喹乙醇對大腸桿菌抑菌效果的研究

李 迅,黃小燕

（上海亙泰實業(yè)集團，上海201015）

喹乙醇（Olaquindox），屬喹惡啉類，又名喹酰胺醇，商品名倍育諾、快育靈等，由于大量研究發(fā)現(xiàn)喹乙醇具有的潛在毒性，大量或長期使用會引起較嚴重的中毒反應(yīng)，另一方面，喹乙醇還可以通過食物鏈的富集作用危害人類身體健康 （王仁華等，2017）。因此，歐盟從1999年開始全面禁止使用喹乙醇。針對上述情況，本文為在低于35kg豬的生長過程中高效、合理利用低毒的抑菌藥物喹乙醇提供理論依據(jù)。

1　材料

1.1　主要器材

濾紙片，試管，試管架，平皿，離心管，燒杯，1ml移液槍，5ml移液槍，錐形瓶，電子天平，高壓滅菌鍋，水浴鍋，離心機，超凈工作臺，超聲清洗器，恒溫培養(yǎng)箱等。

1.2　供試菌種

大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙門氏菌（salmonella）均由華南師范大學(xué)微生物實驗室提供。

1.3　試劑

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，LB瓊脂培養(yǎng)基，MH肉湯培養(yǎng)基，氯化鈉，蒸餾水，喹乙醇粉末等。

2　方法

2.1　抑菌試驗

2.1.1　試劑的配制

喹乙醇（100ppm）：市場上銷售的喹乙醇粉劑中喹乙醇的含量是50%，配制純的100ppm喹乙醇，就要每100ml水中加入喹乙醇粉劑20mg。

2.1.2　平板的制作

將LB瓊脂培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，待冷卻至 60℃左右，于超凈工作臺內(nèi)分別倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿約 15ml，迅速蓋好皿蓋并輕輕晃動，保證培養(yǎng)基均勻鋪于皿底，待冷卻凝固。將活化后的大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌分別密涂于LB瓊脂培養(yǎng)基上。

2.1.3　紙片法

取直徑 6mm的滅菌濾紙片放入制備好的喹乙醇藥物中，充分浸泡2h。用無菌鑷子夾取被喹乙醇泡過的濾紙片，分別貼于含菌平板上，每皿貼4片，中間空白對照貼無菌生理鹽水泡過的濾紙片，每種菌重復(fù)三皿，將貼好藥敏片的培養(yǎng)皿放于 36℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，細菌培養(yǎng)18～20h。取出觀察結(jié)果，用游標卡尺測量抑菌圈的直徑，比較抑菌效果。重復(fù)試驗3次，取各測量值的平均值。

2.2　最小抑菌濃度的測定

2.2.1　原理

醫(yī)學(xué)上用來測試細菌對藥物敏感性的一種方法，用此法來測定飼料添加劑的最小抑菌濃度，先將測試飼料添加劑作一系列倍比稀釋，然后各試管加入適當稀釋的試驗菌液，搖勻，經(jīng)培養(yǎng)后觀察，以飼料添加劑最小抑菌濃度(MIC)管，即為試驗菌株的敏感度。

2.2.2　實驗步驟

2.2.2.1用LB瓊脂培養(yǎng)基倒平板，制作含有固體培養(yǎng)基的無菌平皿，將保存在-20℃冰箱的大腸桿菌菌株劃線接種到平皿中，37℃培養(yǎng)分離得到單菌落，再取單菌落劃線接種到平皿中，得到單菌落，此步驟重復(fù)兩次以上。

2.2.2.2在超凈工作臺中操作，將從步驟1中得到的單菌落接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，得到菌懸液，37℃培養(yǎng)18h后，取菌懸液，用生理鹽水稀釋菌懸液，比對麥氏比濁管，使菌懸液中菌濃度近似值為0.5麥氏濃度，然后根據(jù)這個倍數(shù)，用MH肉湯培養(yǎng)基稀釋菌懸液得到0.5麥氏濃度的菌液。

2.2.2.3制備1000ppm濃度的喹乙醇溶液：稱取200mg含有50%喹乙醇濃度的粉末，溶解于已經(jīng)滅菌了的100mlMH肉湯培養(yǎng)基中，在50℃～60℃的水浴鍋中加熱，促進溶解，然后用離心機離心得到澄清的含有1000ppm喹乙醇的MH肉湯培養(yǎng)基。

2.2.2.4在超凈工作臺中操作，取16支滅菌試管，編號1～16，1號試管加5ml含有1000ppm喹乙醇的MH肉湯培養(yǎng)基，2、3、4、……、13、14、16 號試管加 5ml滅菌了的 MH 肉湯培養(yǎng)基，第15號試管加5ml含有1000ppm喹乙醇的MH肉湯培養(yǎng)基作為對照。

2.2.2.5接著在步驟4后進行二倍稀釋，第2號試管加入5ml含有1000ppm喹乙醇的MH肉湯培養(yǎng)基，輕微搖晃混勻，得到第2號試管內(nèi)喹乙醇濃度為500ppm，接著從第2號試管取出5ml液體到第3號試管內(nèi)，輕微搖晃混勻，得到第3號試管內(nèi)喹乙醇濃度為250ppm，……，依次逐管進行稀釋到第14管，從14管取出5ml液體倒掉，從而得到第1～14號試管內(nèi)喹乙醇濃度分別為：1000、500、250、125、64、32、16、8、4、2、1 和 0.5ppm。

2.2.2.6接種：向第1-14、16號試管內(nèi)接種1ml的0.5麥氏濃度的菌懸液，第16號試管也作為對照組，第15號試管加1ml含有1000ppm喹乙醇的MH肉湯培養(yǎng)基，輕微搖晃混勻，用過濾膜封口試管，在37℃、150r/min的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

2.2.2.7觀察并記錄：24h后將試管取出，觀察結(jié)果，以無菌生長的最低藥液濃度作為喹乙醇的最小抑菌濃度，重復(fù)試驗3次。

3　結(jié)果

圖1　100ppm喹乙醇抑菌圈平板圖

圖2　1000ppm喹乙醇抑菌圈平板圖

表1　喹乙醇（1000ppm）抑菌圈直徑

3.1　抑菌實驗結(jié)果

根據(jù)圖1和圖2觀察發(fā)現(xiàn)，低濃度的喹乙醇沒有表現(xiàn)出抑菌效果，而高濃度的喹乙醇有抑菌效果，且只對陰性菌有抑制作用，對陽性菌沒有抑制作用；從表1和圖2得出：1000ppm喹乙醇對沙門氏菌的效果要大于大腸桿菌。

3.2　最小抑菌濃度的測定

下圖3中觀察得到高濃度喹乙醇情況下試管內(nèi)液體澄清，抑菌效果明顯，低濃度喹乙醇情況下出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，濃度越低，渾濁現(xiàn)象越明顯，從而抑菌作用也越來越小。對照組第15號試管澄清，另一對照組第16號試管出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象。

圖3　16支試管渾濁現(xiàn)象圖

4　結(jié)論

本試驗同時采用試管二倍稀釋法聯(lián)合紙片法對喹乙醇進行了體外抑菌作用研究，克服了以往試驗的不足，既定性又定量地體現(xiàn)了喹乙醇的抑菌作用。實驗結(jié)果顯示喹乙醇對大腸桿菌和沙門氏菌有抑菌效果，印證了喹乙醇對大腸桿菌和沙門氏菌等陰性菌有較強的抑菌效果，但沒有得出對金黃色葡萄球菌有抑菌效果，這可能是需要更高的喹乙醇濃度才對金黃色葡萄球菌等陽性菌有抑菌效果。喹乙醇是一種可以使用的添加劑，但必須嚴格按照農(nóng)業(yè)部的規(guī)定，限制用量及其飼喂對象，因此，規(guī)范喹乙醇的使用，在飼料當中精確的添加喹乙醇，既能促進豬的健康生長，又能抑殺致病菌，對于養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展具有重要的作用。

[1]宋春美,侯玉澤,劉宣兵,等.喹乙醇的危害及檢測方法研究進展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,38(12)：13-17.

[2]王仁華,練小華,謝益根.飼料中喹乙醇的應(yīng)用效果研究[J].飼料與畜牧：新飼料,2017(2)：56-57.

[3]鄔溪芮,張珍珍.喹乙醇的危害及其檢測方法[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊,2017(9).