苦丁茶多酚提取物對四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝損傷的改善作用及機制研究

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(1.重慶第二師范學(xué)院,重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心,重慶市功能性食品工程技術(shù)研究中心,功能性食品研發(fā)重慶市工程實驗室,生物與化學(xué)工程學(xué)院,重慶 400067;2.桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院食品衛(wèi)生與營養(yǎng)學(xué)教研室,廣西高校預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室,廣西桂林 541004)

肝臟是機體的重要器官,擔(dān)負(fù)營養(yǎng)和藥物新陳代謝的功能,能夠清除體內(nèi)的毒素和細(xì)菌,具有很強的再生和修復(fù)能力[1]。物理和化學(xué)因素都可能導(dǎo)致肝損傷,進(jìn)而影響肝臟的解毒功能,引起肝功能障礙,引發(fā)其他多器官功能失調(diào),甚至導(dǎo)致肝衰竭,威脅生命[1-3]。

苦丁茶是一種特殊的類茶飲品,是由冬青科冬青屬的苦丁茶種常綠喬木樹葉制成[4]。作為一種天然飲品,苦丁茶在中國西南地區(qū)和華南地區(qū)比較普遍,常用來清熱消暑、生津止渴和潤喉止咳[5]。研究證實苦丁茶具有抑制氧化應(yīng)激、預(yù)防炎癥和癌癥等活性功能[6-7],這與其含有的多酚類組分密切相關(guān)[8-9]?？喽〔瓒喾宇惢衔镏饕蔷G原酸及其衍生物[10]。有研究表明苦丁茶提取物對肝損傷有較好的抑制作用[11],所以其抗肝損傷成為研究熱點，但其在作用機制需要進(jìn)一步的研究;同時,由于苦丁茶多酚物質(zhì)的成分與綠茶多酚有所不同,綠茶多酚物質(zhì)發(fā)揮生物活性作用的機制已有一定研究[11-12]，但苦丁茶多酚物質(zhì)的相關(guān)研究還是不足。因此,本研究將針對苦丁茶多酚對四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝損傷進(jìn)行研究,并對作用機制進(jìn)行分析,研究結(jié)果將對苦丁茶多酚的深入應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

野生苦丁茶安國市祁珍養(yǎng)生食品有限公司;綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品上海源葉生物科技有限公司;水飛薊素美國Sigma公司;天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測定試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測定試劑盒、堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒、甘油三酯(TG)測定試劑盒、總膽固醇(TC)測定試劑盒、尿素氮(BUN)測定試劑盒、白蛋白(ALB)測定試劑盒、總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、一氧化氮(NO)測定試劑盒、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒南京建成生物工程研究所;IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ酶聯(lián)免疫試劑盒美國Biolegend公司;CycleTESTTM PLUS DNA染色試劑盒德國Becton Dickinson公司;Trizol試劑、oligodT18、RNase、dNTP、MLV和PCR引物美國Invitrogen公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純;清潔級昆明小鼠60只(6周齡、雌雄各半),購于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,動物許可證SCXK(渝)2012-0001,在溫度(22±4) ℃、濕度50%±20%下飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。

Biomate3S型紫外可見光分光光度儀、SimpliAmp梯度PCR儀、LUX多功能性酶標(biāo)儀美國Thermo Fisher Scientific公司;ICEN-24R高速冷凍離心機杭州奧盛儀器有限公司;BX43生物顯微鏡日本奧林巴斯公司。

1.2　實驗方法

1.2.1苦丁茶多酚的提取純化取1 kg苦丁茶粉碎后加入9 L的純水,在90 ℃下水浴提取30 min后收集提取液,然后重復(fù)1次,收集2次的提取液后將提取液過大孔樹脂HP20,經(jīng)過大孔樹脂吸附后,在2 mL/min速度下以70%的乙醇洗脫,得到苦丁茶多酚提取物(PEK)[13]。

1.2.2苦丁茶多酚的含量測定稱取一定量綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品,加入去離子水配制成綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液,然后吸取1.0 mL不同濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液于25 mL的容量瓶中,再加入3.0 mL的Folin-Ciocalteu試劑沖劃分混合,待反應(yīng)5 min后在容量瓶總加入4.5 mL的飽和Na2CO3溶液,加水定容后在30 ℃下避光反應(yīng)30 min,最后在747 nm處測定吸光度值,繪制綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。將PEK進(jìn)行梯度稀釋至10-4倍,按上述方法測定PEK的吸光度值,對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算PEK的多酚物質(zhì)含量。

1.2.3動物實驗將小鼠平均分為5組,每組12只小鼠,雌雄各半,分別為正常組、模型組、水飛薊素灌胃組(陽性對照組)、PEK低劑量(50 mg/kg·bw)和高劑量灌胃組(100 mg/kg·bw)。正常組和模型組小鼠每天灌胃2 mL的生理鹽水;水飛薊素灌胃組每天灌胃0.2 mL水飛薊素溶液(100 mg/kg·bw);PEK低、高濃度組小鼠每天分別按濃度50和100 mg/kg·bw灌胃PEK溶液0.2 mL,實驗持續(xù)28 d。第28 d對除正常組外所有小鼠腹腔注射四氯化碳誘導(dǎo)劑(2 mL/kg·bw,CCl4∶橄欖油=1∶1,v/v)誘導(dǎo)急性肝損傷,然后對所有小鼠實施禁食,但允許自由飲水。禁食24 h后斷頸處死小鼠,解剖后心臟取血并取肝臟組織[15]。

1.2.4小鼠肝指數(shù)測定稱量小鼠的體質(zhì)量和肝質(zhì)量,按公式肝指數(shù)(%)=肝臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100。

1.2.5小鼠血清水平測定將小鼠血漿在4000 r/min離心10 min后分離血清,使用AST、ALT、ALP、TG、TC、BUN、ALB、SOD、NO、CAT、MDA和GSH-Px試劑盒測定小鼠血清相關(guān)生化指標(biāo)的水平[15],每只小鼠的以上指標(biāo)重復(fù)測定3次。

1.2.6小鼠血清細(xì)胞因子水平測定采用IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ細(xì)胞因子測定試劑盒檢測1.2.3中所制備小鼠血清中細(xì)胞因子水平[15],每只小鼠的以上指標(biāo)重復(fù)測定3次。

1.2.7肝組織病理學(xué)觀察取肝組織切塊,用10%的福爾馬林溶液固定,并用濃度為95%(v/v)的乙醇脫水,然后用二甲苯置換出肝組織內(nèi)的乙醇,采用石蠟包埋后冷卻切片,采用HE染色法對切片進(jìn)行染色,并在光學(xué)顯微鏡下觀察[16]。

研究對象來源于我院收治的85例腦卒中后焦慮抑郁患者,選取時間為2016年1月-2017年6月。其分組資料整理如下:對照組男女比例為27:15,平均年齡(55.3±6.7)歲。觀察組男女比例為28:15,平均年齡(55.6±6.2)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):所有患者經(jīng)腦卒中診斷和抑郁評分確診為腦卒中后抑郁[2];簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):卒中前存在精神心理疾病、中途退出、護(hù)理依從性差者。上述組間數(shù)據(jù)對比均保持同質(zhì)性(P>0.05)。

表1　引物序列Table 1　Sequences of reverse transcription polymerase chain reaction primers used in this study

1.2.8RT-PCR實驗測定小鼠肝組織mRNA表達(dá)取小鼠的肝組織勻漿后用RNAzol提取肝組織的總RNA,然后將肝組織的總RNA濃度稀釋到1 μg/μL。取稀釋定量后的總RNA提取液2 μL,在其中依次加入1 μL的oligodT18、1 μL的RNase、1 μL的dNTP、1 μL的MLV酶和10 μL的5×buffer,在條件37 ℃、120 min,99 ℃、4 min,4 ℃、3 min合成cDNA。然后以反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增Mn-SOD、Gu/Zn-SOD、CAT、GSH-Px、NF-κB-p65、IκB-α、iNOS和COX-2的mRNA表達(dá)(見表1),同時以持家基因GAPDH作為內(nèi)參照按同樣條件進(jìn)行擴(kuò)增。最后用含1%溴化乙錠瓊脂電泳檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物[17]。半定量分析按以下公式計算:表達(dá)相對模型組倍數(shù)=(樣品組表達(dá)強度÷對應(yīng)組GAPDH表達(dá)強度)÷(模型組表達(dá)強度÷模型組GAPDH表達(dá)強度)。其中樣品組指正常組，PEK低劑量組、PEK高劑量組和水飛薊素灌胃組。

1.3　數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用SAS 9.1統(tǒng)計學(xué)軟件對平行實驗結(jié)果進(jìn)行one-way ANOVA方法分析,判斷各組數(shù)據(jù)在p<0.05水平上是否具有顯著性差異。

2　結(jié)果與分析

2.1　苦丁茶多酚提取物的含量

按照1.2.2節(jié)方法繪制綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.215X-0.002(R2=0.998),Y為綠原酸濃度,X為吸光度值。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算可知提取純化后的苦丁茶多酚(綠原酸計)的含量達(dá)到71.3%。

表2　各組小鼠的肝指數(shù)Table 2　Liver index of mice in different groups

注：字母不同表示組間存在顯著差異(p<0.05),表3～表7同。

2.2　苦丁茶多酚提取物對小鼠肝指數(shù)的影響

肝臟是機體的重要器官,肝臟出現(xiàn)損傷后,將出現(xiàn)肝指數(shù)提高的現(xiàn)象,四氯化碳作為實驗性肝損傷誘導(dǎo)劑,可使動物的肝指數(shù)增大,通過計算肝指數(shù)可以快速判斷肝損傷程度[18]。如表2所示,模型組小鼠的肝指數(shù)顯著高于其他各組(p<0.05),水飛薊素灌胃組小鼠的肝指數(shù)顯著低于模型組,隨著PEK濃度的提高,PEK灌胃組小鼠的肝指數(shù)顯著下降(p<0.05)。

2.3　苦丁茶多酚提取物對小鼠血清生化指標(biāo)的影響

AST和ALT是重要的轉(zhuǎn)氨酶,常作為肝功能檢查的指標(biāo),用來判斷肝臟是否受到損害,主要存在于肝細(xì)胞漿內(nèi),是一種重要的轉(zhuǎn)氨酶,肝細(xì)胞壞死會導(dǎo)致ALT和AST在血清內(nèi)增加[19]。四氯化碳可導(dǎo)致肝組織發(fā)生嚴(yán)重的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),造成干細(xì)胞壞死和組織纖維化,此過程中肝組織的ALP水平急劇上升[20]。四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷能使脂肪酸向肝組織內(nèi)轉(zhuǎn)移,造成肝組織的TG含量的上升,同時TC也是肝損傷造成脂質(zhì)過氧化的表現(xiàn),肝損傷發(fā)生后由于脂質(zhì)過氧化TG和TC含量均增加[21]。肝損傷后也進(jìn)一步對腎功能造成影響,使蛋白質(zhì)代謝的產(chǎn)物BUN在機體中的含量升高,同樣由于肝損傷對機體合成、運輸和釋放ALB的影響,機體的ALB含量也下降[22]。

由表3可知,與正常組相比,四氯化碳處理組小鼠血清中AST、ALT、ALP、TG、TC、BUN水平顯著升高(p<0.05),而ALB水平顯著降低(p<0.05),表明四氯化碳對小鼠肝組織造成了損傷,造模成功。PEK灌胃可以顯著緩解四氯化碳造成的AST、ALT、ALP、TG、TC、BUN水平升高和ALB水平降低(p<0.05),且高濃度的PEK效果更為明顯,其中高濃度的PEK灌胃可以使BUN和ALB水平與藥物水飛薊素灌胃達(dá)到相似的效果。

表3　各組小鼠血清AST、ALT、ALP、TG、TC、BUN和ALB的水平Table 3　AST,ALT,ALP,TG,TC,BUN and ALB serum levels of mice in different groups

表4　各組小鼠血清SOD、NO、CAT、MDA和GSH-Px的水平Table 4　SOD,NO,CAT,MDA and GSH-Px serum levels of mice in different groups

表5　各組小鼠血清IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ細(xì)胞因子水平的影響Table 5　IL-6,IL-12,TNF-α and IFN-γ serum cytokine levels of mice in different groups

2.4　苦丁茶多酚提取物對小鼠血清SOD、NO、CAT、MDA和GSH-Px水平的影響

四氯化碳在肝臟將引起強烈的氧化反應(yīng),提高動物體內(nèi)SOD、CAT和GSH-Px的活力是通過酶性抗氧化達(dá)到抗氧化作用的主要機制[21]。SOD、CAT和GSH-Px是機體內(nèi)重要的抗氧化酶,而且CAT和SOD具有協(xié)同作用,可增強抗氧化效果[23-24]。GSH-Px也是一種與機體氧化線管的酶,可催化過氧化氫分解,起到保護(hù)細(xì)胞膜,避免細(xì)胞損傷的作用[25]。MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,肝損傷后MDA也在肝組織內(nèi)大量積累[21]。一氧化氮及其氧化產(chǎn)物能使細(xì)胞表面的磷脂和蛋白發(fā)生損傷,導(dǎo)致機體組織出現(xiàn)炎性滲出和組織損傷[26]。另外,一氧化氮還能使氧化應(yīng)激反應(yīng)加強,導(dǎo)致細(xì)胞毒性進(jìn)一步加劇從而使肝損傷加重[27]。

由表4可知,正常組小鼠血清中的SOD、CAT、GSH-Px活力最高,而NO、MDA含量最低;而模型組小鼠的SOD、CAT、GSH-Px活力最低,NO、MDA含量最高,表明肝損傷可顯著導(dǎo)致SOD、CAT、GSH-Px活力降低和導(dǎo)致NO、MDA含量升高。PEK可使肝損傷小鼠血清中的SOD、NO、CAT、MDA和GSH-Px水平接近于藥物水飛薊素的效果,且PEK高劑量灌胃使血清中的SOD、CAT、MDA和GSH-Px水平與水飛薊素灌胃組小鼠無顯著差異(p>0.05)。由此可以看出,PEK可以提高肝損傷小鼠血清的抗氧化酶活力,起到改善肝損傷的作用。

2.5　苦丁茶多酚提取物對小鼠血清細(xì)胞因子水平的影響

IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ是重要的細(xì)胞炎癥因子,機體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)后其含量在體內(nèi)大幅度上升[23]。IL-6是一種參與機體免疫應(yīng)答的因子,IL-6的含量升高時可引發(fā)內(nèi)臟發(fā)生功能性損害[28]。同時IL-6還能使T淋巴細(xì)胞發(fā)生分化、增殖和提升抗體含量,從而加劇機體炎癥反應(yīng)[29]。IL-12也是一種在體細(xì)胞過度凋亡或過強的免疫應(yīng)答情況下大量體現(xiàn)的因子,在肝損傷出現(xiàn)時作用十分強烈[30]。TNF-α能導(dǎo)致干細(xì)胞大量凋亡;同時,TNF-α可以激活NF-κB信號通路從而增強機炎癥反應(yīng),和肝損傷[31]。IFN-γ是前炎癥的細(xì)胞因子,能夠加強肝細(xì)胞對TNF-α的敏感性,使肝細(xì)胞更容易受損[32]。四氯化碳能夠通過加劇肝組織的氧化反應(yīng),使肝臟發(fā)生強烈的炎癥反應(yīng),使動物體內(nèi)的IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ含量上升[15]。

由表5可知,與正常組小鼠相比,模型組小鼠血清中IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ細(xì)胞因子水均顯著升高(p<0.05),說明四氯化碳造模肝損傷后小鼠肝臟出現(xiàn)炎癥,使小鼠體內(nèi)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。與模型組小鼠相比,PEK低劑量組、PEK高劑量組和水飛薊素灌胃組均能顯著降低以上細(xì)胞因子水平?？梢?PEK能夠降低小鼠血清中IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ細(xì)胞因子水平,達(dá)到降低小鼠體內(nèi)炎癥水平的目的,從而通過減輕炎癥反應(yīng)實現(xiàn)減輕肝損傷的作用。

2.6　苦丁茶多酚提取物對小鼠肝組織病理學(xué)變化的影響

如圖1所示,正常組小鼠肝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀分布;模型組小鼠肝組織細(xì)胞排列不均,中央靜脈呈現(xiàn)不規(guī)則,細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞,出現(xiàn)大量細(xì)胞壞死。PEK和水飛薊素均能夠減輕四氯化碳對肝細(xì)胞造成的壞死以及肝組織形態(tài)不完整,其中高濃度的PEK效果更為明顯,接近藥物水飛薊素。

圖1　各組小鼠肝組織的病理學(xué)變化(200×)Fig.1　Pathological observation of liver of mice in different group(200×)

表6　各組小鼠肝組織中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD、CAT和GSH-Px mRNA表達(dá)的半定量分析Table 6　Semi-quantitative analysis of Mn-SOD,Gu/Zn-SOD,CAT and GSH-Px mRNA expressions in liver of mice in different groups

2.7　苦丁茶多酚提取物對小鼠肝組織中抗氧化酶mRNA表達(dá)的影響

由圖2和表6可知,正常組小鼠肝組織中的Mn-SOD、Gu/Zn-SOD、CAT和GSH-Px表達(dá)水平高于其他各組小鼠(p<0.05)。四氯化碳(模型組)導(dǎo)致小鼠肝組織中的Mn-SOD、Gu/Zn-SOD、CAT和GSH-Px表達(dá)強度下降,PEK可以顯著緩解表達(dá)下降(p<0.05),且高濃度的PEK效果更為明顯,作用效果接近于水飛薊素。

圖2　各組小鼠肝組織中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD、CAT和GSH-Px的mRNA表達(dá)Fig.2　Mn-SOD,Gu/Zn-SOD,CAT and GSH-Px mRNA expressions in liver of mice in different group

2.8　苦丁茶多酚提取物對小鼠肝組織中COX-2、IL-1β和TNF-α mRNA表達(dá)的影響

COX-2是機體內(nèi)重要的炎癥因子,機體組織出現(xiàn)炎癥后大量表達(dá),是炎癥的標(biāo)志性產(chǎn)物,肝損傷發(fā)生后由于炎癥反應(yīng)使肝細(xì)胞損傷,Kupffer細(xì)胞被激活,COX-2被大量的表達(dá)及合成,進(jìn)而促進(jìn)肝損傷的加劇[35-36]。肝臟中的Kupffer細(xì)胞可以分泌的炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α,加劇肝損傷[37]。同時,TNF-α是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中介導(dǎo)肝損傷的終末介質(zhì),能夠直接促進(jìn)肝損傷[38]。

由圖4和表7可知,與正常組相比,四氯化碳使模型組小鼠肝臟組織中的COX-2、IL-1β和TNF-α表達(dá)顯著增強(p<0.05)。與模型組相比,PEK和水飛薊素灌胃均能下調(diào)四氯化碳造成的COX-2、IL-1β和TNF-α表達(dá)加強,且高濃度PEK灌胃組小鼠的COX-2、IL-1β和TNF-α表達(dá)顯著低于低濃度PEK灌胃組,但略高于正常組和水飛薊素灌胃組。由此可見,PEK可顯著下調(diào)肝損傷小鼠的COX-2、IL-1β和TNF-α表達(dá)(p<0.05),且效果接近于相同濃度的水飛薊素。

圖3　各組小鼠肝組織中COX-2、IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)Fig.3　COX-2,IL-1β and TNF-α mRNA expressions in liver mice in different group

組別COX-2IL-1βTNF-α正常組0 49±0 01e0 34±0 03e0 13±0 03e模型組1 00±0 06a1 00±0 05a1 00±0 06aPEK低劑量組0 75±0 05b0 71±0 02b0 72±0 04bPEK高劑量組0 66±0 04c0 65±0 03c0 65±0 02c水飛薊素灌胃組0 55±0 02d0 57±0 02d0 33±0 03d

3　結(jié)論

本研究通過建立動物模型觀察了PEK對四氯化碳誘導(dǎo)肝損傷的改善作用,針對其多酚物質(zhì)的肝損傷改善效果進(jìn)行了機制研究。結(jié)果顯示PEK可以顯著緩解四氯化碳對小鼠體內(nèi)血清和肝組織造成的影響,且PEK的作用接近于肝損傷治療藥物水飛薊素。本研究是基于動物體內(nèi)進(jìn)行了實驗,為了進(jìn)一步驗證PEK的作用,未來需要在臨床研究中進(jìn)行深入研究?；趧游矬w內(nèi)實驗的結(jié)果可以看出,PEK作為一類從天然植物中提取的有效生物活性物質(zhì),具有較好的肝損傷預(yù)防效果,具有很好的開發(fā)利用價值。

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