人乳頭瘤病毒陽性宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變患者血漿miR-155的表達(dá)及臨床意義

常春紅，馮 磊，管曉卿，穆啟梅，汪新宇，郭甜靜

涿州市醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河北涿州 072750

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率有逐年上升和年輕化的趨勢，已成為嚴(yán)重威脅女性生命健康的惡性腫瘤之一[1]。人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染是宮頸癌及宮頸上皮內(nèi) 瘤 變 (cervical intraepithelial neoplasia，CIN)發(fā)生的高危因素，而CIN是宮頸癌的癌前病變，早期診斷和治療CIN對于預(yù)防宮頸癌有著重要的意義。近年研究表明，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)在腫瘤的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程中起著重要的作用，其中miRNA-155與多種惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，可能在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮癌基因的作用[2-3]。另有研究表明，持續(xù)高風(fēng)險(xiǎn)HPV感染會引起細(xì)胞癌基因或有抑癌作用的miRNA表達(dá)失調(diào)[4]，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化。本研究通過檢測血漿miRNA-155在HPV陽性宮頸癌患者中的表達(dá)情況，分析其早期診斷宮頸癌的價(jià)值，旨在為宮頸癌的早期診斷及靶向治療提供依據(jù)。

資料和方法

1 一般資料 選取2014年3月- 2017年3月本院婦產(chǎn)科收治的HPV陽性宮頸癌患者126例(宮頸癌組)，年齡29 ～ 74(46.82±10.63)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)符合國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(FIGO)分類標(biāo)準(zhǔn)和WHO分級標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)病理確診為宮頸癌；2)高危型 HPV(HR-HPV)陽性，如 HPVl6、18、31、33、35、39、45；3)術(shù)前未接受放射治療、化療及生物免疫治療；4)能配合本次研究且病歷資料完整。宮頸癌臨床分期：I期47例，Ⅱ期59例，Ⅲ期14例，Ⅳ期6例；病理類型：鱗狀細(xì)胞癌118例，腺癌8例；病理分級：G1 19例，G2 45例，G3 62例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移104例。另取同期與宮頸癌患者年齡匹配的HPV陽性宮頸上皮內(nèi)瘤病變患者65例(CIN Ⅱ 21例、CIN Ⅲ 44例)作為CIN組，HPV單純陽性或HPV陽性子宮良性病變者65例作為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

2 miRNA-155檢測 所有研究對象均于清晨空腹抽靜脈血5 ml，離心分離血漿后保存于-80℃冰箱待檢。RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司，在ABI 7500型熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。取300μl血漿樣本，加入1 ml總miRNA提取液，按照血液總miRNA快速提取試劑盒(miRNeasy血漿提取試劑盒)說明書從血漿中提取總RNA。以U6為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參，miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5μl RNA模板，3μl U6及miRNA特異性莖環(huán)引物，0.15μl 100 mmol/L dNTPs(with dTTP)，1.00μl逆轉(zhuǎn)錄酶 (50 U/μl)，1.50μl 10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.19 μl RNase抑制劑 (20 U/μl)，4.16 μl無菌三蒸水。反應(yīng)條件：16℃ 30 min，42℃30 min，85℃ 5 min， 4℃保存，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以U6為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參，反應(yīng)體系：1.00 μl TaqMan Small RNA Assay(20×)溶液，10μl TaqMan⑧Universal PCR Master MixⅡ(2×)溶液，1.33 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，7．67μl DEPC水。擴(kuò)增條件：95℃10 min 1個(gè)循環(huán)，95℃15 s、60℃ 60 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。每個(gè)反應(yīng)體系中熒光信號達(dá)到所設(shè)定的閾值的經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值，以U6為內(nèi)參照，采用2-△△Ct法計(jì)算miRNA-155的相對表達(dá)水平，其中△ Ct=Ct目的基因-CtU6。

3 SCCA及CA125檢測 分別采用貝克曼和羅氏電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑盒，化學(xué)發(fā)光法測定SCCA和CA125水平，操作過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

4 分析指標(biāo) 分析miRNA-155表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系，ROC曲線評價(jià)miRNA-155對HPV陽性CIN及宮頸癌的診斷價(jià)值。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以-x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征曲線(ROC)評價(jià)血漿miRNA-155等指標(biāo)對HPV陽性宮頸癌的診斷價(jià)值，曲線下面積(area under curve，AUC)的比較采用Z檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組血漿miRNA-155、SCCA及CA125表達(dá)水平比較 宮頸癌組血漿miRNA-155、SCCA及CA125表達(dá)水平均明顯高于CIN組和對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)；CIN組血漿miRNA-155表達(dá)水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

2 HPV陽性宮頸癌組血漿miRNA-155表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 隨著宮頸癌臨床分期的進(jìn)展，miRNA-155表達(dá)水平逐漸升高，Ⅲ～Ⅳ期HPV陽性宮頸癌患者miRNA-155表達(dá)水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。血漿miRNA-155表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度也相關(guān)(P＜0.05)，而與年齡、病理類型、病理分級、腫瘤大小及絕經(jīng)狀態(tài)無關(guān)(P均＞0.05)。見表2。

表1 各組血漿miRNA-155、SCCA及CA125表達(dá)水平比較Tab. 1 Comparison of levels of plasma miRNA-155, SCCA and CA125 in each group (-x±s)

表2 HPV陽性宮頸癌患者血漿miRNA-155表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab. 2 Relationship between plasma miRNA-155 expression and clinicopathological characteristics in patients with HPV positive cervical cancer

3 血漿miRNA-155、SCCA及CA125對HPV陽性CIN的診斷價(jià)值 血漿miRNA-155診斷HPV陽性 CIN 的 AUC(95%CI)為 [0.832(0.751 ～ 0.908)]，顯著高于 SCCA[0.705(0.627 ～ 0.784)]及 CA125[0.628(0.552 ～ 0.703)](Z=6.713、4.705，P均＜ 0.05)；SCCA與CA125差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.043，P＞0.05)。血漿miRNA-155診斷HPV陽性CIN的最佳截值為7.82，敏感度和特異度為81.3%和80.4%。見圖1和表3。

4 血 漿miRNA-155、SCCA及CA125對 HPV陽性宮頸癌的診斷價(jià)值 血漿miRNA-155診斷HPV陽性宮頸癌的AUC(95%CI)為[0.885(0.803 ～0.967)]， 顯 著 高 于 SCCA[0.783(0.715 ～ 0.865)]及CA125[0.681(0.604 ～ 0.757)](Z=7.115、5.108，P均＜0.05)；SCCA與CA125差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.630，P＞0.05)。血漿miRNA-155診斷HPV陽性宮頸癌的最佳截值為12.65，敏感度和特異度為87.2%和84.6%。見圖2和表4。

5 HPV陽性宮頸癌患者血漿miRNA-155與SCCA、CA125的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示，血漿miRNA-155與SCCA呈正相關(guān)(r=0.702，P＜0.01)；血漿miRNA-155與CA125無明顯相關(guān)性(r=0.115，P＞0.05)。見圖3。

表3 血漿miRNA-155、SCCA及CA125對HPV陽性CIN的診斷價(jià)值Tab. 3 Value of plasma miRNA-155, SCCA and CA125 in diagnosis of HPV positive CIN

表4 血漿miRNA-155、SCCA及CA125對HPV陽性宮頸癌的診斷價(jià)值Tab. 4 Value of plasma miRNA-155, SCCA and CA125 in diagnosis of HPV positive cervical cancer

圖1 血漿miRNA-155、SCCA及CA125診斷HPV陽性CIN的ROC曲線Fig. 1 ROC curve of plasma miRNA-155, SCCA and CA125 in diagnosis of HPV positive CIN

圖2 血漿miRNA-155、SCCA及CA125診斷HPV陽性宮頸癌的ROC曲線Fig. 2 ROC curve of plasma miRNA-155, SCCA and CA125 in diagnosis of HPV positive cervical cancer

討 論

宮頸癌的發(fā)生是多基因、多因素和多階段共同作用的過程，其病理機(jī)制目前尚不完全明確。微小核糖核酸(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼的小RNA，在腫瘤生理病理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，有望成為一種新的疾病診斷、分類和預(yù)后判斷的工具[5]。HPV檢測是臨床上篩查宮頸癌的常用方法，而HR-HPV與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。HR-HPV主要通過早期表達(dá)的調(diào)節(jié)蛋白作用于宿主細(xì)胞的miRNA，引起宿主細(xì)胞生物學(xué)行為改變，進(jìn)而導(dǎo)致宿主細(xì)胞發(fā)生癌變。近期的研究發(fā)現(xiàn)，血漿miRNA-155在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，是診斷惡性腫瘤患者的特異性標(biāo)記物[7-8]。然而，血漿miRNA-155能否作為宮頸癌早期診斷的分子標(biāo)記物，目前尚未明確。

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組血漿miRNA-155、SCCA及CA125表達(dá)水平均明顯高于CIN組和對照組，CIN組血漿miRNA-155表達(dá)水平明顯高于對照組。在HPV陽性宮頸癌患者臨床病理分期中，Ⅲ～Ⅳ期患者血漿miRNA-155的表達(dá)水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者。說明血漿miRNA-155在HPV陽性宮頸癌患者中異常高表達(dá)，對細(xì)胞的癌基因和抑癌基因具有調(diào)控作用，可作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。既往研究表明，miRNA-155對腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移、凋亡及機(jī)體腫瘤免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮著重要的作用，并與惡性腫瘤的預(yù)后判斷、臨床病理分期及轉(zhuǎn)移情況有關(guān)[9]。Gocze等[10]研究認(rèn)為，宮頸癌患者miRNA-155表達(dá)水平異常升高，miRNA-155通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖。另有研究表明，miRNA-155表達(dá)水平上調(diào)與宮頸癌組織中臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、HPV感染和生存情況相關(guān)，它可以作為宮頸癌潛在的預(yù)后標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)[11]。此外，進(jìn)一步分析miRNA-155表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度＞1/2肌層的宮頸癌患者miRNA-155表達(dá)水平明顯升高，提示miRNA-155與HPV陽性宮頸癌患者的病情進(jìn)展有關(guān)，分析其原因可能是存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者腫瘤負(fù)荷往往較大，腫瘤組織可釋放更多的具有原癌基因作用的miRNA進(jìn)入血液，同時(shí)可抑制機(jī)體原有的具有抑癌作用的miRNA水平表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體miRNA表達(dá)水平異常升高；浸潤越深的患者病情進(jìn)展越快，腫瘤組織miRNA表達(dá)水平升高越明顯。Lao等[12]研究也證實(shí)，miRNA-155是宮頸癌病理過程的重要調(diào)節(jié)因子，miRNA-155上調(diào)可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖，miR-155下調(diào)可抑制宮頸癌細(xì)胞的生長。

圖3 miRNA-155與SCCA、CA125的相關(guān)性Fig. 3 Correlation of miRNA-155 and SCCA,CA125

應(yīng)用ROC曲線分析，結(jié)果顯示血漿miRNA-155對HPV陽性宮頸癌和CIN的診斷效能明顯優(yōu)于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)記物SCCA和CA125，其敏感度和特異度分別為87.2%和84.6%，81.3%和80.4%。相關(guān)性分析顯示，血漿miRNA-155與SCCA呈正相關(guān)。說明血漿miRNA-155在HPV陽性宮頸癌的早期診斷和CIN鑒別診斷方面具有一定的臨床價(jià)值。有研究表明，miRNA作為一種新的生物標(biāo)記物，可用于監(jiān)測宮頸癌的進(jìn)展和診斷HPV感染導(dǎo)致的宮頸癌[13]。Liu等[14]研究也表明，miRNA異常高表達(dá)與CIN分級和宮頸癌相關(guān)，是宮頸癌早期診斷和預(yù)后判斷的可靠生物學(xué)標(biāo)記物。本研究中，血漿miRNA-155和SCCA水平升高是HPV陽性宮頸癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而與年齡、病理類型、病理分級、腫瘤大小及絕經(jīng)狀態(tài)無關(guān)。提示miRNA-155可獨(dú)立作為宮頸癌早期診斷的分子標(biāo)記物。Chen等[15]研究認(rèn)為，miRNA的異常表達(dá)與宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、化療耐藥性以及整體生存情況明顯相關(guān)，它可以作為宮頸癌預(yù)后的重要評判指標(biāo)。Wang等[16]研究也發(fā)現(xiàn)，miR-155在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了一定的促進(jìn)作用，有望成為宮頸癌早期診斷的潛在標(biāo)記物。另有研究表明，血漿miR-155高表達(dá)對惡性腫瘤的總生存率有顯著影響，它可作為惡性腫瘤診斷和預(yù)后評估的一種新型腫瘤標(biāo)記物[17]。由此可見，血漿miR-155測定提供了一種無創(chuàng)的宮頸癌檢測/輔助診斷方法，在未來有較好的應(yīng)用前景。

綜上所述，血漿miRNA-155在HPV陽性宮頸癌患者中異常高表達(dá)，與SCCA和CA125傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)記物相比，其診斷HPV陽性宮頸癌的敏感度和特異度均較高，有望作為HPV陽性宮頸癌早期診斷和CIN鑒別診斷的生物學(xué)標(biāo)記物。但本研究為單中心的臨床研究，其結(jié)果可能存在一定的偏差，尚需多中心、大樣本的前瞻性研究來進(jìn)一步驗(yàn)證。

1 Suh DH， Kim JW， Kang S， et al. Major clinical research advances in gynecologic cancer in 2013［J］. J Gynecol Oncol， 2014， 25（3）：236-248.

2 Han JG， Jiang YD， Zhang CH， et al. A novel panel of serum miR-21/miR-155/miR-365 as a potential diagnostic biomarker for breast cancer［J］. Ann Surg Treat Res， 2017， 92（2）： 55-66.

3 Shikeeva AA， Kekeeva TV， Zavalishina LE， et al. Expression of microRNA let-7a， miR-155， and miR-205 in tumor and tumoradjacent histologically normal tissue in patients with non-small cell lung cancer［J］. Arkh Patol， 2016， 78（3）： 3-10.

4 Xia YF， Pei GH， Wang N， et al. miR-3156-3p is downregulated in HPV-positive cervical cancer and performs as a tumor-suppressive miRNA［J］. Virol J， 2017， 14（1）： 20.

5 Shi L， Zhang L， Wang C， et al. Expression of serum microRNA-378 and its clinical significance in renal cell carcinoma［J］. Genet Mol Biol， 2017， 40（2）： 525-529.

6 Zhao XL， Hu SY， Zhang Q， et al. High-risk human papillomavirus genotype distribution and attribution to cervical cancer and precancerous lesions in a rural Chinese population［J］. J Gynecol Oncol， 2017， 28（4）： e30.

7 Boro A， Bauer D， Born W， et al. Plasma levels of miRNA-155 as a powerful diagnostic marker for dedifferentiated liposarcoma［J］. Am J Cancer Res， 2016， 6（2）： 544-552.

8 Hou Y， Wang J， Wang X， et al. Appraising MicroRNA-155 as a Noninvasive Diagnostic Biomarker for Cancer Detection： A Meta-Analysis［J］. Medicine （Baltimore）， 2016， 95（2）： e2450.

9 Petrovic N， Kolakovic A， Stankovic A， et al. MiR-155 expression level changes might be associated with initial phases of breast cancer pathogenesis and lymph-node metastasis［J］. Cancer Biomark，2016， 16（3）： 385-394.

10 Gocze K， Gombos K， Juhasz K， et al. Unique microRNA expression profiles in cervical cancer［J］. Anticancer Res， 2013， 33（6）：2561-2567.

11 Fang H， Shuang D， Yi Z， et al. Up-regulated microRNA-155 expression is associated with poor prognosis in cervical cancer patients［J］. Biomed Pharmacother， 2016， 83 ： 64-69.

12 Lao G， Liu P， Wu Q， et al. Mir-155 promotes cervical cancer cell proliferation through suppression of its target gene LKB1［J］.Tumour Biol， 2014， 35（12）： 11933-11938.

13 Wang X， Wang HK， Li Y， et al. microRNAs are biomarkers of oncogenic human papillomavirus infections［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2014， 111（11）： 4262-4267.

14 Liu P， Xin F， Ma CF. Clinical significance of serum miR-196a in cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer［J］. Genet Mol Res， 2015， 14（4）： 17995-18002.

15 Chen J， Yao D， Li Y， et al. Serum microRNA expression levels can predict lymph node metastasis in patients with early-stage cervical squamous cell carcinoma［J］. Int J Mol Med， 2013， 32（3）： 557-567.

16 Wang X， Wang HK， McCoy JP， et al. Oncogenic HPV infection interrupts the expression of tumor-suppressive miR-34a through viral oncoprotein E6［J］. RNA， 2009， 15（4）： 637-647.

17 Lv ZC， Fan YS， Chen HB， et al. Investigation of microRNA-155 as a serum diagnostic and prognostic biomarker for colorectal cancer［J］.Tumour Biol， 2015， 36（3）： 1619-1625.