不同生物素水平對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂肪合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響

雒誠(chéng)龍，邵 偉,，任萬(wàn)平，趙艷坤，王東海，余 雄

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊　830052；2.新疆肉乳用草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊　830052)

0　引 言

【研究意義】生物素是動(dòng)物體內(nèi)一種重要的羧化酶，由于其可通過(guò)機(jī)體內(nèi)源合成，因此生物素缺乏現(xiàn)象極為罕見，這也造成了對(duì)生物素的研究相對(duì)較少。隨著研究的推進(jìn)，近來(lái)發(fā)現(xiàn)生物素有助于機(jī)體促進(jìn)正常糖脂代謝，并改善機(jī)體內(nèi)環(huán)境。但就細(xì)胞層面而言，生物素在糖脂代謝過(guò)程中對(duì)相關(guān)物質(zhì)究竟有何影響仍處在摸索階段。【前人研究進(jìn)展】在脂肪細(xì)胞中，細(xì)胞會(huì)將多余的葡萄糖經(jīng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(glucose transporter 4，GLUT-4)加速轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)[1]，并在己糖激酶(hexokinase，HK)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，PFK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)等酶催化下轉(zhuǎn)化為丙酮酸，再經(jīng)轉(zhuǎn)化生成合成甘油三酯(triacylglyceride，TG)的前體物質(zhì)乙酰CoA[2]。乙酰CoA在經(jīng)過(guò)乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)、脂肪合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)等一些列酶的催化下合成TG[2]，TG再經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞脂滴儲(chǔ)存[3]。生物素是機(jī)體內(nèi)必不可少的輔酶因子[4]，可參與或間接調(diào)控機(jī)體內(nèi)多項(xiàng)脂合成反應(yīng)[5]。已有研究證明，在奶牛日糧中添喂生物素可提高乳脂、乳糖含量[6]，生物素還可通過(guò)調(diào)節(jié)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞脂合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)[7]，生物素亦可通過(guò)改善細(xì)胞狀態(tài)[8]，促細(xì)胞糖利用并向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人對(duì)生物素的研究多集中于動(dòng)物整體水平，而于細(xì)胞層面研究較少。研究在體外培養(yǎng)糖脂代謝活躍的3T3-L1脂肪細(xì)胞，并添加生物素進(jìn)行干預(yù)，探究生物素對(duì)脂肪細(xì)胞中脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)間的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究不同生物素濃度對(duì)脂肪細(xì)胞中脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)的影響，為更好的利用生物素調(diào)控脂肪細(xì)胞發(fā)育提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材 料

1.1.1主要儀器

倒置顯微鏡、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、低速離心機(jī)、實(shí)時(shí)定量PCR儀。

1.1.2主要試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基、油紅O染料、胰島素、地塞米松(DEX)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)，吲哚美辛，胰蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒、引物由上海博谷生物科技公司合成。

1.2　方 法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同劑量的生物素為試驗(yàn)組，使培養(yǎng)基內(nèi)生物素濃度分別達(dá)0 μmol/L、0.2 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L，每組試驗(yàn)3個(gè)平行樣，每個(gè)平行樣3次重復(fù)，分別在12 h、24 h、48 h時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞上清液中甘油釋放量及細(xì)胞內(nèi)GLUT-4、PK、FAS及ACC1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.23T3-L1前脂肪細(xì)胞株的培養(yǎng)與分化[9]

將3T3-L1前脂肪細(xì)胞株用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底壁時(shí)，將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿2 d后，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基及含0.5 mmol/L IBMX、0.25 μmol/L DEX、10 mg/L胰島素的分化液，培養(yǎng)48 h，再以含10 mg/L胰島素的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，然后用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d換液1次，誘導(dǎo)分化8～12 d后，待90%以上的3T3-L1細(xì)胞呈脂肪細(xì)胞表型再進(jìn)行下一步處理。

1.2.3添加不同濃度生物素干預(yù)

將誘導(dǎo)分化好的脂肪細(xì)胞以1×105/mL接種于24孔板，用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞完全貼壁后，換不同濃度生物素培養(yǎng)基孵化。各組培養(yǎng)基中生物素濃度為0(對(duì)照組)、0.2、0.5、1 μmol/L，每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，每孔設(shè)3個(gè)平行。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量方法[10]

參照試劑盒說(shuō)明書提取各組細(xì)胞總RNA，全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)出RNA濃度以及OD260nm/OD280nm，以提取的總RNA為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(10 μL，37℃ 15 min，85℃ 5 s)合成cDNA。RCR按20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行，反應(yīng)條件：95℃ 30 s變性，95℃ 5 s，60℃ 31 s，50個(gè)循環(huán)，上機(jī)自動(dòng)分析熒光信號(hào)，并將其轉(zhuǎn)換Ct值，采用ΔΔCt法分析，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因計(jì)算GLUT-4、PK、FAS、ACC1 mRNA相對(duì)定量值(2-ΔΔCt)?；蛐蛄芯鶑腉enbank中獲取，引物用Primer 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，由上海博谷生物科技有限公司合成。表1

1.2.5熒光定量PCR引物(表1)

1.3　數(shù)據(jù)處理

所有原始數(shù)據(jù)先用Excel 2016進(jìn)行整理，用SPSS 22軟件進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan法進(jìn)行多重比較。以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，P<0.01作為差異極顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的最終結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

表1定量PCR 引物信息
Table1Primer sequences of Real-time fluorescent quantitative PCR

基因名稱Genename引物序列Primersequences(5’-3’)擴(kuò)增長(zhǎng)度Amplificationlength(bp)退火溫度Annealingtemperature(℃)GLUT-4F：CACCGGCAGCCTCTGATCR：TAAGAGCACCGAGACCAACG18059PKF：TGGATGGGGCTGACTGTATCR：CGTAGCTCCTCAAACAACTGG13958ACC1F：CATCGATAACCCTTCAGCAGAGR：GCCTCGGTTTTGTCGTCC15959FASF：GGGCTACAGAGATGGACTTCGR：AGGCAGCCACTCCAACAAG19059GAPDHF：GAGAAACCTGCCAAGTATGATGR：AGAGTGGGAGTTGCTGTTGAAG12959

2　結(jié)果與分析

2.1　生物素濃度對(duì)細(xì)胞GLUT-4 mRNA表達(dá)量的影響

研究表明，在試驗(yàn)12 h時(shí)，各試驗(yàn)組GLUT-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著(P<0.05)高于對(duì)照組；在試驗(yàn)24 h時(shí)，1 μmol/L組GLUT-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著(P<0.05)高于0.2 μmol/L與對(duì)照組；在試驗(yàn)48 h時(shí)，1 μmol/L組GLUT-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著(P<0.05)高于對(duì)照組。圖1

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標(biāo)相同字母或無(wú)字母標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)[10]，下同

Note: data in the same column of the shoulder mark different lowercase letters indicate a significant difference (P< 0.05); shoulder standard different capital letters show very significant difference (P< 0.01); shoulder standard the same letter or letter annotation denotes the difference was not significant (P> 0.05).The same as below

圖1不同生物素濃度下細(xì)胞GLUT-4 mRNA表達(dá)量變化
Fig.1The Impact of Various Biotin Concentrations on GLUT-4 mRNA Expression Quantity of Cells

2.2　生物素濃度對(duì)細(xì)胞PK mRNA表達(dá)量的影響

研究表明，在試驗(yàn)12 h時(shí)，各試驗(yàn)組PK mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高(P<0.05)于對(duì)照組，其中1 μmol/L組PK mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著(P<0.01)高于對(duì)照組、0.2 μmol/L組及0.5 μmol/L組，與之相比分別提升了58.9%、39.1%與29.9%；在試驗(yàn)24 h時(shí)，1 μmol/L組PK mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著(P<0.05)高于對(duì)照組；在試驗(yàn)48 h時(shí)，1 μmol/L 組PK mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著(P<0.01)高于對(duì)照組。圖2

圖2不同生物素濃度下細(xì)胞PK mRNA表達(dá)量變化
Fig.2The Impact of Various Biotin Concentrations on PK mRNA Expression Quantity of Cells

2.3　生物素濃度對(duì)細(xì)胞FAS mRNA表達(dá)量的影響

研究表明，在試驗(yàn)12 h時(shí)，1 μmol/L組與0.5 μmol/L組FAS mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著(P<0.01)高于于對(duì)照組與0.2 μmol/L組；在試驗(yàn)24 h時(shí)，各試驗(yàn)組FAS mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組間差異不顯著；在試驗(yàn)48 h時(shí)，0.5 μmol/L組FAS mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著(P<0.01)高于對(duì)照組，并顯著(P<0.05)高于1 μmol/L組。圖3

圖3不同生物素濃度下細(xì)胞FAS mRNA表達(dá)量變化
Fig.3The Impact of Various Biotin Concentrations on FAS mRNA Expression Quantity of Cells

2.4　生物素濃度對(duì)細(xì)胞ACC1 mRNA表達(dá)量的影響

研究表明，在試驗(yàn)12 h時(shí)，1 μmol/L組、0.5 μmol/L組與0.2 μmol/L組ACC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著(P<0.01)高于對(duì)照組；在試驗(yàn)24 h時(shí)，1 μmol/L組ACC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著(P<0.01)高于對(duì)照組，0.2 μmol/L組與0.5 μmol/L組ACC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著(P<0.05)高于對(duì)照組；在試驗(yàn)48 h時(shí)，1 μmol/L組ACC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組與0.2 μmol/L組，0.5 μmol/L組ACC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著(P<0.05)高于對(duì)照組與0.2 μmol/L組。圖4

圖4不同生物素濃度下細(xì)胞ACC1 mRNA表達(dá)量變化
Fig.4The Impact of Various Biotin Concentrations on ACC1 mRNA Expression Quantity of Cells

3　討 論

葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是脂肪細(xì)胞吸收利用葡萄糖的主要限速步驟之一[11]。研究表明，這一步驟是依靠細(xì)胞膜上的特殊轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)完成的[12]，這種特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白便是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。而脂肪細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要以GLUT-4為主[13]。該試驗(yàn)結(jié)果中：添加生物素的試驗(yàn)組在12、24、48 h時(shí)GLUT-4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，這表明生物素的添加可以提高GLUT-4 mRNA的表達(dá)。而三個(gè)生物素試驗(yàn)組中，1 μmol/L組在24 h及48 h時(shí)的GLUT-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于0.2 μmol/L組及0.5 μmol/L組，其中24 h時(shí)極顯著(P<0.05)高于0.5 μmol/L組，雖然在12 h時(shí)GLUT-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于0.5 μmol/L，但差異并不顯著。這就表明在48 h內(nèi)以1 μmol/L濃度作用脂肪細(xì)胞對(duì)提升細(xì)胞中GLUT-4的相對(duì)表達(dá)效果最佳。GLUT-4作為葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的主要蛋白，其表達(dá)量地提升可以細(xì)胞對(duì)葡萄糖地吸收[14]并可改善脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗現(xiàn)象[15]。推測(cè)當(dāng)進(jìn)入胞內(nèi)的葡萄糖越多，用于合成TG的前體物質(zhì)可能會(huì)隨之增加，使TG沉積量提升。而當(dāng)細(xì)胞胰島素抵抗得到緩解時(shí)，細(xì)胞對(duì)相應(yīng)細(xì)胞因子的感受可能會(huì)得到提升，加速細(xì)胞內(nèi)TG沉積。以1 μmol/L濃度生物素作用脂肪細(xì)胞時(shí)，可通過(guò)提升GLUT-4的表達(dá)進(jìn)而達(dá)到促TG沉積的目的。

當(dāng)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)糖酵解產(chǎn)生丙酮酸，再經(jīng)各類酶催化逐步轉(zhuǎn)變?yōu)楦视腿ゴ鎯?chǔ)于細(xì)胞當(dāng)中[2]。PK作為糖酵解過(guò)程中關(guān)鍵酶，也是整個(gè)過(guò)程的關(guān)鍵限速酶之一[2]。在試驗(yàn)結(jié)果中：添加了生物素的試驗(yàn)組在12、24及48 h時(shí)PK mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，這說(shuō)明生物素的添加會(huì)提高細(xì)胞中PK mRNA相對(duì)表達(dá)量。而在添加了生物素的三個(gè)試驗(yàn)組中，1 μmol/L組在12、24及48 h時(shí)PK mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于0.2 μmol/L組及0.5 μmol/L組，尤其是在12 h時(shí)差異極顯著(P<0.01)，這就說(shuō)明在48 h內(nèi)以1 μmol/L濃度生物素作用脂肪細(xì)胞對(duì)提升細(xì)胞內(nèi)PK的相對(duì)表達(dá)，且以12 h時(shí)提升效果最為顯著。王彥等[16]發(fā)現(xiàn)當(dāng)PK蛋白濃度上升時(shí)，細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取與轉(zhuǎn)化能力都得到了提升，滕翠琴[17]發(fā)現(xiàn)當(dāng)PK含量呈上升趨勢(shì)時(shí)，葡萄糖利用亦趨于穩(wěn)定。當(dāng)葡萄糖吸收量上升時(shí)，TG的沉積亦會(huì)增長(zhǎng)[18]。推斷PK相對(duì)表達(dá)的提升可能加速了糖酵解進(jìn)程，使脂合成原料丙酮酸的快速合成，進(jìn)而使TG含量有所提升。以1 μmol/L濃度生物素作用脂肪細(xì)胞時(shí)，可通過(guò)提升PK的表達(dá)進(jìn)而達(dá)到促TG沉積的目的。

ACC1在脂肪酸的代謝過(guò)程中起了重要作用，其可以催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A[2]，并被證實(shí)可以通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控脂肪代謝過(guò)程[18]。在試驗(yàn)結(jié)果中，添加生物素的試驗(yàn)組在12、24及48 h時(shí)ACC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，這表明生物素的添加能促進(jìn)ACC1的表達(dá)。而三個(gè)試驗(yàn)組中，1 μmol/L組在12 h、24 h及48 h時(shí)ACC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于0.2 μmol/L組與0.5 μmol/L組。這表明在48 h內(nèi)以1 μmol/L濃度生物素作用脂肪細(xì)胞對(duì)提升細(xì)胞內(nèi)ACC1的相對(duì)表達(dá)效果最佳。生物素的缺乏將大幅降低羧化全酶合成酶的mRNA表達(dá)量[19]，而ACC作為生物素依賴性羧化酶其表達(dá)亦會(huì)受到影響。以1 μmol/L濃度生物素作用脂肪細(xì)胞可能會(huì)有效提升羧化全酶mRNA表達(dá)量進(jìn)而促進(jìn)ACC mRNA的表達(dá)。周紅宇等[20]試驗(yàn)利用瘦素抑制ACC mRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)ACC mRNA表達(dá)下降時(shí)，脂肪酸合成亦受到了影響。劉莉莉等[21]試驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)ACC表達(dá)量提升時(shí)，乳腺上皮細(xì)胞的乳脂合成增加。這說(shuō)明生物素可以通過(guò)提升ACC1 mRNA的相對(duì)表達(dá)來(lái)促進(jìn)脂肪酸合成，以達(dá)到促脂合成的目的。

動(dòng)物的體脂沉積所需要的脂肪酸大多是來(lái)自脂肪酸的從頭合成[2]，即由FAS催化下乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成甘油三酯的過(guò)程。在試驗(yàn)結(jié)果中，添加生物素的試驗(yàn)組在12、24及48 h時(shí)FAS mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，這表明生物素的添加能促進(jìn)FAS的表達(dá)。而在三個(gè)試驗(yàn)組中，0.5 μmol/L組在12、24及48 h時(shí)FAS mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于0.2 μmol/L組與1 μmol/L組。這表明在48 h內(nèi)以0.5 μmol/L濃度生物素作用脂肪細(xì)胞對(duì)提升細(xì)胞內(nèi)FAS的相對(duì)表達(dá)效果最佳。FAS的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP1c)調(diào)控[22-23]，而Ortega-Cuellar試驗(yàn)[24]指出生物素可以激活SREBP1c。以0.5 μmol/L濃度生物素作用脂肪細(xì)胞可能會(huì)有效提升SREBP1c活化程度，進(jìn)而促進(jìn)FAS mRNA的表達(dá)。舒常平等[25]等研究表明，F(xiàn)AS mRNA的表達(dá)可使脂肪快速沉積。這說(shuō)明生物素可以通過(guò)提升FAS mRNA的相對(duì)表達(dá)來(lái)促進(jìn)脂肪酸合成，以達(dá)到促脂合成的目的。

4　結(jié) 論

生物素可提升脂肪細(xì)胞GLUT-4、PK、FAS與ACC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量；當(dāng)以1 μmol/L生物素作用時(shí)，細(xì)胞GLUT-4、PK與ACC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于其它試驗(yàn)組并顯著(P<0.05)高于對(duì)照組；當(dāng)以0.5 μmol/L生物素作用時(shí)，細(xì)胞FAS mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于其它組。通過(guò)不同組間的比較，以1 μmol/L生物素作用脂肪細(xì)胞時(shí)對(duì)GLUT-4、PK與ACC1 mRNA提升效果最佳，以0.5 μmol/L生物素作用時(shí)對(duì)FAS mRNA提升效果最佳。

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