鐵皮石槲對(duì)D-半乳糖致阿爾茨海默病模型小鼠大腦病理的影響

農(nóng)　嵩　凌霄雁　韋愛(ài)伯　鄧曉珍　黃炳臣　潘　霖　張子麗　張樹(shù)球

(右江民族醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，廣西　百色　533000)

1右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院

鐵皮石槲是蘭科石槲屬多年生附生草本植物，主要分布我國(guó)西南和江南各省〔1〕，性氣平、味甘、淡、歸胃腎經(jīng)，具有益胃生津，滋陰清熱的功效。臨床可用于慢性胃炎、高血壓、糖尿病等癥，還具有抗腫瘤、抗衰老等作用。阿爾茨海默病(AD)是老年人常見(jiàn)的疾病，以認(rèn)知能力迅速減退為特征，實(shí)際是快速衰老。本實(shí)驗(yàn)利用D-半乳糖加亞硝酸鈉給小鼠腹腔注射，建立衰老模型〔2〕；用鐵皮石槲提取液灌胃治療，測(cè)定大腦乙酰膽堿酯酶(AchE)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)等指標(biāo)，同時(shí)取大腦行病理檢查，觀察其抗衰老作用。

1　材料與方法

1.1試劑D-半乳糖、亞硝酸鈉、氯化鈉、冰醋酸(分析純，Sigma產(chǎn)品)；AchE、GSH-Px、MDA分別購(gòu)自四川成都邁克科技有限公司、凱基生物公司、南京建成生物工程研究所。

1.2中藥鐵皮石槲(干藥材)由廣西玉林師范學(xué)院惠贈(zèng)。藥物稱量，放提取鍋內(nèi)，加水，加熱提?。禾崛∷幰骸右掖汲恋怼^(guò)濾去沉淀→回收乙醇→藥液定容，分裝密封，高壓105℃滅菌30 min，取出冷卻放冰箱保存。首烏復(fù)方(制首烏，龍眼肉等)提取液和金銀花復(fù)方口服液(金銀花，甘草，茯苓等)，制藥方法與鐵皮石槲相同。

1.3動(dòng)物小白鼠65只，昆明種，3月齡，健康，雌雄各半，購(gòu)自右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物室，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證：SYXK桂2011-0010，動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK桂2012-0003，購(gòu)自右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物室標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，稱體重，分籠喂養(yǎng)，每籠3～5只，編號(hào)，雌雄分開(kāi)，自由飲用自來(lái)水，放獨(dú)立式鼠籠飼養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)(廣東珠海市再鑫儀器有限公司產(chǎn)品)，空氣過(guò)濾凈化，室溫空調(diào)26℃～28℃。

1.4AD模型建立用1.2%D-半乳糖和1.8%亞硝酸鈉水溶二液混合給小鼠腹腔注射〔2〕，1次/d，D半乳糖用生理鹽水溶解為1.2%，劑量按120 mg·kg-1·d-1，1.8%亞硝酸鈉，劑量按180 mg·kg-1·d-1，實(shí)驗(yàn)連續(xù)60 d。

1.5動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將造模動(dòng)物分成：鐵皮石槲組、首烏復(fù)方組、金銀花組、模型組，另設(shè)正常組，各組13只。鐵皮石槲組用鐵皮石槲提取液灌胃，劑量按成人(50 kg體重)劑量(10 ml/次，3次/d)折算，以蒸餾水稀釋成0.4 ml灌胃，從造模后第25天開(kāi)始，1次/d；首烏復(fù)方組用首烏復(fù)方提取液灌胃，劑量方法同前折算；金銀花組用金銀花復(fù)方口服液灌胃，劑量同前折算；正常組用等量生理鹽水灌胃；至結(jié)束前1 w停藥〔3〕。實(shí)驗(yàn)期間正常組1只死亡；模型組3只死亡；鐵皮石槲組2只死亡；首烏復(fù)方組2只死亡；金銀花組3只死亡。

1.6生化指標(biāo)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束，從小鼠眼球后靜脈取血0.8～1.0 ml，離心取血清待用。處死動(dòng)物，取大腦，用生理鹽水洗去血液，并用濾紙吸干水分，稱重，在冰浴下用勻漿器勻漿，用生理鹽水稀釋成10%勻漿，離心(3 500 r/min)10 min，取上清液4℃冰箱保存?zhèn)溆?。測(cè)定腦勻漿AchE活力、MDA含量、GSH-Px活力〔4〕，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.7大腦病理切片檢查采用蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察雌鼠腦組織病理，放大倍數(shù)200或400倍。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1腦勻漿生化指標(biāo)和蛋白質(zhì)水平腦AchE：正常組明顯低于鐵皮石槲組、模型組；GSH-Px：模型組明顯低于其他組；MDA：正常組、首烏復(fù)方組明顯低于其他組(P<0.05,P<0.01)；蛋白質(zhì)含量：各組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2大腦海馬、皮質(zhì)病理檢查結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。正常組：大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)變性、壞死，組織結(jié)構(gòu)及層次未見(jiàn)顯著改變。模型組：大腦皮質(zhì)和皮質(zhì)海馬區(qū)少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞胞體腫脹、胞質(zhì)空亮、Nissl體消失、胞核縮小偏位深染，呈急性神經(jīng)細(xì)胞潰變改變，少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞胞核、胞體收縮，核仁不明顯、核與胞質(zhì)融合固縮，呈慢性進(jìn)行性神經(jīng)細(xì)胞壞死改變。鐵皮石槲組病變程度與模型組基本一致。首烏復(fù)方組病變程度比鐵皮石槲組輕。金銀花病變程度比模型組和鐵皮石槲組輕。

表1　各組腦勻漿生化指標(biāo)和蛋白質(zhì)含量比較

與正常組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.01；與首烏復(fù)方組比較：4)P<0.05

圖1　各組大腦海馬病理切片檢查(HE)

圖2　各組大腦皮質(zhì)病理切片檢查(HE)

3　討　論

AD病理特征主要表現(xiàn)在大腦神經(jīng)系統(tǒng)，如出現(xiàn)老年斑、神經(jīng)纖維變性纏結(jié)、細(xì)胞變性凋亡等，而病變主要分布在大腦海馬和皮質(zhì)部位〔5〕。 海馬神經(jīng)細(xì)胞是膽堿能神經(jīng)中樞分布的部位，醫(yī)學(xué)界大多認(rèn)為膽堿能神經(jīng)與記憶功能有關(guān)，乙酰膽堿是膽堿能神經(jīng)的神經(jīng)遞質(zhì)〔6〕，它以膽堿和乙酰輔酶A為原料，在膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(ChAT)催化下合成，在完成了神經(jīng)傳導(dǎo)功能之后，又在AchE催化下分解成乙酸和膽堿，正常情況下合成與分解保持著平衡，以維持乙酰膽堿的正常功能，一旦平衡被打破，膽堿能神經(jīng)功能就會(huì)發(fā)生障礙，導(dǎo)致認(rèn)知能力的改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AD鼠AchE活力明顯升高，經(jīng)治療有一定降低好轉(zhuǎn)，接近正常，但鐵皮石槲治療未見(jiàn)降低好轉(zhuǎn)，接近AD模型；GSH-Px AD模型明顯低于治療組和正常組，說(shuō)明經(jīng)治療抗氧化能力明顯增強(qiáng)；MDA含量，首烏復(fù)方組和正常組明顯低于其他組，含量最高是模型組，說(shuō)明其不飽和脂肪酸被氧化分解最強(qiáng)，抗衰老抗氧化能力最差，首烏復(fù)方組和正常組抗衰老抗氧化能力最強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變與生化酶學(xué)的變化基本一致，鐵皮石槲未見(jiàn)明顯療效是否因治療時(shí)間過(guò)短或其他原因，有待進(jìn)一步研究。

1黃志海，黃結(jié)麗.HPLC測(cè)定石槲夜光顆粒中小檗堿含量〔J〕.中國(guó)中藥雜志，2005；30(14)：1130.

2何勝，玉瑩，陳菊芳，等.用D-半乳糖加亞硝酸鈉建立癡呆癥小鼠模型和中藥治療的效果〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2014；34(2)：422-4.

3張樹(shù)球，黃秋艷，李朝敢，等.用Y型水迷宮測(cè)定鋅與海爾福口服液對(duì)鉛染毒所致小鼠記憶障礙的改善作用〔J〕.中國(guó)冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2006；23(5)：546-8.

4葉應(yīng)嫵，王毓三.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程〔M〕.第2版.南京：東南大學(xué)出版社，1997：2.

5張寶第，郭雄.鋁致阿爾茨海默病的分子機(jī)制〔J〕.國(guó)外醫(yī)學(xué)地理分冊(cè)，2003；24(1)：57-9.

6官斌，李玉梅，馬駿，等.不同工藝制品的補(bǔ)腎中藥對(duì)癡呆小鼠乙酰膽堿酯酶活性和M-受體功能的影響〔J〕.標(biāo)記免疫分析與臨床，1997；4(3)：152-6.