負(fù)載乙肝核心抗原-黑色素瘤抗原-A3融合蛋白的外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞體外殺傷作用的實(shí)驗(yàn)

林 知，陳 意，林童俊，焦順昌解放軍總醫(yī)院 腫瘤內(nèi)一科，北京 00853；達(dá)爾豪斯大學(xué)，加拿大哈里法克斯 B3K6R8

肺癌是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率與死亡率均排在首位，嚴(yán)重威脅著人類的生命和健康。75%的肺癌患者在初次診斷時(shí)已是晚期，往往已伴發(fā)局部浸潤(rùn)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，放療、化療、靶向治療是晚期肺癌的主要治療方式，但5年生存率低[1-2]。腫瘤免疫治療以其高效、低毒的特性成為一個(gè)新的治療手段，給晚期肺癌患者帶來(lái)了希望[3-4]。黑色素瘤抗原-A3(melanoma antigen gene-A3，MAGE-A3)被證實(shí)在正常的成熟組織中不表達(dá)(胎盤(pán)及睪丸除外)，但在多種腫瘤組織中有不同程度的表達(dá)，其在肺癌中的表達(dá)率在40%以上，成為非小細(xì)胞肺癌免疫治療中重要的靶抗原。MAGE-A3基因編碼的肽段在免疫提呈細(xì)胞內(nèi)被加工，特異性的腫瘤抗原與HLA-I類分子結(jié)合形成復(fù)合物，之后被效應(yīng)T淋巴細(xì)胞識(shí)別，對(duì)MAGE-A3陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性殺傷[5]。

材料和方法

1 質(zhì)粒與細(xì)胞株 含有2種MAGE-A3多肽(MAGEA3146-160-FFPVIFSKASSSLQL和MAGE-A3168-176-EVDPIGHLY)和乙肝核心抗原(hepatitis B core antigen，HBVc)的cDNA重組質(zhì)粒pET28a-HBVc-MAGE-A3以及僅含有HBVc蛋白的pET28a-HBVc，兩者均為加拿大Dr.Lin協(xié)助構(gòu)建。非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H358及人腎上皮細(xì)胞株HEK-293T購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

2 主要試劑和耗材 DMEM培養(yǎng)基(購(gòu)自Gibcobrl公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(購(gòu)自Gibcobrl公司)；PBS(購(gòu)自Hclyone)；胎牛血清(購(gòu)自BI公司)；重組人白細(xì)胞介素-2(recombination human interleukin-2，rhIL-2)、重組人白細(xì)胞介素-4(recombination human interleukin-4，rhIL-4)(均購(gòu)自 Peprotech公司 )；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(購(gòu)自Sigma公司)；淋巴細(xì)胞分離液Ficoll(購(gòu)自上海生化試劑二廠)；鼠抗人MAGE-A3單克隆抗體(購(gòu)自abcam公司)；羊抗鼠二抗(購(gòu)自Santa Cruz公司)；GAPDH抗體(購(gòu)自Santa Cruz公司)；LDH釋放檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自DojinDo)細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)皿；6孔板、12孔板、96孔板(均購(gòu)自corning公司)；鎳柱 (GE Healthcare；Ni SepharoseTM6 Fast Flow)；Amicon Ultra-15 10K Centrifugal Filter Devices。

3 HBVc-MAGE-A3多肽融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-HBVc-MAGE-A3轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21，取適量轉(zhuǎn)化成功的大腸埃希菌BL21菌液接種至轉(zhuǎn)接至400 ml含10 mmol葡萄糖和100 g/ml卡那霉素(Kan)的LB液體培養(yǎng)基，37℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入終濃度為1.0 mmol/L的異丙基硫化-β-D-半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)16 ～ 18 h；收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌體。HBVc-MAGE-A3多肽融合蛋白的分離和純化加入160 ml Binding Buffer重懸菌體；添加Lysozyme至終濃度為0.2 mg/ml，室溫孵育10 min；超聲處理裂解菌體；4℃，10 000 r/min離心20 min，收集沉淀；30 ml Solubilization Buffer重懸沉淀，超聲處理促進(jìn)沉淀溶解，4℃孵育過(guò)夜；并處理樣品，行考馬斯亮藍(lán)染色取1 000 ml誘導(dǎo)表達(dá)的菌液，10 000×g、4℃離心5 min；菌體沉淀用50 ml磷酸鹽緩沖液重懸，冰浴，超聲裂解細(xì)菌，加入Triton X-100至終體積分?jǐn)?shù)為1%，混勻，冰浴放置30 min；12 000×g、4℃離心20 min；取上清液，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecy1 sulfate polyacrylamidegel eletrophoresis，SDS-PAGE)鑒定目的蛋白。鎳層析柱分離HBVc-MAGE-A3融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE及凝膠薄層掃描鑒定純化蛋白的純度，最后將純化的蛋白進(jìn)行超濾脫鹽，直至脫鹽至合適濃度，0.22μm膜過(guò)濾除菌，-70℃保存。HBVc蛋白也按照以上步驟獲取。

4 PBMC疫苗的制備 選取一名健康志愿者(男性，30歲)外周血100 ml，分裝至4個(gè)50 ml離心管，等體積(1：1)加入人淋巴細(xì)胞分離液Ficoll，密度梯度離心，獲得PBMC，調(diào)整其細(xì)胞密度為1×106/ml、分別加入 0.88μmol的 HBVc-MAGEA3融合蛋白，0.88μmol的HBVc蛋白以及等體積的PBS，共培養(yǎng)培養(yǎng)2 h后，PBS洗滌3次，使用40μg/ml絲裂霉素C處理沖擊后的PBMC 1 h，PBS洗3次。

5 細(xì)胞株培養(yǎng)及MAGE-A3蛋白表達(dá)檢測(cè) 分別傳代培養(yǎng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H358和人腎上皮細(xì)胞株HEK-293T，提取兩種細(xì)胞的目的蛋白，通過(guò)Western blot技術(shù)檢測(cè)MAGE-A3蛋白的表達(dá)。

6 效應(yīng)細(xì)胞的體外誘導(dǎo) 用含IL-2、20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml；按照PBMC疫苗細(xì)胞與淋巴細(xì)胞數(shù)量比1：10的比例混合培養(yǎng)并分為以下幾組：NTC組為未負(fù)載任何蛋白的PBMC+正常PBMC細(xì)胞；HBVc組為負(fù)載HBVc蛋白的PBMC+正常PBMC細(xì)胞；HBVc-MAGE-A3組為負(fù)載HBVc-MAGE-A3融合蛋白的PBMC+正常PBMC細(xì)胞。使用20 U/ml IL-2、10 U/ml IL-7和 10% FBS的 RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d，以獲得效應(yīng)細(xì)胞。

7 效應(yīng)細(xì)胞的殺傷效應(yīng)檢測(cè) 使用LDH釋放檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組效應(yīng)細(xì)胞殺傷能力。反應(yīng)組分為NTC、HBVc和HBVc-MAGE-A3三組。NTC組：腫瘤細(xì)胞+未負(fù)載任何蛋白PBMC刺激的淋巴細(xì)胞；HBVc組：腫瘤細(xì)胞+負(fù)載HBVc蛋白PBMC刺激的淋巴細(xì)胞；HBVc-MAGE-A3組：腫瘤細(xì)胞+負(fù)載HBVc-MAGE-A3融合蛋白PBMC刺激的淋巴細(xì)胞。每組分別以效靶比1∶1、2∶1、5∶1、10∶1、20∶1的比例加入效應(yīng)細(xì)胞和腫瘤靶細(xì)胞各50μl，總體積為100μl。根據(jù)腫瘤細(xì)胞的不同，分為NCI-H358細(xì)胞組和HEK-293T細(xì)胞組。

8 LDH法檢測(cè)淋巴細(xì)胞的殺傷活性 將上述殺傷試驗(yàn)96孔板放置于于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3.5 h。最大釋放組每孔加入5μl裂解液，繼續(xù)孵育15 min。每孔加LDH反應(yīng)液100μl，室溫避光反應(yīng)15 min。每孔加50μl終止液，輕搖10 s終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀檢測(cè)，波長(zhǎng)490 nm，讀取OD值。特異性殺傷活性計(jì)算：細(xì)胞毒%=(反應(yīng)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放OD值-靶細(xì)胞自然釋放OD值)/(靶細(xì)胞最大釋放OD值-靶細(xì)胞自然釋放OD值)×100%。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以-x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，事后檢驗(yàn)采用SNK檢驗(yàn)方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HBVc-MAGE-A3融合蛋白的獲得 首先將HBVc DNA或者HBVc-MAGE-A3 DNA片段克隆到原核表達(dá)載體pET28a質(zhì)粒中，構(gòu)建pET28a-HBVc重組質(zhì)粒和pET28a-HBVc-MAGE-A3重組質(zhì)粒(圖1A、圖1B)。然后將重組質(zhì)粒pET28a-HBVc-MAGEA3和pET28a-HBVc轉(zhuǎn)染大腸埃希菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，含重組質(zhì)粒pET28a-HBVc-MAGEA3和pET28a-HBVc的大腸桿埃希菌BL21能夠表達(dá)分子量約22.45 kU的HBVc-MAGE-A3融合蛋白和18.70 kU的HBVc蛋白(圖1C、圖1D)。經(jīng)SDS-PAGE及凝膠薄層掃描鑒定純化蛋白的純度約為90%。

2 癌細(xì)胞株中MAGE-A3蛋白的表達(dá) 采用Western blot法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H358和人腎上皮細(xì)胞株HEK-293T中MAGE-A3蛋白的表達(dá)，可見(jiàn)NCI-H358表達(dá)量較高，而HEK-293T幾乎不表達(dá)(圖2)。因此，以MAGE-A3陽(yáng)性的NCI-H358肺癌細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞攻擊的細(xì)胞，而MAGE-A3弱表達(dá)的HEK-293T為陰性對(duì)照組。

3 效應(yīng)細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)負(fù)載HBVc-MAGE-A3融合蛋白的PBMC細(xì)胞刺激的HBVc-MAGE-A3組對(duì)NCI-H358的殺傷率顯著高于其他兩組(P＜0.05)，而經(jīng)負(fù)載HBVc蛋白的PBMC細(xì)胞刺激的HBVc組與未負(fù)載任何蛋白的PBMC細(xì)胞刺激的NTC組對(duì)NCI-H358的殺傷作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(圖3)。從效靶比來(lái)看，三組的最高殺傷效率均在20∶1。以MAGEA3弱表達(dá)的HEK-293T為靶細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)組殺傷率均非常低且三組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果A：質(zhì)粒圖譜； B：pET28a-HBVc-MAGE-A3質(zhì)粒和pET28a-HBVc質(zhì)粒構(gòu)建； C：HBVc蛋白分離純化結(jié)果(SDS-PAGE)；D：HBVc-MAGE-A3融合蛋白分離純化結(jié)果(SDS-PAGE)Fig. 1 Plasmid construction A: Plasmid profile; B: Constructions of pET28a-HBVc-MAGE-A3 plasmid and pET28a-HBVc plasmid; C: HBVc protein separation and purification (SDS-PAGE); D: HBVc-MAGE-A3 fusion protein separation and purification (SDSPAGE)

圖2 靶細(xì)胞NCI-H358和HEK-293T細(xì)胞中MAGE-A3表達(dá)檢測(cè)Fig. 2 MAGE-A3 expression detection in NCI-H358 cells and HEK-293T cells

圖3 三種效應(yīng)細(xì)胞對(duì)兩組靶細(xì)胞殺傷效果A：以NCI-H358細(xì)胞為靶細(xì)胞(aP＜0.05,與HBVc組及NTC組比較)； B：以HEK-293T細(xì)胞為靶細(xì)胞(P＞0.05,與HBVc組及NTC組比較)Fig. 3 Specific killing effects of different effector cells on target cells A: NCI-H358 cell group (aP＜0.05, vs HBVc group & NTC group); B: HEK-293T cell group (P＞0.05, vs HBVc group& NTC group)

討 論

黑色素瘤抗原(melanoma antigen，MAGE)基因是最早被發(fā)現(xiàn)的一族人類腫瘤特異性抗原基因。MAGE基因的表達(dá)產(chǎn)物中MAGE-3蛋白的免疫原性較強(qiáng)，是腫瘤特異性抗原的典型代表。MAGEA3是廣泛存在于多種腫瘤中的腫瘤特異性抗原，除了在胎盤(pán)和睪丸中低水平表達(dá)外，在其他正常成熟組織均不表達(dá)，而睪丸是免疫豁免器官，所以MAGE-A3是一種可以作為多種腫瘤免疫治療靶點(diǎn)的理想腫瘤相關(guān)抗原[6]。目前已經(jīng)有大量的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)證明基于MAGE-A3細(xì)胞治療的疫苗是有效的，如Belagenpumatucel-l可以明顯改善腫瘤病人的生存狀況[7-8]。本研究選用的多肽正是用于疫苗的多肽，具有較強(qiáng)的免疫原性，并且得到了與先前研究相同的效果[9-10]。在細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)結(jié)果中可以看出，我們?nèi)诤狭硕嚯囊呙绲娜诤系鞍譎BVc-MAGE-A3可以誘導(dǎo)出針對(duì)MAGE-A3高表達(dá)靶細(xì)胞的特異性殺傷，效靶比為20∶1時(shí)，HBVc-MAGE-A3組的殺傷效率可以達(dá)到90%，而HBVc組和NTC組只有45%。而使用MAGE-A3低表達(dá)的細(xì)胞HEK-293T作為靶細(xì)胞時(shí)，三組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明我們的HBVc-MAGE-A3融合蛋白疫苗具有誘導(dǎo)出MAGE-A3特異性殺傷的能力。

以往的MAGE-A3疫苗多數(shù)使用的是DC細(xì)胞作為抗原遞呈細(xì)胞，因?yàn)镈C細(xì)胞是人體內(nèi)主要的遞呈細(xì)胞，但DC細(xì)胞在外周血中的比例較低，大約只有0.1%，并且獲得過(guò)程復(fù)雜，獲得率很低，對(duì)老年患者和腫瘤晚期患者的體質(zhì)要求較高，這對(duì)后期的臨床轉(zhuǎn)化造成較大的障礙[11-13]。我們研究發(fā)現(xiàn)，使用PBMC作為抗原遞呈細(xì)胞也可以得到較好的殺傷腫瘤細(xì)胞的效果，并且PBMC具有獲得過(guò)程容易，獲得率高的特點(diǎn)，較DC細(xì)胞對(duì)患者體質(zhì)要求較低。

以往的MAGE-A3疫苗研究大都使用抗原遞呈細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)，促使CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生特異性的識(shí)別，并特異性地?cái)U(kuò)增針對(duì)MAGE-A3陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞殺傷功能的細(xì)胞[11,14-15]。我們使用PBMC細(xì)胞作為抗原遞呈細(xì)胞的共培養(yǎng)對(duì)象，不僅可以刺激特異性的CD8+T細(xì)胞增殖，還可以充分發(fā)揮CD4+T細(xì)胞的輔助功能，使CD8+T的殺傷功能更強(qiáng)[16]。并且使用PBMC作為殺傷效應(yīng)細(xì)胞，還可以充分發(fā)揮其他殺傷細(xì)胞的功能，如NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞。

我們使用了更有優(yōu)勢(shì)的佐劑分子HBVc。HBVc與MAGE-A3多肽融合以后，可以在體外自發(fā)形成類病毒顆粒狀，并把MAGE-A3多肽包裹在最外層，使抗原遞呈細(xì)胞接觸抗原的機(jī)會(huì)大大增加[17]。

我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，負(fù)載HBVc-MAGE-A3融合蛋白抗原的外周血單個(gè)核細(xì)胞能夠成功誘導(dǎo)出特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，并且對(duì)MAGE-A3高表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的殺傷作用顯著優(yōu)于MAGE-A3低表達(dá)的靶細(xì)胞，證實(shí)了MAGE-A3作為腫瘤免疫治療的靶點(diǎn)具有特異性免疫殺傷效果。

MAGE-A3特異性地在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)，為特異性免疫治療開(kāi)辟了一條新的道路。但是也有很多的問(wèn)題有待論證：臨床試驗(yàn)中MAGE-A3疫苗的劑量、細(xì)胞的輸注方式、人體內(nèi)的免疫環(huán)境等是否會(huì)影響腫瘤的特異性殺傷，是否與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。相信通過(guò)逐步優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與科學(xué)論證，針對(duì)晚期癌癥的特異性免疫治療有效率將會(huì)逐步提高。

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