沉默RICTOR表達對血管瘤細胞侵襲、遷移能力的影響及作用機制

陳德才　王　雅　馬從乾　楊　軻　陳　輝　陳德霞

(南陽市中心醫(yī)院血管外科，河南　南陽　473000)

1南陽市中心醫(yī)院腎內(nèi)科2南陽市方城縣人民醫(yī)院血液凈化科

血管瘤主要由先天性遺傳疾病或血管畸形造成，嬰幼兒時期多為良性腫瘤，成人時期多為惡性肉瘤，發(fā)病率為5%～10%〔1〕。研究表明，血管瘤內(nèi)皮細胞的過度增殖和血管病理性形成是其主要的生物學(xué)特性〔2〕。血管瘤的發(fā)病機制尚不明確。目前認為血管瘤內(nèi)皮細胞比正常內(nèi)皮細胞侵襲、遷移能力更強〔3〕。研究表明雷帕霉素靶蛋白(mTOR)與細胞的生長、分化、侵襲、凋亡等過程密切相關(guān)〔4〕。 mTOR由mTOR復(fù)合物1和mTOR復(fù)合物2組成，mTOR雷帕霉素不敏感組分(RICTOR)是mTOR復(fù)合物2的支架蛋白〔5〕。研究表明mTOR復(fù)合物1和mTOR復(fù)合物2在腫瘤組織中高表達，推測RICTOR可能與血管瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)〔6〕。本實驗通過RNA干擾技術(shù)沉默RICTOR基因表達研究其對血管內(nèi)皮瘤細胞EOMA侵襲、遷移能力的影響及作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗材料EOMA小鼠血管內(nèi)皮瘤細胞購自蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司，高糖DMEM、胎牛血清(FBS)、絲蘇氨酸蛋白激酶(AKT)抗體、磷酸化AKT(p-AKT)抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9抗體購自中國Solarbio公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司，Transwell小室購自美國Corning公司，Annexin V FITC PI 細胞凋亡試劑盒購自上海拜力生物科技有限公司。

1.2細胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將EOMA凍存管置于37℃水浴鍋中，迅速融化，離心，收集細胞，加入含10%FBS和青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃、95%濕度的孵箱中培養(yǎng)。待細胞的貼壁面積至70%～80%匯合時，使用2 ml 0.25%胰酶消化細胞，加入不完全DMEM培養(yǎng)基終止消化，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞3次，加入新鮮培養(yǎng)基，以1∶3的比例傳代。

取生長狀態(tài)良好的細胞，胰酶消化，以1×106個/孔細胞接種于6孔板，加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃孵箱中培養(yǎng)24 h，待細胞融合度為70%～80%時，根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒的轉(zhuǎn)染步驟進行，實驗分為對照組，陰性組(轉(zhuǎn)染siRNA-NC)，轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染siRNA-RICTOR，轉(zhuǎn)染后在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，然后將培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，Western印跡檢測轉(zhuǎn)染效果)。

1.3Transwell法檢測細胞的侵襲、遷移能力實驗前，使用不含血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠(1 mg/ml)，取100 μl基質(zhì)膠加入到Transwell小室上室中，37℃孵育5 h，取1×105個細胞提前饑餓處理，加入Transwell小室上室中，下室中加入600 μl 含15% FBS的培養(yǎng)基，置于24孔板中，放入5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，棉簽輕輕拭去上室中未侵襲的細胞，結(jié)晶紫染色細胞，在倒置顯微鏡下觀察，并隨機選取5個視野進行計數(shù)，每組5個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。遷移實驗為細胞接種于未鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室上室中，其余步驟與侵襲實驗相同。

1.4Western印跡檢測細胞中AKT、p-AKT、MMP-9蛋白表達水平取轉(zhuǎn)染24 h的細胞，棄去培養(yǎng)基上清，PBS清洗2次，加入細胞裂解液，冰上裂解10 min，4℃，12 000 r/min離心15 min，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，檢測總蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，100℃變性3 min。將10%分離膠和4%濃縮膠置于干凈的電泳槽中，每個上樣孔加入20 μg蛋白，電壓調(diào)至120 V進行電泳，當(dāng)溴酚藍遷移至凝膠底部，停止電泳，切下分離膠，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)清洗，加入Western封閉液，置于搖床中封閉2 h，加入適當(dāng)比例稀釋的一抗，混勻，4℃孵育過夜。TBST清洗3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10～15 min。加入化學(xué)發(fā)光試劑，避光孵育5 min，顯影30 s，定影10 s，沖洗晾干，使用Image-J軟件分析蛋白質(zhì)的電泳條帶灰度值，與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值為目的蛋白的相對表達量。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析和t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1Western印跡檢測細胞轉(zhuǎn)染效果與對照組(1.156±0.220)相比，陰性組細胞中RICTOR蛋白表達量(1.123±0.262)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，轉(zhuǎn)染組(0.433±0.029)顯著降低(P<0.05)。見圖1。

圖1　轉(zhuǎn)染后細胞中RICTOR蛋白的表達量

2.2Transwell法檢測細胞的侵襲、遷移能力與對照組細胞侵襲、遷移數(shù)〔(60.865±6.539)個、(105.480±10.644)個〕相比，陰性組〔(63.489±5.782)個、(99.569±8.623)個〕差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，轉(zhuǎn)染組〔(12.635±2.456)個、(46.103±6.942)個〕顯著降低(P<0.05)。

2.3Western印跡檢測細胞中AKT、p-AKT、MMP-9蛋白表達水平干預(yù)RICTOR表達對細胞中AKT蛋白的表達沒有顯著影響；與對照組相比，陰性組細胞中p-AKT、MMP-9蛋白表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，轉(zhuǎn)染組顯著下降(P<0.05)。見圖2，表1。

圖2　轉(zhuǎn)染后細胞中AKT、p-AKT、MMP-9蛋白表達量

組別AKTp?AKTMMP?9對照組0789±00540546±00480465±0028陰性組0775±00630559±00630483±0056轉(zhuǎn)染組0750±00580306±00421)0260±00331)

與對照組比較：1)P<0.05

3　討　論

腫瘤預(yù)后和復(fù)發(fā)的主要原因是細胞的侵襲、遷移能力增強。細胞的侵襲、遷移過程復(fù)雜，受多種細胞因子、轉(zhuǎn)移基因、轉(zhuǎn)移抑制基因、細胞外基質(zhì)降解等的影響，主要表現(xiàn)為腫瘤細胞從原發(fā)病灶侵襲進入基底膜向周圍間質(zhì)生長，經(jīng)過毛細血管或淋巴管壁與血小板反應(yīng)生成小瘤栓，隨著全身血液的運輸黏附血管或淋巴管內(nèi)皮細胞，穿越管壁不斷增殖，形成新的腫瘤灶〔7〕。研究認為mTOR信號通路參與細胞周期、生長、細胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)降解和膜蛋白轉(zhuǎn)運等過程〔8〕。RICTOR是一種新發(fā)現(xiàn)的mTOR復(fù)合物2功能蛋白之一，保守性較低，對雷帕霉素的敏感度較低，參與腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移、分化、周期等過程〔9〕。研究顯示miR-424/503可通過影響RICTOR的表達量抑制多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，RICTOR也可促進c-Myc和細胞周蛋白E的表達調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖和細胞周期〔10〕。研究表明，RICTOR與整合素連接激酶結(jié)合抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤細胞轉(zhuǎn)移〔11〕。但RICTOR基因在血管瘤中的研究較少。結(jié)果顯示沉默RICTOR表達可抑制EOMA細胞侵襲、遷移力。

磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT信號通路參與調(diào)控細胞的存活、凋亡、侵襲、遷移等多種生理病理過程，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等發(fā)揮重要作用。PI3K是這一信號通路的主要因子，能活化細胞內(nèi)的磷脂酰肌醇，使其具有第二信使的作用，從而激活下游靶基因的表達〔12〕。AKT是PI3K下游最關(guān)鍵的靶向激酶，PI3K磷酸化產(chǎn)物可使AKT轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘膒-AKT，活化的AKT通過胞質(zhì)內(nèi)因子傳遞生物信息學(xué)信號，激活或抑制下游靶基因的表達，進而對細胞周期、增殖、侵襲等過程發(fā)揮調(diào)控作用〔13〕。 MMP-9是金屬離子Zn依賴的蛋白水解酶超家族的重要成員之一，對細胞外基質(zhì)具有降解作用。在細胞侵襲過程中，細胞外基質(zhì)基底膜的降解是關(guān)鍵。研究表明PI3K/AKT信號通路可激活MMP-9的表達從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)〔14〕。本研究結(jié)果提示，沉默RICTOR可通過降低PI3K/AKT信號通路，下調(diào)MMP-9表達，從而有效抑制血管內(nèi)皮瘤細胞的侵襲、遷移能力，為血管瘤的分子治療提供一定的理論依據(jù)，但本實驗僅進行了體外實驗，還需進一步研究RICTOR在體內(nèi)試驗的作用效果。

1徐建國,楊超,邢新,等.上調(diào)miR-206對嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞生長狀態(tài)和侵襲能力的影響〔J〕.中國美容整形外科雜志,2016;27(4):238-41.

2Park H,Park H,Chung HY,etal.Comparative analysis of the extracellular matrix composition in proliferating and involuted infantile hemangiomas〔J〕.Arch Plast Surg,2015;42(5):544-51.

3Dai X,Shiraishi K,Tohyama M,etal.IL-33 plays a role in HB-EGF-mediated keratinocyte migration via controlling STAT3 activation〔J〕.J Dermatol Sci,2017;86(2):e21-2.

4Fazolini NP,Cruz AL,Werneck MB,etal.Leptin activation of mTOR pathway in intestinal epithelial cell triggers lipid droplet formation,cytokine production and increased cell proliferation〔J〕.Cell Cycle,2015;14(16):2667-76.

5Kaibori M,Shikata N,Sakaguchi T,etal.Influence of rictor and raptor expression of mTOR signaling on long-term outcomes of patients with hepatocellular carcinoma〔J〕.Dig Dis Sci,2015;60(4):919-28.

6Ji WB,Kim HJ,Yeom SD,etal.Regulation of endothelial cell proliferation of infantile hemangioma through mTORC2 and NDRG1 signaling pathways〔J〕.J Dermatol Sci,2017;86(2):e22.

7林振呂,張琳,鄭建濤.miR-215 對胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及機制〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2015;35(21):6064-7.

8Setoguchi R,Matsui Y,Mouri K.MTOR signaling promotes a robust and continuous production of IFN-γ by human memory CD8+ T cells and their proliferation〔J〕.Euro J Immunol,2015;45(3):893-902.

9van de Velde LA,Subramanian C,Smith AM,etal.T cells encountering myeloid cells programmed for amino acid-dependent immunosuppression use Rictor/mTORC2 protein for proliferative checkpoint decisions〔J〕.J Biol Chem,2017;292(1):15-30.

10Schmidt KM,Hellerbrand C,Ruemmele P,etal.Inhibition of mTORC2 component RICTOR impairs tumor growth in pancreatic cancer models〔J〕.Oncotarget,2017;8(15):24491.

11Feldkoren B,Hutchinson R,Rapaport Y,etal.Integrin signaling potentiates transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) dependent down-regulation of E-Cadherin expression-Important implications for epithelial to mesenchymal transition (EMT) in renal cell carcinoma〔J〕.Exp Cell Res,2017;355(2):57-66.

12Lin Z,Zhou P,von Gise A,etal.Pi3kcb links hippo-YAP and PI3K-AKT signaling pathways to promote cardiomyocyte proliferation and survivalNovelty and significance〔J〕.Circ Res,2015;116(1):35-45.

13Chew CL,Lunardi A,Gulluni F,etal.In vivo role of INPP4B in tumor and metastasis suppression through regulation of PI3K-AKT signaling at endosomes〔J〕.Cancer Discov,2015;5(7):740-51.

14Chen S,Chen W,Zhang X,etal.Overexpression of KiSS-1 reduces colorectal cancer cell invasion by downregulating MMP-9 via blocking PI3K/Akt/NF-κB signal pathway〔J〕.Int J Oncol,2016;48(4):1391-8.