動(dòng)物模型來(lái)研究大鼠血糖、胰島素、脂肪因子以及肝臟中GLUT2、IRS-2、瘦素的表達(dá)，以探討睡眠呼吸性疾病引起糖代謝紊亂的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 GLUT-2兔抗大鼠抗體購(gòu)自武漢三鷹公司，IRS-2兔抗大鼠抗體購(gòu)自北京博奧森有限公司，瘦素兔抗大鼠抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，二抗山羊抗兔抗體購(gòu)自中國(guó)Abbkine公司，兔抗大鼠β-actin內(nèi)參購(gòu)中國(guó)自武漢三鷹公司，F(xiàn)FA及瘦素ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D試劑公司，血糖過(guò)氧化物酶法試劑盒購(gòu)自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，胰島素放射免疫檢測(cè)法試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所。GLUT-2引物：上游5'-AGCACATACGACACCAGACG-3'，下游5'-AAAGAACGAGGCGACCATT-3'；IRS-2引物：上游5'-TGACTTTGGTGAAGGGGGTA-3'，下游5'-CCAGGGATGAAGCAGGACTA-3'；瘦素引物：上游5'-TCACACACGCAGTCGGTATC-3'，下游5'-GCAAGCTGGTGAGGATCTGT-3'；內(nèi)參β-actin引物購(gòu)自生工生物工程股份有限公司。RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自TaKaRa寶生物工程有限公司。

1.2 慢性間歇性缺氧動(dòng)物模型的構(gòu)建[7]24只成年雄性SD大鼠(購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)隨機(jī)分為對(duì)照組(UC組)、慢性間歇性低氧組(CIH組)、復(fù)氧組(RH組)，每組8只。UC組常規(guī)飼養(yǎng)4周。CIH組及RH組在慢性間歇缺氧動(dòng)物模型艙[8]中禁飲禁食，可自由活動(dòng)。每天8:00～16:00放入模型艙內(nèi)，關(guān)閉艙門，根據(jù)電路板程序自動(dòng)控制進(jìn)入艙內(nèi)的空氣和氮?dú)獾牧?，?0s作為1個(gè)循環(huán)周期，前30s向艙內(nèi)通入氮?dú)?，?0s向艙內(nèi)通入空氣，使得每個(gè)循環(huán)周期中最低氧濃度維持在6%～10%，并持續(xù)3～5s，然后逐漸恢復(fù)到21%，由控氧儀監(jiān)控艙內(nèi)氧濃度的變化。監(jiān)測(cè)艙內(nèi)大鼠最低血氧飽和度為60%～80%[9]，持續(xù)缺氧4周，RH組在缺氧結(jié)束后常規(guī)飼養(yǎng)3周。血?dú)夥治鍪綰C組大鼠血氧飽和度≥95.0%，CIH組血氧飽和度≤85.0%，RH組血氧飽和度為85.1%～94.9%。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：2016-128)。

1.3 血清指標(biāo)檢測(cè) 大鼠空腹12h后斷尾取血，在4℃下以7500r/min離心15min后取上清液，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)各組大鼠空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、FFA及瘦素水平，并計(jì)算IR指數(shù)(IRI)。IRI=FBG×FINS/22.5。

1.4 Western blotting檢測(cè)大鼠肝臟中GLUT-2、 IRS-2、瘦素蛋白的表達(dá) 提取肝臟組織總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，濕化轉(zhuǎn)膜1h，用TBST配制的5%脫脂奶粉常溫封閉2h，4℃孵育GLUT-2、IRS-2、瘦素一抗過(guò)夜，TBST洗膜后，37℃孵育二抗(1:5000)1h，TBST洗膜后暗室顯影。使用Fusion軟件分析各組蛋白光密度值(OD)，分別計(jì)算出GLUT-2、IRS-2、瘦素與內(nèi)參OD的比值，作為各組蛋白GLUT-2、IRS-2、瘦素的相對(duì)含量。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)肝臟中GLUT-2、IRS-2、瘦素mRNA的表達(dá) 提取肝組織總RNA，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)說(shuō)明書(shū)配制10μl體系的上樣量，運(yùn)行CFX96，采用Bio-Rad CFX96軟件分析，以β-actin作為內(nèi)參照，分析各組中目的基因GLUT-2、IRS-2、瘦素的表達(dá)量，結(jié)果以2–ΔΔCt表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠血清指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 CIH組大鼠血清FBG、FINS、FFA、瘦素濃度及IRI均明顯高于UC組，而RH組則明顯低于CIH組，但仍明顯高于UC組(P<0.05，表1)。

2.2 大鼠肝臟GLUT-2、IRS-2、瘦素蛋白的表達(dá)情況 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，CIH組大鼠肝臟中GLUT-2、IRS-2蛋白表達(dá)明顯低于UC組，而RH組明顯高于CIH組，但仍明顯低于UC組(P<0.05)。CIH組瘦素蛋白表達(dá)明顯高于UC組，而RH組明顯低于CIH組，但仍明顯高于UC組(P<0.05，圖1)。

2.3 大鼠肝臟中GLUT-2、IRS-2、瘦素mRNA的表達(dá)水平 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，CIH組大鼠肝臟中GLUT2、IRS-2 mRNA表達(dá)明顯低于UC組(P<0.05)，而RH組明顯高于CIH組，但仍明顯低于UC組(P<0.05)；CIH組瘦素mRNA表達(dá)明顯高于UC組(P<0.05)，而RH組明顯低于CIH組，但仍明顯高于UC組(P<0.05，表2)。

表1 各組大鼠血清FBG、FINS、FFA、瘦素濃度及IRI比較(±s，n=8)Tab.1 Concentrations of FBG, FINS, FFA, leptin and IRI in each group (±s, n=8)

表1 各組大鼠血清FBG、FINS、FFA、瘦素濃度及IRI比較(±s，n=8)Tab.1 Concentrations of FBG, FINS, FFA, leptin and IRI in each group (±s, n=8)

(1)P<0.05 compared with UC group; (2)P<0.05 compared with CIH group; FBG.Fasting blood glucose; FINS.Fasting insulin; IRI.Insulin resistance index

Group FBG (mmol/L) FINS (μU/ml) FFA (mmol/L) Leptin (ng/ml) IRI UC 5.23±0.39 9.59±0.84 0.95±0.99 6.73±1.24 2.24±0.34 CIH 7.20±0.33(1) 17.89±1.27(1) 1.42±1.44(1) 12.54±1.57(1) 5.72±0.39(1)RH 6.06±0.52(1)(2) 11.25±1.34(1)(2) 1.18±0.11(1)(2) 8.88±0.76(1)(2) 3.03±0.47(1)(2)

圖1 各組大鼠肝臟GLUT-2、IRS-2、瘦素的表達(dá)(Western blotting)Fig.1 Expressions of GLUT-2, IRS-2 and leptin in rats' liver in each group (Western blotting)

表2 各組大鼠肝臟組織GLUT2、IRS-2、瘦素的mRNA表達(dá)(/β-actin，±s，n=8)Tab.2 mRNA expression of GLUT2, IRS-2 and leptin in rats' liver in each group (/β-actin, ±s, n=8)

表2 各組大鼠肝臟組織GLUT2、IRS-2、瘦素的mRNA表達(dá)(/β-actin，±s，n=8)Tab.2 mRNA expression of GLUT2, IRS-2 and leptin in rats' liver in each group (/β-actin, ±s, n=8)

(1)P<0.05 compared with UC group; (2)P<0.05 compared with CIH group

Group GLUT-2 IRS-2 Leptin UC 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 CIH 0.130±0.023(1) 0.230±0.074(1) 1.540±0.075(1)RH 0.420±0.069(1)(2)0.480±0.105(1)(2)1.150±0.053(1)(2)

3 討 論

近年研究證實(shí)，睡眠呼吸疾病重要的病理生理特點(diǎn)是慢性間歇性缺氧，而慢性間歇性缺氧與糖代謝紊亂有著密切的關(guān)系，睡眠呼吸疾病導(dǎo)致糖代謝紊亂的具體機(jī)制目前仍不清楚。本研究結(jié)果顯示，CIH組、RH組大鼠血清FBG、FINS、FFA及瘦素濃度明顯高于UC組(P<0.05)，且RH組明顯高于CIH組(P<0.05)。Western blotting及qRT-PCR法檢測(cè)顯示，CIH組大鼠肝臟GLUT-2、IRS-2蛋白及mRNA表達(dá)明顯低于UC組(P<0.05)，而RH組則明顯高于UC組(P<0.05)；CIH組大鼠肝臟組織中瘦素蛋白及mRNA表達(dá)明顯高于UC組(P<0.05)，而RH組則明顯低于UC組(P<0.05)。本研究中慢性間歇性缺氧導(dǎo)致大鼠FBG、FINS升高出現(xiàn)IR，這種IR可能與血清FFA及瘦素濃度升高有一定關(guān)系。間歇性缺氧使得瘦素不能抑制胰島素的分泌，分泌的胰島素將促使脂肪細(xì)胞產(chǎn)生更多的瘦素[10-11]，而FFA通過(guò)抑制肝臟中經(jīng)胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取，引起機(jī)體葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化以及糖原合成障礙，使胰島素的生物效應(yīng)下降，機(jī)體產(chǎn)生或加重IR。在反復(fù)的缺氧及復(fù)氧過(guò)程中，氧化應(yīng)激可阻礙葡萄糖在肝臟中的攝取，胰腺β細(xì)胞的胰島素分泌減少，從而導(dǎo)致IR，出現(xiàn)糖代謝紊亂[12]。關(guān)于瘦素的研究多數(shù)是在血液中進(jìn)行檢測(cè)，而對(duì)組織層面表達(dá)的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)瘦素在正常肝臟組織中的表達(dá)較少，經(jīng)慢性間歇性缺氧后，瘦素的表達(dá)呈升高趨勢(shì)，而復(fù)氧后降低。我們推測(cè)可能是在慢性間歇性缺氧條件下瘦素刺激了JAK-STAT信號(hào)通路，使IR增強(qiáng)，而復(fù)氧有效地降低了瘦素水平，抑制了JAK-STAT信號(hào)通路，從而使瘦素正常發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，減輕了IR。

GLUT-2占肝臟葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的97%以上，主要通過(guò)胰島素及其受體信號(hào)分子來(lái)調(diào)節(jié)葡萄糖在肝臟中的分布及產(chǎn)生作用[13-14]，調(diào)節(jié)機(jī)體血糖。本研究結(jié)果顯示慢性間歇性低氧可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)IR，CIH組大鼠GLUT-2表達(dá)降低，其可能原因是缺氧狀態(tài)下肝細(xì)胞膜表面沉淀的免疫球蛋白及相關(guān)的免疫復(fù)合物覆蓋或屏蔽GLUT-2和胰島素受體[11]，影響GLUT-2的轉(zhuǎn)位、入塢、融和，使GLUT-2數(shù)量和活力下降，從而導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和利用障礙。經(jīng)復(fù)氧處理后其表達(dá)較前有所升高，提示復(fù)氧能夠上調(diào)大鼠肝臟GLUT-2蛋白及mRNA的表達(dá)，從而增強(qiáng)葡萄糖從血液到肝細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸，降低血糖濃度。GLUT2在腎臟中的表達(dá)趨勢(shì)[15]與肝臟中不一致，機(jī)體出現(xiàn)IR時(shí)GLUT2在腎臟的表達(dá)呈升高趨勢(shì)，可能是由于機(jī)體的血糖濃度發(fā)生變化，腎小管的重吸收功能增強(qiáng)，導(dǎo)致腎臟葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)增加，還有可能是因?yàn)樵谀I臟高濾過(guò)及高功能狀態(tài)下，NO等血管活性物質(zhì)增多，損傷腎細(xì)胞，形成一個(gè)惡性循環(huán)，導(dǎo)致IR進(jìn)一步加重。

葡萄糖主要是通過(guò)GLUT-2實(shí)現(xiàn)其在肝臟中的轉(zhuǎn)運(yùn)，而胰島素的信號(hào)傳遞主要是通過(guò)IRS-2調(diào)控肝臟糖原的合成及葡萄糖的利用[16]。在胰島素信號(hào)傳導(dǎo)中，IRS2可激活下游一系列酶，將細(xì)胞外信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，IRS2缺陷所誘發(fā)的IR主要發(fā)生在肝臟中，促進(jìn)肝葡萄糖輸出，抑制肝臟糖原合成[17]。本研究結(jié)果顯示，CIH組大鼠肝臟中IRS-2蛋白及mRNA表達(dá)低于UC組，其下調(diào)可能抑制了PKB/Akt途徑，導(dǎo)致胰島素信號(hào)傳導(dǎo)減弱，降低了胰島素的生物效應(yīng)，促進(jìn)肝臟糖原分解。經(jīng)復(fù)氧后，IRS-2蛋白及mRNA表達(dá)較前有所升高，提示復(fù)氧可增強(qiáng)胰島素信號(hào)的傳遞，降低了血糖，從而使IR降低。

總之，慢性間歇性缺氧可增加大鼠血糖、血清胰島素水平而引發(fā)IR，且大鼠的IR與大鼠血清脂肪因子升高或肝臟GLUT-2、IRS-2的表達(dá)降低，瘦素的表達(dá)升高有關(guān)，在去除缺氧因素后，大鼠肝臟GLUT-2、IRS-2、瘦素的表達(dá)有所改善。慢性間歇性缺氧對(duì)大鼠肝臟中GLUT-2、IRS-2、瘦素表達(dá)的影響及其相互之間的聯(lián)系，仍須進(jìn)一步深入研究。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Wang GX, He JY, Zhang J, et al.Relationship between obstructive sleep apnea hypopnea syndrome and inflammation in children[J].Med J Chin PLA, 2017, 42(11): 956-961.[王桂香, 何靖雅, 張杰, 等.兒童阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征與炎癥的關(guān)系[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2017, 42(11): 956-961.]

[2] Drager LF, Li J, Shin MK, et al.Intermittent hypoxia inhibits clearance of triglyceride-rich lipoproteins and inactivates adipose lipoprotein lipase in a mouse model of sleep apnoea[J].Eur Heart J, 2012, 33(6): 783-790.

[3] Liu B, Li SL, Liu K, et al.Effect of Huangqi-Wumei granule on insulin resistance in GK rats[J].Med J Chin PLA, 2016, 41(12): 987-991.[劉斌, 李淑玲, 劉凱, 等.黃芪烏梅配方顆粒對(duì)GK大鼠胰島素抵抗的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 41(12): 987-991.]

[4] Zhang KX, Mao HY, Meng X, et al.Protective effect of Cx43 protein expression in the PI3K/Akt regulates the mitochondrial after H2S in isolated rat myocardium[J].Chin Pharmacol Bull, 2013, 29(2): 248-253.[張可璇, 毛洪雅, 孟雪, 等.PI3K/Akt調(diào)節(jié)線粒體Cx43蛋白表達(dá)在H2S后處理離體大鼠心肌中的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2013, 29(2): 248-253.]

[5] Zabeau L, Jensen CJ, Seeuws S, et al.Leptin's metabolic and immune functions can be uncoupled at the ligand/receptor interaction level[J].Cell Mol Life Sci, 2015, 72(3): 629-644.

[6] Vieira LR, Martinez D, Forgiarini LF, et al.Uncoupling protein-2 mRNA expression in mice subjected to intermittent hypoxia[J].J Bras Pneumol, 2015, 41(2): 167-174.

[7] Li B, Zhang F, Tiao Z, et al.Device components for long-term intermittent anoxia test: 201620110012.4[P].2016.02.03.[李兵, 張峰, 田卓, 等.用于長(zhǎng)期間歇性缺氧試驗(yàn)的裝置組件: 201620110012.4[P].2016.02.03.]

[8] Tan J, Mo HL, Li J, et al.Effects of chronic intermittent hypoxia on glucose transporter 4 expression in rat skeletal muscles[J].J South Med Univ, 2014, 34(7): 1061-1064.[譚健, 莫海蘭, 李潔, 等.慢性間歇性缺氧對(duì)大鼠骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4表達(dá)的影響[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 34(7): 1061-1064.]

[9] Torres M, Montserrat JM, Pavia J, et al.Chronic intermittent hypoxia preserves bone density in a mouse model of sleep apnea[J].Respir Physiol Neurobiol, 2013, 189(3): 646-648.

[10] Wawrosch C, Schwaiger S, Stuppner H, et al.Lignan formation in hairy root cultures of Edelweiss (Leontopodium nivale ssp.Alpinum (Cass) Greuter)[J].Fitoterapia, 2014, 97: 219-223.

[11] Fu XF, Wang RL, Wang J, et al.Effects of sericin pretreatment on the expression of NPY and leptin in anterior pituitary of type 2 diabetes rats[J].Chin J Neuroanat, 2014, 30(5): 575-580.[付秀美, 王榮良, 王晶, 等.絲膠預(yù)處理對(duì)2型糖尿病大鼠腺垂體內(nèi)NPY及l(fā)eptin表達(dá)的影響[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志, 2014, 30(5): 575-580.]

[12] Wang H, Ren SA.Progress in the study of the relationship between chronic intermittent hypoxia and glucose metabolism[J].Chin J Lung Dis (Electron Ed), 2015, 8(6): 777-779.[王洪, 任壽安.慢性間歇性低氧與糖代謝關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中華肺部疾病雜志, 2015, 8(6): 777-779.]

[13] Ferrannini E, Muscelli E, Frascerra S, et al.Metabolic response to sodium-glucose cotransporter 2 inhibition in type 2 diabetic patients[J].J Clin Invest, 2014, 124(2): 499-508.

[14] Zhang YZ, Wang YH, Chen XG, et al.Effects of swimming and resveratrol administration on hepatic glycogen and GLUT2 in the liver of type 2 diabetic rat[J].Chin J Sports Med, 2014, 33(2): 135-140.[張?jiān)Ｖ? 王銀暉, 陳曉光, 等.游泳運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠肝糖原及肝臟GLUT2的影響[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 33(2): 135-140.]

[15] Christ-Roberts CY, Pratipanawatr T, Pratipanawatr W, et al.Exercise training increases glycogen synthase activity and GLUT4 expression but not insulin signaling in overweight ondiabetic and type 2 diabetic subjects[J].Metabolism, 2004, 53(9): 1233-1242.

[16] Zhang YQ, Li ML, Chen HY.Effects of long-term high-protein diet on expressions of IRS2 and GLUT2 in the liver of dietinduced obese rats[J].J Shandong Univ (Health Sci), 2011, 49(6): 1-4.[展玉泉, 李明龍, 陳海燕.長(zhǎng)期高蛋白飲食對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠肝臟IRS2和GLUT2表達(dá)的影響[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2011, 49(6): 1-4.]

[17] Niessen M.On the role of IRS2 in the regulation of functional beta-cell mass[J].Arch Hysiol Biochem, 2006, 112(2): 65-73.