脂肪干細(xì)胞復(fù)合聚乳酸共聚物對大鼠骨折愈合后生物力學(xué)的影響

趙俊延 陳柳柳 黃志明 董杰 李松軍

【摘要】 目的 探討脂肪干細(xì)胞（ADSCs）復(fù)合聚乳酸共聚物（PLGA）對大鼠骨折愈合后生物力學(xué)的影響。方法 56只成功建模的健康雌性大鼠， 隨機分為對照組和實驗組， 各28只。實驗組大鼠左側(cè)股骨骨折肢作為ADSCs組（采用單純ADSCs治療）， 右側(cè)作為ADSCs/PLGA組（采用ADSCs/PLGA治療）。比較治療4、8周后各組大鼠患肢股骨近端生物力學(xué)參數(shù)變化。結(jié)果 治療4、8周后， ADSCs組與ADSCs/PLGA組大鼠患肢股骨剪切強度、最大應(yīng)力、最大載荷、彈性模量比對照組高， 剪切應(yīng)變比對照組低， 差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；ADSCs/PLGA組剪切強度、最大應(yīng)力、最大載荷、彈性模量比ADSCs組高， 剪切應(yīng)變比ADSCs組低， 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 ADSCs/PLGA能改善大鼠骨折愈合后的生物力學(xué)指標(biāo)， 可提高骨質(zhì)疏松骨折愈合力， 且效果優(yōu)于ADSCs。

【關(guān)鍵詞】 脂肪干細(xì)胞；聚乳酸共聚物；骨質(zhì)疏松骨折；生物力學(xué)

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.10.113

骨質(zhì)疏松骨折多發(fā)于老年群體[1]， 目前臨床治療多采用內(nèi)固定植入， 但由于該疾病大多屬于粉碎性骨折， 內(nèi)置物易松動、脫出， 臨床療效并不理想， 再骨折發(fā)生率高[2]。隨著組織工程學(xué)的不斷發(fā)展， 各類新材料的出現(xiàn)使骨質(zhì)疏松骨折的治療有了新的思路。PLGA是聚乙二醇酸（PGA）與聚乳酸（PLA）的共聚物， 是目前常用的支架材料， PLGA具有可塑性與生物降解性良好的優(yōu)點， 且能促進(jìn)骨組織的生長[3]；ADSCs在不同條件刺激下可分化成不同細(xì)胞， 恢復(fù)組織細(xì)胞的修復(fù)功能， 且易大量獲得。本次實驗對骨質(zhì)疏松骨折進(jìn)行實驗報告如下。

1 材料與方法

1. 1 實驗材料

1. 1. 1 實驗動物 選取60只成年健康雌性SD大鼠作為研究對象（經(jīng)篩查達(dá)到骨質(zhì)疏松標(biāo)準(zhǔn)）， 3～4月齡， 體質(zhì)量160～200 g；大鼠均飼養(yǎng)于室溫（20±3）℃下， 每日12 h光照， 自由飲水進(jìn)食的環(huán)境下成長。

1. 1. 2 實驗器材 胰蛋白酶、PLGA、胎牛血清、青霉素、骨密度儀、萬能力學(xué)測定機。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 ADSCs分離和培養(yǎng) 取大鼠3只， 頸椎脫臼處死后常規(guī)備皮， 消毒后取頸部、背部及下肢皮下脂肪， 注意分離可見筋膜和血管， 采用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗3次；采用眼科剪將脂肪組織剪成1 mm×1 mm×1 mm組織塊， 置于濃度為1.5 g/L的Ⅰ型膠原酶中， 在37℃環(huán)境下處理1 h；浸泡液通過100目篩過濾后進(jìn)行離心分離， 轉(zhuǎn)速為900 r/min， 時間持續(xù)10 min；含10%胎牛血清的應(yīng)用DMEM液重新懸浮、接種。培養(yǎng)過程中需每天進(jìn)行檢查， 移除呈檸檬色或呈紫色的渾濁培養(yǎng)液；待細(xì)胞達(dá)90%匯合時， 滴入2.5 g/L胰蛋白酶進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1. 2. 2 ADSCs/PLGA復(fù)合體的構(gòu)建 第3代ADSCs100%匯合后， 采用2.5 g/L胰蛋白酶進(jìn)行處理， 離心后以3×109/L的細(xì)胞濃度懸浮細(xì)胞；取細(xì)胞懸液100 μl， 接種于PLGA， 置于培養(yǎng)皿中， 滴入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液5 ml， 在37℃， 20 ml/L CO2培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h；通過胰蛋白酶消化后進(jìn)行洗滌、離心， 備用。

1. 2. 3 模型制作及分組干預(yù) 其余57只雌性大鼠行卵巢結(jié)扎摘除術(shù)， 常規(guī)喂養(yǎng)12周后進(jìn)行骨密度篩選， 并采用線鋸于大鼠雙側(cè)股骨粗隆下0.8 cm處造橫向骨折， 再通過注射器針頭將骨折斷口逆行引導(dǎo)， 最后應(yīng)用克氏針行髓內(nèi)固定， 制成骨折模型。本次研究成功造模56只大鼠， 隨機分為對照組和實驗組， 各28只。對照組大鼠不做任何處理；實驗組大鼠左側(cè)股骨骨折肢進(jìn)行單純ADSCs治療（ADSCs組）， 植入3×109/L的ADSCs懸液100 μl， 右側(cè)（ADSCs/PLGA組）采用ADSCs/PLGA共聚物注射在骨折周圍進(jìn)行治療。術(shù)后采用青霉素進(jìn)行抗感染治療， 正常喂養(yǎng)。治療4、8周后， 對照組和實驗組分別處死14只大鼠， 取出完整股骨， 測量生物力學(xué)參數(shù)變化。

1. 3 觀察指標(biāo) 通過三點彎曲實驗測量大鼠雙側(cè)股骨第

4周、第8周剪切強度、剪切應(yīng)變、最大應(yīng)力、最大載荷、彈性模量等生物力學(xué)參數(shù)變化（對照組取雙側(cè)均值）。

1. 4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

治療4、8周后， ADSCs組與ADSCs/PLGA組大鼠患肢股骨剪切強度、最大應(yīng)力、最大載荷、彈性模量高于對照組， 剪切應(yīng)變低于對照組， 差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；ADSCs/PLGA組剪切強度、最大應(yīng)力、最大載荷、彈性模量高于ADSCs組， 剪切應(yīng)變低于ADSCs組， 差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

3 討論

ADSCs主要從機體脂肪組織中提取得到， 是一種具有向多種組織分化潛能的干細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)[4-5]， ADSCs在不同因子刺激下可分化為軟骨、成骨、肌肉、神經(jīng)、脂肪等組織器官， 且ADSCs較易獲取， 一次取材即可得到較多數(shù)量的細(xì)胞， 因此可將ADSCs作為促骨生成的種子細(xì)胞。

高分子材料是生物支架材料的重要組成， 被廣泛引入骨折的臨床治療中。PLGA是近幾年興起的新型生物材料， 具有良好的生物降解性與相容性， 且無毒， 可塑性強， 廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域， 具有良好的效果。

本次實驗將ADSCs/PLGA共聚物復(fù)合體與ADSCs懸液植入骨質(zhì)疏松骨折大鼠模型， 同時選擇未經(jīng)任何處理的骨質(zhì)疏松骨折模型大鼠作為對照組， 結(jié)果顯示， 治療4周、8周后， ADSCs組與ADSCs/PLGA組大鼠患肢股骨剪切強度、最大應(yīng)力、最大載荷、彈性模量比高于對照組， 剪切應(yīng)變低于對照組， 差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；這說明單純ADSCs治療與采用ADSCs/PLGA共聚物復(fù)合體進(jìn)行治療均能促進(jìn)愈合， 原因考慮為ADSCs能幫助骨骼修復(fù)， 加快骨折愈合[6]。ADSCs/PLGA組剪切強度、最大應(yīng)力、最大載荷、彈性模量高于ADSCs組， 剪切應(yīng)變低于ADSCs組， 差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；這說明ADSCs/PLGA共聚物復(fù)合體能提高臨床效果與質(zhì)疏松骨折后骨質(zhì)愈合質(zhì)量， 原因考慮為ADSCs能幫助促進(jìn)新骨生成及血管生長， 而PLGA具有優(yōu)良的孔隙率及孔徑， 保證ADSCs的生長繁殖， 提高ADSCs效果， 加快骨折愈合[7-9]。

綜上所述， ADSCs/PLGA能改善大鼠骨折愈合后的生物力學(xué)指標(biāo)， 可提高骨質(zhì)疏松骨折愈合力， 且效果優(yōu)于ADSCs。但本次實驗僅證明ADSCs/PLGA共聚物復(fù)合體在動物實驗中具有良好效果， 實際臨床療效需應(yīng)用臨床后行進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳曉虹， 沈慧， 夏杰瓊， 等.中老年人骨質(zhì)疏松性骨折流行病學(xué)特點及相關(guān)因素.中國老年學(xué)雜志， 2016， 36（13）：3299-3301.

[2] 張偉濱.骨質(zhì)疏松性骨折的外科認(rèn)識.診斷學(xué)理論與實踐， 2012， 11（1）：11-14.

[3] 王丹， 姜航航.聚乳酸共聚物復(fù)合緩釋藥物的材料特征與實驗應(yīng)用.中國組織工程研究， 2013， 17（8）：1473-1480.

[4] 姜麗麗， 劉天慶， 宋克東， 等.脂肪干細(xì)胞生長特性研究.高?；瘜W(xué)工程學(xué)報， 2014， 28（2）：275-281.

[5] 楊世茂， 王明國， 李靜， 等.富血小板纖維蛋白與富血小板血漿體外釋放生長因子的比較及其對脂肪干細(xì)胞增殖分化的影響.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2012， 30（6）：641-644， 649.

[6] 陳猶白， 陳聰慧， 韓巖， 等.脂肪干細(xì)胞分離、純化和保存：研究進(jìn)展與未來方向.中國組織工程研究， 2016， 20（10）：1508- 1520.

[7] 崔巍巍， 高田林， 盧應(yīng)， 等.n-Ag/AD/PLGA功能性材料的制備及生物學(xué)性能.高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報， 2016， 37（1）：195-200.

[8] 唐宇星， 趙慶， 楊中萌， 等. 聚乳酸共聚物復(fù)合脂肪干細(xì)胞對骨質(zhì)疏松性骨折愈后生物力學(xué)的影響. 中國組織工程研究， 2017， 21（10）：1577-1582.

[9] 汪玉海， 金麗娟， 高俊， 等. 脂肪干細(xì)胞復(fù)合PLGA對骨質(zhì)疏松骨折愈合后生物力學(xué)的影響. 寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2013， 35（3）： 244-247.

[收稿日期：2018-12-19]