lnc-MGC對高糖誘導(dǎo)的人腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化的影響

李歡，何麗潔，婁未娟，王漢民

腹膜透析(PD)是治療終末期腎臟病(ESRD)的一種重要方法，而長期PD可使腹膜超濾功能下降甚至喪失，最終無法進行PD。因此，解決腹膜超濾功能下降或失敗的機制是目前的研究熱點[1]。研究發(fā)現(xiàn)干預(yù)間皮細胞轉(zhuǎn)分化可延緩腹膜纖維化[2]，而本實驗組前期研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-199a/214可以介導(dǎo)高糖引起的腹膜損傷和纖維化[3]，血清反應(yīng)因子(SRF)可通過snail信號通路促進高糖誘導(dǎo)的腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化[4]，SRF/miR-143-3p信號通路參與高糖刺激引起人腹膜間皮細胞(HPMCs)的轉(zhuǎn)分化[5]， lncRNA-MALAT1參與高糖誘導(dǎo)腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)化[6]等，均提示高糖刺激可誘導(dǎo)腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化，并且是目前常用的成熟模型。長鏈非編碼RNA(lncRNA)指的是長度超過200nt的RNA分子，它可參與多種生物學(xué)過程的調(diào)控，如基因沉默、染色體修飾以及轉(zhuǎn)錄的干擾等[7]。對于lncRNA的作用機制，目前有“microRNA海綿功能”假說，即lncRNA像海綿一樣特異性吸附miRNA，競爭性抑制miRNA與自身靶基因的結(jié)合[8]；此外，還有“長鏈非編碼RNA 作為miRNA 產(chǎn)生的前體”的假說[8]。

Kato等[9]在2016年報道lnc-MGC參與了誘發(fā)糖尿病腎病的早期病變，并參與調(diào)節(jié)腎臟纖維化的發(fā)生，他們發(fā)現(xiàn)Chop基因敲除小鼠可通過lnc-MGC對下游miRNA簇進行負向調(diào)控。但目前尚無關(guān)于lnc-MGC參與高糖誘導(dǎo)的腹膜纖維化的報道。本研究通過觀察lnc-MGC在高糖誘導(dǎo)的HPMCs轉(zhuǎn)分化中的作用，為尋找干預(yù)或逆轉(zhuǎn)腹膜纖維化可能的治療靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 HPMCs購自廣州弗爾博生物科技有限公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自美國Hyclone公司，胰蛋白酶(Trypsin)購于澳大利亞Gibco公司，D型-葡萄糖購自美國Sigma公司，總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Real-time PCR試劑盒、iso裂解液(DNAiso Reagent)均購自日本TaKaRa公司。調(diào)控lnc-MGC的慢病毒由上海漢恒生物科技有限公司設(shè)計并合成，引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成。β-actin抗體購自中國Proteintech公司，E-鈣黏素(E-Cadherin)抗體、抗α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體、抗結(jié)締組織生長因子(CTGF)抗體、抗Ⅰ型膠原蛋白(COL-1)抗體、抗Ⅲ型膠原蛋白(COL-3)抗體均購自英國Abcam公司，SDS-PAGE試劑盒及RIPA裂解液(強)購自碧云天生物技術(shù)有限公司，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔/小鼠抗體購自北京中杉金橋有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HPMCs培養(yǎng)及傳代 將HPMCs接種在25cm2的無菌培養(yǎng)瓶中，采用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2孵箱中，間隔24h更換培養(yǎng)液，待細胞鋪滿瓶底80%左右時進行傳代。棄去培養(yǎng)液，采用未加FBS的DMEM 1～2ml沖洗瓶底培養(yǎng)基，棄去后每瓶加入胰蛋白酶1.0～1.5ml進行消化，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)由貼壁的不規(guī)則多邊形變?yōu)橐?guī)則的圓形并有大量細胞懸浮時加入含10% FBS的DMEM中和胰蛋白酶，終止消化過程；用無菌吸管輕輕吹打瓶底少量貼壁細胞，并收集入15ml離心管中，800r/min離心5min，加入培養(yǎng)基將細胞重懸，分別鋪入2個25cm2培養(yǎng)瓶或6孔板中，置于孵箱培養(yǎng)。

1.2.2 實驗分組 將HPMCs分為對照組和高糖組，對照組采用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)，高糖組在對照組基礎(chǔ)上待細胞完全貼壁后采用60mmol/L高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)72h[10]。

1.2.3 總RNA提取 采用iso裂解液手工提取RNA(此方法比試劑盒提取的RNA濃度高)，具體步驟為：取長滿3.5cm2培養(yǎng)皿的細胞，PBS洗3次，加1ml的iso裂解液，靜置冰上裂解3～5min后移入1.5ml EP管，加1/5體積氯仿混勻，4℃下12 000r/min離心30min，取上清(注意勿吸入蛋白)，加等體積異丙醇混勻，4℃下12 000r/min離心15min，棄上清，加1ml無水乙醇，4℃下12 000r/min離心10min，棄上清后室溫干燥，加適量無酶水稀釋，測定總RNA的濃度及純度。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄及Real-time PCR 按照說明配制20μl反應(yīng)體系進行反轉(zhuǎn)錄：37℃ 15min，85℃ 3s，4℃ 60min，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于4℃冰箱保存。按照說明配制20μl PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95℃ 30s；95℃ 5s，65℃ 30s，共40個循環(huán)。

1.2.5 總蛋白提取 取10cm2培養(yǎng)皿中培養(yǎng)好的待檢細胞，用4℃預(yù)冷的1×PBS沖洗3次，根據(jù)細胞量，加入適量含蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液，靜置于冰上裂解30min，期間可利用超聲再次充分裂解細胞；將裂解液于4℃、12 000r/min離心10min，取上清放入1.5ml EP管中，并加入1/4體積的5×蛋白上樣緩沖液，混勻置于100℃加熱器中10min將蛋白變性，然后12 000r/min離心10min， –20℃保存。

1.2.6 Western blotting檢測 將蛋白樣品加入SDS凝膠中，加1×電泳液，恒壓(濃縮膠80V，分離膠120V)電泳，結(jié)束后轉(zhuǎn)膜。1×TBST配制10%牛奶封閉1h。1×TBST配制5%牛奶稀釋一抗，加E-Cadherin抗體(1:1000)、抗α-SMA抗體(1:1000)、抗CTGF抗體(1:500)、抗COL-1抗體(1:1000)、抗COL-3抗體(1:1000)、β-actin抗體(1:2000)，4℃搖床孵育過夜。次日，取出條帶，1×TBST洗5min×3次。分別加入相應(yīng)二抗(1:2000)，室溫孵育1h。1×TBST洗5min×3次。1:1配制顯影液顯影，Image Lab軟件測量條帶的灰度值。

1.2.7 lnc-MGC慢病毒轉(zhuǎn)染 分別使用上調(diào)慢病毒和下調(diào)慢病毒對HPMCs進行轉(zhuǎn)染。取對數(shù)生長期HPMCs，調(diào)整細胞濃度至5×104個/ml，每孔加1ml細胞懸液。24h后按感染復(fù)數(shù)(MOI)=30將慢病毒與培養(yǎng)基混勻，加入待轉(zhuǎn)染細胞中，48h后更換常規(guī)液培養(yǎng)。熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染率約90%后將轉(zhuǎn)染細胞接種于培養(yǎng)瓶中擴增。

1.3 miRBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測 采用miRBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測lncRNA下游相關(guān)miRNA靶分子，預(yù)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)Lnc-MGC相關(guān)的miRNA中miRNA126-3p表達較顯著。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 高糖刺激后lnc-MGC及纖維化相關(guān)分子mRNA和蛋白的表達變化 Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，高糖刺激后lnc-MGC的表達明顯增加(P=0.0074)；E-Cadherin mRNA表達明顯降低(P<0.05)，而α-SMA、CTGF、COL-1、COL-3 mRNA表達明顯升高(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1A)。Western blotting檢測結(jié)果顯示，高糖刺激后，纖維化相關(guān)分子E-Cadherin蛋白表達明顯降低，而α-SMA、CTGF、COL-1、COL-3蛋白表達明顯增加，蛋白表達變化趨勢與mRNA相同，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1B)。

圖1 高糖刺激后lnc-MGC及纖維化相關(guān)分子mRNA(A)和蛋白(B)表達的變化Fig.1 mRNA (A) and protein (B) expressions of lnc-MGC and fibrosis related molecules after high glucose (HG) stimulation

2.2 lnc-MGC慢病毒轉(zhuǎn)染的影響

2.2.1 下調(diào)lnc-MGC對纖維化相關(guān)分子mRNA和蛋白表達的影響 Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染下調(diào)慢病毒后，與對照組相比，lnc-MGC及α-SMA、CTGF、COL-1、COL-3 mRNA表達明顯降低(P<0.05)，E-Cadherin mRNA表達明顯升高(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2A)。Western blotting檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染下調(diào)慢病毒后，α-SMA、CTGF、COL-1、COL-3蛋白表達明顯降低，E-Cadherin蛋白表達明顯升高，蛋白表達變化趨勢與mRNA相同，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2B)。

2.2.2 上調(diào)lnc-MGC對纖維化相關(guān)分子mRNA和蛋白表達的影響 對HPMCs分別轉(zhuǎn)染對照慢病毒及過表達慢病毒，Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染過表達病毒后，lnc-MGC、α-SMA、CTGF、COL-1、COL-3 mRNA表達明顯升高(P<0.05)，E-Cadherin mRNA表達明顯降低(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3A)。Western blotting檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染過表達病毒后，α-SMA、CTGF、COL-1、COL-3蛋白表達明顯升高，E-Cadherin蛋白表達明顯降低，蛋白表達變化趨勢與mRNA相同，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3B)。

圖2 下調(diào)lnc-MGC對纖維化相關(guān)分子mRNA(A)和蛋白(B)表達的影響Fig.2 mRNA (A) and protein (B) expressions of fibrosis related molecules after down-regulating lnc-MGC

圖3 上調(diào)lnc-MGC對纖維化相關(guān)分子mRNA(A)和蛋白(B)表達的影響Fig.3 mRNA (A) and protein (B) expressions of fibrosis related molecules after up-regulating lnc-MGC

2.3 lnc-MGC下游靶點預(yù)測 采用數(shù)據(jù)庫miRBase預(yù)測得到lnc-MGC下游多個miRNA，其中在慢病毒轉(zhuǎn)染后，miRNA126-3p有顯著改變，因此考慮lnc-MGC可能對其具有調(diào)控作用。故采用Realtime PCR檢測正常組、高糖刺激72h、慢病毒轉(zhuǎn)染后的miRNA126-3p表達水平，結(jié)果顯示，高糖組miRNA126-3p表達明顯高于正常組(P<0.05)。與正常組相比，轉(zhuǎn)染慢病毒下調(diào)lnc-MGC后，miRNA126-3p表達明顯降低(P<0.05)，而上調(diào)lnc-MGC后，miRNA126-3p表達則明顯升高(P<0.05，圖4)。

3 討 論

在ESRD患者腎臟替代治療中PD所占比例大于10%[11]。腹膜長期暴露于高糖腹透液中，可發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的改變，并逐漸出現(xiàn)腹膜纖維化，進而導(dǎo)致PD功能喪失。因此，探討腹膜纖維化發(fā)生發(fā)展的機制對行PD的患者來說具有非常重要的意義。目前研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs與糖尿病腎病、腎小球疾病、急性腎移植排斥反應(yīng)、腎細胞癌、急性腎損傷都有聯(lián)系，例如lncRNA-H19可對抗預(yù)防腎纖維化[12]，lncRNA-MALAT1可調(diào)節(jié)SAA3、IL-6和TNF等炎癥因子的表達[13]，lncRNA-H19參與上皮細胞和間皮細胞之間相互轉(zhuǎn)化的異常調(diào)節(jié)[14]， lncRNA-Arid2IR參與了腎臟炎癥和纖維化的過程[15]，LINC01619在糖尿病腎病中可調(diào)節(jié)miR-27a/FOXO1介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和足細胞損傷[16]。lncRNA調(diào)控miRNA參與細胞表型轉(zhuǎn)化的機制在腹透研究中尚未見報道，但目前在肝癌[17]、肝內(nèi)膽管癌[18]、胰腺癌[19]、鼻咽癌[20]等研究中已有報道。本研究組已發(fā)現(xiàn)的參與腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化的分子有l(wèi)ncRNA-H19、lncRNA-MALAT1[6]，而最新研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)lncRNA-ATB的表達可促進HPMCs表型轉(zhuǎn)換及增殖[21]。目前這類分子已引起該領(lǐng)域很多學(xué)者的關(guān)注[22]，并不斷取得新的進展，但有關(guān)該類分子在腹膜透析中的研究較少。

圖4 高糖刺激及慢病毒轉(zhuǎn)染后miRNA126-3p的表達變化Fig.4 Expression of miRNA126-3p after high glucose stimulation and lentivirus transfection

本研究結(jié)果顯示，調(diào)控上游lncRNA可改變纖維化相關(guān)標(biāo)志物的表達，下游miRNA126-3p可以被正向調(diào)控，提示lnc-MGC可通過調(diào)控miRNA126-3p來影響腹膜間皮細胞的轉(zhuǎn)分化。因而本實驗假設(shè)與上述“海綿假說”[8]不同?？杉僭O(shè)認為lncRNA為miRNA的前體[8]，在成熟過程中剪切產(chǎn)生miRNA，miRNA進而調(diào)控下游蛋白發(fā)揮作用，影響HPMCs轉(zhuǎn)分化的過程，影響腹膜纖維化進展。但lnc-MGC通過何種下游靶蛋白來調(diào)控纖維化進展，調(diào)控或阻斷miRNA126-3p后是否會影響下游靶蛋白，其影響與調(diào)控lnc-MGC影響纖維化相關(guān)蛋白變化有什么區(qū)別，以及對腹膜纖維化進展的影響仍需進一步研究。本課題組下一步將使用雙熒光素酶報告基因來進一步驗證二者的關(guān)系。

綜上，本研究結(jié)果表明，lnc-MGC在HPMCs轉(zhuǎn)分化及纖維化中可能發(fā)揮著一定的作用，lnc-MGC可通過調(diào)控miRNA126-3p來影響腹膜間皮細胞的轉(zhuǎn)分化，有可能成為干預(yù)或逆轉(zhuǎn)腹膜纖維化治療的重要靶點之一。

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