犬圓環(huán)病毒病研究進(jìn)展

孫文超，汪 偉,曹 亮，易馳喆，鄭 敏，劉立明，趙翠青，魯會(huì)軍*，金寧一,4*

(1.溫州大學(xué)病毒學(xué)研究所，浙江溫州 325035；2.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧 530001；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長(zhǎng)春 130122; 4.廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，廣西南寧 530004)

圓環(huán)病毒是單鏈環(huán)狀、無(wú)囊膜的病毒，基因組大小2 kb左右，病毒二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)。在2012年之前，已知的哺乳動(dòng)物圓環(huán)病毒只有豬圓環(huán)病毒1型(Porcine circovirus type 1，PCV1)和2型(Porcine circovirus type 1，PCV2)。PCV1在對(duì)豬幾乎完全沒(méi)有致病性，PCV2是豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病的主要病原體。PCV2感染容易造成免疫抑制性疾病，是危害全球養(yǎng)豬業(yè)最重要的病毒之一。PCV2感染主要引起肺炎、腸炎、淋巴結(jié)炎、腎炎、繁殖障礙疾病等。PCV2感染經(jīng)常與其他病毒或細(xì)菌混合感染加速或加劇疾病的發(fā)生或發(fā)展。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，尤其是高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)圓環(huán)病毒屬幾種新型圓環(huán)病毒，例如蝙蝠圓環(huán)病毒[1]、水貂圓環(huán)病毒[2]、狐貍圓環(huán)病毒[3]及豬圓環(huán)病毒3型[4]。2012年，美國(guó)首次從205份犬血清檢測(cè)到6株犬圓環(huán)病毒1型(Canine circovirus genotype 1，CaCV1)陽(yáng)性[5]。隨后，Li L等[6]研究認(rèn)為該病毒與犬出血性腹瀉或嚴(yán)重胃腸炎等疾病相關(guān)。然而，目前關(guān)于該病毒在臨床中確切的致病性尚不清楚。

為了避免混淆已經(jīng)用于其他病毒的簡(jiǎn)稱(chēng)，例如，金絲雀圓環(huán)病毒(Canary circovirus)或犬杯狀病毒(Canine calicivirus)，Li L等[6]提出用犬圓環(huán)病毒簡(jiǎn)稱(chēng)DogCV(Dog circovirus)。為了使環(huán)狀病毒屬所有成員的物種名稱(chēng)統(tǒng)一和相似，2015年國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)建議犬圓環(huán)病毒英文簡(jiǎn)寫(xiě)為CanineCV(https://talk.ictvonline.org/)。該病毒的發(fā)現(xiàn)給犬病的預(yù)防和治療帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)，世界上多個(gè)國(guó)家和地區(qū)開(kāi)始針對(duì)該病毒進(jìn)行流行病學(xué)和致病性的研究。

1 病原特征

CanineCV是一個(gè)無(wú)囊膜、環(huán)狀、單鏈DNA病毒，基因組大小約為2 kb，屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)。該屬還包括豬圓環(huán)病毒1型、豬圓環(huán)病毒2型、鴨圓環(huán)病毒、鵝圓環(huán)病毒、金絲雀圓環(huán)病毒、禽白血病病毒、蝙蝠圓環(huán)病毒、狐貍圓環(huán)病毒等成員。

目前，北美洲的美國(guó)、歐洲的德國(guó)、意大利、中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)及中國(guó)廣西地區(qū)均檢測(cè)到CanineCV的存在，說(shuō)明該病毒已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛傳播。根據(jù)目前已知核苷酸序列比較，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)、不同毒株間有所差異。CanineCV 基因組大小為2 063 bp或者2 064 bp，利用在線ORF finder軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)發(fā)現(xiàn)美國(guó)NY214株存在多達(dá)12個(gè)ORFs，中國(guó)JZ98/2014株存在10個(gè)ORFs。閱讀框之間存在部分重疊的現(xiàn)象，且大小相差很大。其中有2個(gè)主要的閱讀框，即ORF1和ORF2，相比較而言，ORF2 變異程度較大，而ORF1更保守一些。ORF1有912個(gè)堿基編碼303 aa的病毒復(fù)制酶(Rep蛋白)，與病毒復(fù)制有關(guān)。ORF2有813個(gè)堿基編碼270 aa的病毒衣殼蛋白(Cap蛋白)。利用生物信息學(xué)分析Cap蛋白密碼子發(fā)現(xiàn)，Cap蛋白N端存在一段精氨酸富集的強(qiáng)堿性氨基酸區(qū)域(RVRRHARASRRRYRTRPLIRYRRRRQ)，大小為26個(gè)氨基酸，該區(qū)段的序列特征與PCV2、GoCV等圓環(huán)病毒的核定位信號(hào)(Nuclear localization signal,NLS)序列相似。該核定位信號(hào)是影響圓環(huán)病毒原核表達(dá)的重要因素。CanineCV基因組中同時(shí)包含圓環(huán)病毒屬高度保守的基序WWDGY、DDFYGW和DRYP；滾環(huán)復(fù)制特征的保守基序FTINN、TPHLQG和CSK；與dNTP結(jié)合的基序GCGKS。ORF1和ORF2這2個(gè)基因之間也有2個(gè)間隔區(qū)域，大小分別為135 nt(1 929-2 063 nt)和203 nt(913-1 115 nt)。CanineCV DNA復(fù)制起始區(qū)(ori)位于間隔區(qū)1 929-2 063 nt，ori呈莖-環(huán)樣結(jié)構(gòu)，CanineCV莖-環(huán)包含10個(gè)核苷酸(CATAGTATTA)，該核苷酸基序是滾環(huán)復(fù)制的剪切位點(diǎn)，與其他圓環(huán)病毒、雙粒病毒、微病毒基因組類(lèi)似。同時(shí)在環(huán)的兩側(cè)存在重復(fù)序列，形成回文結(jié)構(gòu)。

目前,尚無(wú)成功分離到該病毒的報(bào)道，因此對(duì)于該病毒的病毒粒子大小、浮密度、沉降系數(shù)和酸堿耐受性等理化性質(zhì)不是很清楚。Decaro N等[7]嘗試將CanineCV陽(yáng)性組織樣品接種到細(xì)胞系如犬纖維瘤細(xì)胞系(A-72)、犬腎細(xì)胞系(MDCK)、非洲綠猴腎細(xì)胞系(Vero)、Walter Reed細(xì)胞系(WRCC)等，并且在接種方法上做了多種嘗試，如添加300 mmol/L葡糖胺、新鮮胰蛋白酶處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)病毒在第4～5代消失，沒(méi)有分離到該病毒。

2 流行病學(xué)

犬是本病的主要自然宿主，目前研究發(fā)現(xiàn)，狼和獾等食肉動(dòng)物也可以感染該病毒。各種年齡、不同性別的犬都可以感染 CanineCV。Decaro Nicola等研究發(fā)現(xiàn)，幼齡犬感染率要比成年犬感染率高。Dowgier G等[8]研究證實(shí)，CanineCV感染發(fā)病率與隨著年齡增加顯著降低，認(rèn)為這可能是由于先前感染誘導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)逐漸清除感染因子造成的。

2013年Li L等[6]利用real-time PCR檢測(cè)犬的腹瀉糞便樣品,結(jié)果健康犬CanineCV陽(yáng)性率11.3%(14/204)，腹瀉犬該病毒陽(yáng)性率為6.9%(19/168)，血小板減少癥和中性白細(xì)胞減少癥、未知來(lái)源的發(fā)熱或蜱蟲(chóng)叮咬犬該病毒陽(yáng)性率為3.3%(19/409)。但通過(guò)PCR確定為其他病原體(犬隱孢子蟲(chóng)、賈第鞭毛蟲(chóng)屬、沙門(mén)菌)感染犬，CanineCV陽(yáng)性率為68%(13/19)。腹瀉犬中大多數(shù)的CanineCV陽(yáng)性者感染超過(guò)一種病原體。

Hsu H S等[9]對(duì)2012年-2014年的207例腹瀉犬和160例健康犬進(jìn)行腹瀉與CanineCV感染之間的關(guān)系的研究結(jié)果，腹瀉犬感染率為28.0 % (58/207)，健康犬感染率為11.9 %(19/160)。58例CanineCV陽(yáng)性犬中25例為小于1歲的幼犬，25例為1歲～7歲的犬，8例7歲以上犬。CanineCV感染年齡跨度從2個(gè)月至13歲(中位數(shù)為1歲)。健康組9例CanineCV陽(yáng)性犬，3例(15.8%)不到1歲，8例(42.1%)在1歲～7歲之間，8例(42.1%)超過(guò)7歲，年齡跨度為3個(gè)月～18歲(中位數(shù)是5歲)。通過(guò)比較腹瀉犬感染CanineCV與健康犬感染CanineCV之間年齡，發(fā)現(xiàn)CanineCV更常見(jiàn)于年齡較小的腹瀉犬。

Anderson A等[10]對(duì)德國(guó)2006年和2014年間收集的犬樣本評(píng)估CanineCV與急性出血性腹瀉綜合征(Acute haemorrhagic diarrhoea syndrome，AHDS)的相關(guān)性，分別對(duì)AHDS犬(55例)、健康犬(66例)和感染犬細(xì)小病毒(CPV)犬(54例)糞便樣品通過(guò)靶向復(fù)制酶和衣殼基因的2個(gè)實(shí)時(shí)TaqMan PCR測(cè)定來(lái)檢查CanineCV，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3組間無(wú)顯著性差異。CPV陽(yáng)性犬混合感染CanineCV病死率明顯高于CanineCV陰性犬，但從恢復(fù)時(shí)間比較二者之間沒(méi)有顯著性差異。因此，研究認(rèn)為CanineCV似乎不是犬AHDS的主要致病因子，但該病毒可能在CPV感染過(guò)程中扮演著輔助因子的作用。

2016年Zaccaria G等[11]對(duì)意大利中南部地區(qū)389份家犬、狼、狐貍和獾等野生動(dòng)物調(diào)查CanineCV感染情況，發(fā)現(xiàn)狼的陽(yáng)性率為0.46%(9/34)，犬的陽(yáng)性率為3.8%(8/209)，狐貍的陽(yáng)性率為0，獾的陽(yáng)性率為10%(1/10)。所有陽(yáng)性動(dòng)物顯示至少感染另外一種重要病原體，包括犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)和犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)，說(shuō)明該病毒可以感染其他犬科動(dòng)物。

Gentil M等[12]對(duì)來(lái)自184例腹瀉犬和82例臨床健康犬(對(duì)照組)的糞便樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，腹瀉犬CanineCV陽(yáng)性率為20.1%(37/184)，健康對(duì)照組為7.3%(6/82)。同時(shí)在50%的CanineCV陽(yáng)性犬中，診斷出其他腸道病原體的感染。

Thaiwong T等[13]通過(guò)對(duì)糞便和血清學(xué)跟蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病毒在犬身上帶毒超過(guò)1年，推測(cè)傳播模式可能與PCV2一致，病毒在血清以及鼻中大量存在，糞便排泄后自然感染犬群。目前，尚未有該病毒通過(guò)胎盤(pán)垂直傳播的病例報(bào)道。大量試驗(yàn)證實(shí)，PCV2感染最常與其他豬病原體混合感染導(dǎo)致臨床疾病發(fā)生。PCV2常與其他病毒例如豬細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、細(xì)菌感染等繼發(fā)或者混合感染。研究發(fā)現(xiàn)CanineCV常與一些常見(jiàn)、重要的病原體如犬瘟熱病毒(CDV)和犬細(xì)小病毒類(lèi)2型(CPV2)發(fā)生混合感染。這一點(diǎn)二者非常相似，也為下一步研究其傳播途徑提供了便利。

Dowgier G等調(diào)查2013年-2016年期間CanineCV與犬腸胃炎的關(guān)系，對(duì)照組CanineCV陽(yáng)性率為28.35%，臨床病例組感染率為32.42%，二者差異不顯著。臨床病例組混合感染較多，CPV2和CanineCV的混合感染率為18.72% (41/219)，與單感染CanineCV相比較差異顯著。

2016年，鄭敏等[15]對(duì)廣西崇左市有20份犬血清進(jìn)行CanineCV陽(yáng)性率調(diào)查，成功檢測(cè)到1份陽(yáng)性樣品，并完成病毒全基因組序列的測(cè)定，隨后對(duì)廣西5個(gè)地市犬血清分子流行病研究發(fā)現(xiàn)CanineCV感染率在0～30%不等，也證實(shí)了大陸地區(qū)存在該病毒的流行和傳播。

3 致病機(jī)制

CanineCV在犬腹瀉及犬急性胃腸炎中的確切作用還不明確。2013年，Li L在研究CanineCV過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，病犬出現(xiàn)壞死性血管炎的病理組織學(xué)病變、整個(gè)胃腸道出血及腸系膜淋巴結(jié)呈肉芽腫性淋巴結(jié)炎。腸系膜淋巴結(jié)的分析顯示，髓質(zhì)竇內(nèi)的多個(gè)巨噬細(xì)胞含有空泡、橢圓形、可易染色的細(xì)胞質(zhì)體。

Thaiwong T等[13]報(bào)告一個(gè)CPV2和CanineCV混合感染的犬群，同時(shí)通過(guò)PCR證實(shí)，并利用ICH/ISH證實(shí)病灶內(nèi)存在抗原/核酸。嚴(yán)重的CPV2感染特征是小腸壞死的隱窩內(nèi)含有大量的CPV2抗原，導(dǎo)致犬嘔吐和出血性腹瀉。雖然CPV2也感染淋巴細(xì)胞并引起淋巴細(xì)胞溶解，但只在淋巴組織和樹(shù)突細(xì)胞中檢測(cè)到少量的CPV2抗原，而不是壞死區(qū)域、肉芽腫炎癥的病灶。而在淋巴壞死區(qū)域內(nèi)和肉芽腫炎癥灶內(nèi)的上皮樣巨噬細(xì)胞內(nèi)存在大量的CanineCV，這一點(diǎn)支持CanineCV是引起這些部位病變的假說(shuō)，該現(xiàn)象與豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVAD)類(lèi)似。這個(gè)發(fā)現(xiàn)的臨床意義在于證實(shí)CanineCV可以簡(jiǎn)單地在淋巴復(fù)制。

CanineCV與CPV2感染機(jī)制是否與PCV2和豬細(xì)小病毒的混合感染類(lèi)似還不得而知。圓環(huán)病毒和細(xì)小病毒感染是一種常見(jiàn)的混合感染模式，非特異性免疫刺激足以引起豬嚴(yán)重的圓環(huán)病毒病。他們推測(cè)CPV2感染導(dǎo)致隱窩上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞壞死，隨后導(dǎo)致再生上皮細(xì)胞和淋巴母細(xì)胞的增殖，為CanineCV復(fù)制提供必要的靶細(xì)胞，最終導(dǎo)致更嚴(yán)重的臨床疾病。

Anderson A等[10]認(rèn)為，雖然Li L等報(bào)道在血管炎和出血性腸炎的犬腸道檢測(cè)到CanineCV DNA，但是在健康犬中同樣檢測(cè)到，健康犬CanineCV感染率為4.6%。因此，CanineCV有可能是非致病性的腸道微生物被偶然發(fā)現(xiàn)的。這一點(diǎn)與PCV1在無(wú)癥狀的豬體檢測(cè)到類(lèi)似[14]。目前，大家普遍接受PCV1感染豬是沒(méi)有致病性的。在犬腹瀉的糞便中檢測(cè)到CanineCV DNA并不一定意味著這種病毒具有致病性。臨床中CanineCV與CPV2經(jīng)常發(fā)生混合感染，CanineCV有可能長(zhǎng)時(shí)間無(wú)害化停留在胃腸道，胃腸道病毒易位可能增強(qiáng)對(duì)黏膜損害。CanineCV可能會(huì)影響腸黏膜屏障增加犬的死亡率，特別是感染CPV2的犬。

4 分子生物學(xué)診斷技術(shù)

4.1 原位雜交技術(shù)

原位雜交技術(shù)(in situ hybridization,ISH)是應(yīng)用已知堿基序列并帶有標(biāo)志物的核酸探針與組織、細(xì)胞中待檢測(cè)的核酸按堿基配對(duì)的原則進(jìn)行特異性結(jié)合而形成雜交體,然后再應(yīng)用與標(biāo)志物相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng),通過(guò)組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法在被檢測(cè)的核酸原位形成帶顏色的雜交信號(hào),在顯微鏡或電子顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。Li L等[6]利用ISH寡聚探針檢測(cè)21例懷疑CanineCV陽(yáng)性犬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有4例陽(yáng)性，對(duì)照組犬的所有其他組織樣品ISH分析均為陰性。ISH可用于檢查CanineCV在病犬的臟器分布。Thaiwong T等[13]建立針對(duì)復(fù)制酶基因序列寡核苷酸探針對(duì)組織器官進(jìn)行了檢測(cè)驗(yàn)證，在犬的淋巴組織中檢測(cè)到大量CanineCV核酸。

4.2 熒光定量PCR方法

Li L等[6]分別建立了針對(duì)Replicate 基因和Capsid基因的熒光定量探針?lè)ǎ琋icola D等重復(fù)Replicate 基因的熒光定量探針?lè)?yàn)證該方法的可行性，發(fā)現(xiàn)死亡犬的肝臟和腸道周期閾值(CT)分別為26.4和24.3。Hsu H S等[9]根據(jù) CanineCV NY21株基因序列設(shè)計(jì)SYBR Green 熒光定量檢測(cè)方法，CanineCV檢測(cè)陽(yáng)性率為35.7 % (74/207)。孫文超等[16]根據(jù)JZ98/2014的基因序列,建立犬圓環(huán)病毒SYBR Green Ⅰ real-time PCR檢測(cè)方法，該方法檢測(cè)靈敏度可達(dá)4.67×101copies/μL。

4.3 PCR方法

PCR方法是檢測(cè)病毒和細(xì)菌的常用方法。該方法具有快速、簡(jiǎn)便、特異強(qiáng)等特點(diǎn)。Gentil M等根據(jù) CanineCV的基因序列設(shè)計(jì)出特異的PCR引物進(jìn)行病毒檢測(cè),建立了特異的 PCR方法，檢測(cè)結(jié)果表明腹瀉犬組中，CanineCV的陽(yáng)性率為20.1%(37/184)，健康對(duì)照組為7.3%(6/82)。

5 展望

關(guān)于CanineCV與腹瀉相關(guān)研究只局限于臨床研究，而對(duì)該病原的分子致病機(jī)制及與其他病原之間的協(xié)同致病機(jī)制等認(rèn)識(shí)非常有限。因此，未來(lái)需要解決以下幾個(gè)方面的問(wèn)題：首先，病毒的分離及其細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立，目前還沒(méi)有適合的細(xì)胞系或者成功的病毒培養(yǎng)方法。其次，利用常規(guī)的病毒學(xué)手段難以解決上述問(wèn)題，反向遺傳技術(shù)將是最重要的手段之一，PCV2反向遺傳操作的成功可以提供很好的參照。第三，病原與宿主的相互作用，闡明CanineCV的致病機(jī)制是與致病性PCV2類(lèi)似，還是與無(wú)致病性的PCV1類(lèi)似。第四，需要闡明CanineCV與其他腹瀉相關(guān)病原，如CPV2、CDV混合感染是否會(huì)加重疾病的發(fā)生。盡管?chē)?guó)內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室對(duì)CanineCV進(jìn)行大量的研究，但病毒對(duì)動(dòng)物免疫系統(tǒng)影響、致病機(jī)制等方面仍缺乏全面而系統(tǒng)的了解，相關(guān)的研究工作有待進(jìn)一步深入。

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