靶向DNA感受器佐劑研究進展

陳 靖，田 源，白國輝,2*

(1.遵義醫(yī)學院醫(yī)學與生物研究中心,貴州遵義 563000; 2.貴州省高等學?？谇患膊√厣攸c實驗室,貴州遵義 563000; 3.遵義醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院，貴州遵義 563000)

DNA感受器位于細胞漿內，類似于模式識別受體，能快速識別病原體迅速激活固有、適應性免疫應答。已有研究表明一些DNA感受器可以作為基因疫苗佐劑應用。DNA代謝的副產(chǎn)物類似于病原相關分子模式，來自死亡細胞的遺傳物質可以作為佐劑改善基于蛋白質的疫苗的免疫原性。近年來發(fā)現(xiàn)DNA質粒及其代謝產(chǎn)物可作為抗原直接與DNA感受器相互作用，進入細胞胞質的DNA(被機體認為是一種病原體感染的危險信號)可以被DNA感受器識別、結合，快速激活固有免疫應答在成纖維細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞中誘導產(chǎn)生大量的Ⅰ型干擾素(IFN)，增強DNA疫苗的免疫效應[1]。本文對國內外關于DNA感受器(DDX41，cGAS，ZBP1/DAI，RIG-I，MDA5，HMGB，IRF-1)、DNA質粒的代謝產(chǎn)物及其類似物(c-diGMP，DMXAA，CMA)作為佐劑的最新研究進展做一綜述。

1 DNA感受器作為佐劑

1.1 DDX41

DDX41是解旋酶DEXDc家族的成員。作為細胞質DNA傳感器，識別細胞質DNA、病毒DNA、細菌第二信使c-di-GMP通過DEAD結構域與STING結合通過激活STING-TBK1-IRF3信號通路誘導產(chǎn)生Ⅰ型干擾素[2]。DDX41能通過與CDN(cyclic dinucleotides)的結合誘導Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生[3]。Lazarte J M等[4]將DDX41作為佐劑構建疫苗(pEF-GD)免疫橄欖比目魚，發(fā)現(xiàn)通過加入分子佐劑DDX41，誘導產(chǎn)生Ⅰ型干擾素增強了適應性免疫應答，提高了比目魚的存活率。

1.2 cGAS

cGAS(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase)是通過產(chǎn)生第二信使cGAMP(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate)誘導干擾素的細胞溶質DNA傳感器[5]。哺乳動物細胞中的cGAS被入侵宿主細胞的細菌性或病毒性DNA激活，通過將DNA中GMP、AMP催化形成cGAMP激活STING相關的下游免疫信號通路，產(chǎn)生干擾素以及其他細胞因子[6]。研究顯示，來自cGAS缺陷型小鼠的細胞(包括成纖維細胞，巨噬細胞和樹突狀細胞)在DNA轉染或DNA病毒感染時不能產(chǎn)生Ⅰ型干擾素和其他細胞因子，表明cGAS是胞質DNA傳感器[7]；cGAS是一種潛在佐劑，可通過誘導產(chǎn)生Ⅰ型干擾素激發(fā)先天性免疫反應[8-9]。

1.3 ZBP1/DAI

Z-DNA結合蛋白1(ZBP1)也被稱為干擾素調節(jié)因子激活物(DAI)或DLM-1，其直接結合dsDNA并增強其與IRF3和TBK1的結合，DAI(DLM-1/ZBP1)在小鼠成纖維細胞中的表達選擇性增強了DNA介導的Ⅰ型IFN和其他參與先天免疫因子的產(chǎn)生[10]。采用電穿孔法將攜帶腫瘤相關抗原(tumor-associated antigens，TAAs)DNA聯(lián)合DAI基因(作為佐劑)的質粒接種于小鼠體內，發(fā)現(xiàn)促進有效的抗腫瘤細胞毒性T淋巴細胞產(chǎn)生，因此，顯示ZBP1/DAI在DNA疫苗具有佐劑的性質[11]。

1.4 RIG-Ⅰ

視黃酸誘導型基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)poly(dA-dT)通過RNA聚合酶Ⅲ轉變?yōu)镽NA(即5′-三磷酸RNA)，誘導Ⅰ型IFN產(chǎn)生[12]。雖然RIG-Ⅰ是細胞溶質RNA受體，但RIG-Ⅰ敲低與dsDNA誘導的Ⅰ型IFN減少相關，因此，是感染病毒核酸誘導Ⅰ型IFN的先天免疫激活的細胞溶質DNA感受器[13-14]。構建以RIG-Ⅰ為佐劑的DNA疫苗，結果顯示疫苗效誘導Ⅰ型IFN產(chǎn)生并提高流感特異性血清抗體水平[15]。即使在低抗原劑量下，RIG-Ⅰ通過STING途徑的激活也可以誘導增強適應性免疫應答，這表明RIG-Ⅰ可作為有效的DNA疫苗佐劑。

1.5 MDA5

RIG-Ⅰ樣受體家族的重要成員MDA5(黑素瘤差異化相關基因5)，較 RIG-Ⅰ具有更強誘導產(chǎn)生Ⅰ型IFN反應的能力[16]。將chMDA5的N-末端片段[chMDA5(1-483)]結合H5N1的血凝素(HA)形成共表達質粒免疫雞群,結果顯示與單獨的HA DNA接種相比，chMDA5(1-483)輔助的HA DNA疫苗誘導更強的免疫反應，MDA5可作為有效的DNA疫苗佐劑加以應用[17]。

1.6 HMGB1

高遷移率組蛋白B1(HMGB1)位于細胞核中，它不僅直接與DNA結合且招募其他蛋白質形成DNA-HMGB1復合物，可作為DNA調節(jié)器,HMGB1可以識別并結合外源性核酸，誘導產(chǎn)生Ⅰ型IFN，激發(fā)固有免疫反應[18]。

將HPV16 E7作為抗原和HMGB1作為佐劑構建DNA疫苗免疫小鼠，HMGB1以及其衍生短肽HP91可作為HPV疫苗的佐劑，用于改善HPV DNA疫苗的免疫原性[19]。

1.7 IRF-1

IRF-1是誘導干擾素表達蛋白中的轉錄調控因子家族中的一個成員，其與IFN及IFN誘導性基因中的順式作用元件結合，調控Ⅰ型IFN及相關基因的表達[20]。將IRF家族(IRF-1，IRF-3和IRF-7)的轉錄因子作為HIV-1 DNA疫苗的佐劑免疫Balb/c小鼠，發(fā)現(xiàn)只有IRF-1增強了抗原特異性免疫應答，因此IRF-1可作為DNA疫苗接種的佐劑[21]。DNA感受器作為識別受體與結合外來抗原,通過共同的STING-IRF3-IFN信號通路誘導IFN干擾素的產(chǎn)生而到達類似免疫佐劑增強免疫反應的作用。

2 DNA質粒代謝物作為佐劑

2.1 c-diGMP

環(huán)狀二-GMP(c-diGMP)是由細菌合成的小核苷酸第二信使。環(huán)二核苷酸 c-di-GMP、c-di-AMP 可以通過直接與STING(作為DNA感受器)的作用誘導產(chǎn)生Ⅰ型干擾素,當c-diGMP轉染哺乳動物細胞時,利用與dsDNA相同的信號途徑通過直接結合STING并激活下游TBK1-IRF3信號,誘導高水平的Ⅰ型IFN[22]。向Balb/c小鼠鼻內接種NIBRG-14(H5N1)血凝素(HA)和c-di-GMP(作為佐劑)構建的疫苗，發(fā)現(xiàn)c-di-GMP誘導更多病毒特異性CD4+T細胞產(chǎn)生，增強了疫苗的免疫效果[23]。表明c-di-GMP作為佐劑可以誘導Th1細胞反應增強，細胞因子升高。

構建疫苗通過激活c-di-GMP可抑制小鼠B16黑素瘤的免疫原性提高抗腫瘤作用，說明c-di-GMP是有效的疫苗佐劑[24]。

2.2 DMXAA

DMXAA，即5,6-二甲基呫噸酮-4-乙酸，是一種合成小分子化合物，是一種強有力的Ⅰ型IFN誘導劑。DMXAA參與TBK1-IRF3信號通路誘導Ⅰ型IFN產(chǎn)生。將其作為佐劑與OVA(作為抗原)免疫小鼠，證明與單獨OVA疫苗相比，其通過TBK1-IRF3信號軸產(chǎn)生Ⅰ型IFN，誘導更強且持久的特異性免疫反應。

2.3 CMA

抗病毒化合物10-羧甲基-9-吖啶酮(CMA)是一種有效的通過STING-TBK1-IRF3通路的Ⅰ型IFN誘導劑。

3 結語

國內外研究者多次利用DNA疫苗進行了針對感染性疾病(如流感、乙型肝炎、艾滋病和瘧疾等)和非感染性疾病(如非病毒性癌癥等)的人類臨床試驗，但比在其他哺乳動物中觀察到的免疫原性更低。為改善DNA疫苗的免疫原性進行的研究已經(jīng)表明，理解DNA疫苗的作用機制可能是成功改善其免疫原性的關鍵。研究者們目前的理解是DNA疫苗以兩種方式誘導先天和適應性免疫應答，第一種方式是通過DNA質粒編碼的蛋白質(或多肽)抗原可以在基質細胞(即，肌肉細胞)以及DC中表達，這些抗原被加工通過直接或交叉呈遞給幼稚的CD4或CD8T細胞。第二種方式是轉染的DNA質粒及其代謝物(例如cGAS，c-diGMP)與DNA感受器相互作用并激活STING-TBK1-IRF3途徑產(chǎn)生Ⅰ型IFN、前炎性細胞因子等激活并啟動適應性免疫應答[25]。

傳統(tǒng)的佐劑可能產(chǎn)生某些不良反應。理想的佐劑應該不僅具有增強免疫應答的作用，而且生物安全性較好。理想的佐劑應該不僅可以誘導較強和持久的免疫應答，而且要盡量減少其對機體的不良反應。新型DNA感受器佐劑不僅可以通過快速激發(fā)固有免疫以刺激更強的適應性免疫應答提高了免疫反應的強度，而且DNA質粒的代謝產(chǎn)物及DNA感受器作為信號分子佐劑安全性較好，符合新型佐劑對生物安全性要求高的標準。

深入研究DNA感受器分子特征、免疫功能及其信號轉導機制，其與DNA質粒的相互作用的機制對于揭示DNA疫苗的免疫機制、提高疫苗的效應和研發(fā)分子佐劑具有重要意義。截至目前，除文中討論的信號分子作為基因佐劑外,對于已證明是DNA傳感器的黑色素瘤缺乏因子2(AIM2),γ干擾素誘導蛋白16(也稱為p204),STING(最有潛力的DNA感受器,幾乎參與所有胞內B型dsDNA模式識別受體介導的IFN-β通路)。作為佐劑性質的研究尚未見國內外的相關報道。DNA感受器及其代謝產(chǎn)物作為佐劑的研究為理想佐劑的研制開拓出一條新的思路，為DNA疫苗的分子設計提供新的思路和應用前景。

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