基于色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析紐荷爾臍橙果汁及其果酒的香氣成分和苦味物質(zhì)

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(1.贛南師范大學(xué)臍橙學(xué)院,江西贛州 341000; 2.贛州出入境檢驗(yàn)檢疫局,江西贛州 341000; 3.江西省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院,江西南昌 330000; 4.國家臍橙工程技術(shù)研究中心,江西贛州 341000)

柑橘類水果是江西省獨(dú)具特色的農(nóng)產(chǎn)品,其中以贛南臍橙最負(fù)盛名,據(jù)贛州市果業(yè)局統(tǒng)計(jì),截止2014年,贛州市臍橙種植面積達(dá)168萬畝,總產(chǎn)量達(dá)122萬噸,總產(chǎn)值達(dá)96億美元[1]。贛州市栽種的臍橙品種90%是紐荷爾臍橙(Citrussinensis(L.)Osbeck),其原產(chǎn)于美國,果實(shí)肉質(zhì)細(xì)嫩,化渣多汁。芳香物質(zhì)占臍橙果實(shí)鮮重的0.001%～0.01%,其種類繁多并隨著果實(shí)的成熟而變化,是評(píng)價(jià)果實(shí)風(fēng)味的重要指標(biāo)[2]。張涵、唐會(huì)周、喬宇等[3-5]通過不同的萃取方法分別研究了柑橘果皮、果實(shí)及果汁的香氣成分。

我國的臍橙大都以鮮食為主,加工用果僅占5%左右,其中大部分經(jīng)過簡單加工成水果罐頭,果肉鮮食并不明顯的苦味一旦經(jīng)制汁、加熱以及儲(chǔ)藏,無苦味的前體物質(zhì)大量轉(zhuǎn)化為苦味物質(zhì)[6-7],會(huì)使加工產(chǎn)品帶有明顯的后苦味,比如果實(shí)中原無苦味的檸檬苦素A-環(huán)內(nèi)酯(Limonoate A-ring Lactone)在酸性條件和檸檬苦素D環(huán)內(nèi)酯水解酶的催化下,轉(zhuǎn)變成了具有強(qiáng)烈苦味的檸堿[8]。鄔應(yīng)龍等[9]研究了榨汁溫度、熱處理、過濾等加工工藝對(duì)柑橘類果汁主要苦味成分的影響。楊文俠[10]以臍橙為原料釀造干型臍橙果酒,并展開活性炭脫苦實(shí)驗(yàn),獲得較為理想的效果;Selli等[11-13]對(duì)土耳其柑橘品種和Moro甜橙釀造的果酒中的香氣組分進(jìn)行研究。本文采用頂空固相微萃取技術(shù)提取紐荷爾果汁及果酒中的香氣成分,通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)機(jī)分析其主要成分;采用QuEChERS方法凈化果汁及果酒,通過液相色譜質(zhì)譜聯(lián)機(jī)分析其中苦味物質(zhì)的成分,以期能夠找到相比于傳統(tǒng)的感官評(píng)價(jià)法,從香氣組成和苦味組成綜合評(píng)價(jià)果汁及果酒的質(zhì)量。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

紐荷爾臍橙采摘自贛州市信豐縣臍橙生產(chǎn)基地;白砂糖上海國藥試劑集團(tuán),分析純;葡萄酒型干酵母、高活性干酵母BV818安琪酵母股份有限公司;N-丙基乙二胺(PSA)上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司,凈化填料,主要用于去除脂肪酸、有機(jī)酸、極性色素以及糖類。

WJE2802D榨汁機(jī)美的(Midea);固相微萃取裝置美國Supelco公司;50/30 μm DVB/CAR on PDMS纖維萃取頭美國Supelco公司;7890A-5977氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀美國安捷倫科技有限公司;1290-6495液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀美國安捷倫科技有限公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1果汁和果酒的制備紐荷爾臍橙果汁:采摘充分成熟且色澤鮮艷、無腐爛、無病蟲害的臍橙果實(shí)洗凈,剝皮榨汁過濾,取濾液,測得可溶性固形物含量為15%,總酸為0.8%。

紐荷爾臍橙果酒[12]:按20 g/L糖產(chǎn)生1%的酒精計(jì)算所需加入糖量,將白砂糖溶解煮沸過濾,調(diào)入殺菌后的果汁中,使臍橙果汁中糖含量達(dá)到20%;將酵母按1∶20加入到2%的白砂糖溶液中,40 ℃保溫復(fù)水15 min后于30 ℃培養(yǎng)1.5 h活化;將活化好的酵母按0.15%比例接入含糖量為20%的臍橙果汁中,混合均勻,在25 ℃下恒溫發(fā)酵;果酒中酒精含量趨于穩(wěn)定時(shí),分離上層酒液與酒腳,得到臍橙原酒;加入0.05%單寧和0.03%明膠對(duì)原酒進(jìn)行澄清,加入0.3%活性炭,25 ℃ 150 r/min處理2 h進(jìn)行脫苦處理。將澄清脫苦后的果酒常溫放置一年后得到陳釀果酒,測得果酒的酒精度(20 ℃,CV%):(11.5±0.5) g/L,總糖(以葡萄糖計(jì))≤4.0 g/L,總酸:4.0～6.0 g/L。

1.2.2香氣成分測定萃取:將安裝好萃取頭的手動(dòng)萃取裝置插入氣相色譜進(jìn)樣口,設(shè)定進(jìn)樣口溫度270 ℃,老化60 min。準(zhǔn)確移取6 mL果酒(果汁)于15 mL螺紋頂空進(jìn)樣瓶中,加入磁力轉(zhuǎn)子,用隔墊蓋子密封,將進(jìn)樣瓶置于磁力加熱平臺(tái)中,設(shè)置加熱溫度60 ℃,轉(zhuǎn)速800 r/min,平衡20 min。平衡后,將老化后的萃取頭刺穿隔墊,調(diào)整高度,推出纖維頭,置于液面上方2 cm,萃取吸附40 min,抽回纖維頭,將手動(dòng)萃取裝置插入GC進(jìn)樣口,解析3 min。

儀器條件:采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,色譜柱型號(hào)HP-5MS,進(jìn)樣口溫度250 ℃,載氣流速1.2 mL/min,1∶1分流進(jìn)樣。升溫程序:起始柱溫40 ℃,保持1 min,以6 ℃/min的升溫速率上升到250 ℃,保持10 min。電離方式EI,電離能量70 eV,離子源溫度230 ℃,質(zhì)譜的掃描范圍為(33～400)AMU/S,檢索譜庫為NIST11。

1.2.3苦味物質(zhì)成分測定凈化方法:移取果汁(果酒)液1 mL于15 mL離心管中,加入9 mL去離子水稀釋,置于渦旋混合器上混勻。移取稀釋液5 mL置15 mL離心管中,加入PSA凈化填料120 mg,高速渦旋混合2 min,置于8000 r/min離心機(jī)中離心5 min,取上清液過膜上機(jī)。

儀器條件:采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,色譜柱型號(hào)為ZORBAX SB-C18 4.6 mm×100 mm,1.8 μm。液相條件:溶劑A純水,溶劑B乙腈,初始平衡濃度90% A、10% B,流速為0.3 mL/min,柱溫為30 ℃。0～1 min溶劑A梯度變?yōu)?0%,溶劑B梯度變?yōu)?0%;1～4 min溶劑A梯度變?yōu)?5%,溶劑B梯度變?yōu)?5%,并保持1 min;質(zhì)譜條件如表1所示。

1.3　數(shù)據(jù)處理

香氣成分定性:通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀采集到香氣的質(zhì)譜數(shù)據(jù),通過自動(dòng)積分程序積分每個(gè)峰,后采用Mass Hunter軟件中的物質(zhì)定性程序,匹配NIST 11質(zhì)譜譜庫。程序會(huì)根據(jù)內(nèi)置的運(yùn)算規(guī)則,比對(duì)質(zhì)譜的碎片離子峰,輸出可能的化合物。選擇與譜庫匹配度最高即得分最高的化合物作為該峰的定性化合物;定量:通過自動(dòng)積分程序得到每個(gè)色譜峰的面積,所有峰的面積之和作為總面積,單個(gè)峰的面積除以總面積可得所占百分比,即通過面積歸一化法計(jì)算香氣成分的含量,每組樣品測定三次取平均值。

表1　苦味物質(zhì)的質(zhì)譜條件Table 1　Mass spectrometric conditions for bitter substances

苦味物質(zhì)定性:通過液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀采集到四種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù),保留時(shí)間和二級(jí)質(zhì)譜離子對(duì),若樣品中在對(duì)應(yīng)保留時(shí)間出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的離子對(duì)即能定性樣品中含有該苦味物質(zhì);定量:配制不同濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),通過Mass Hunter計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線,同時(shí)定量樣品中的含量,每組樣品測定三次取平均值。四種苦味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為:橙皮苷(CPG)Y=636389.6X-6366.7,橙皮素(CPS)Y=2072426.3X-991.2,檸檬苦素(NMKS)Y=139042.9X+306.5,諾米林(NML)Y=412129.6X-95.7。

2　結(jié)果與分析

2.1　香氣成分測定

通過氣相色譜質(zhì)譜儀檢測得到紐荷爾臍橙果汁、果酒總離子流圖,如圖1、圖2。

圖1　紐荷爾臍橙果汁(XZ-QC)香氣成分總離子流圖Fig.1　Total ion chromatogram of Newhall navel orange juice(XZ-QC)

圖2　紐荷爾臍果酒(ZCNHE)香氣成分總離子流圖Fig.2　Total ion chromatogram of Newhall navel orange wine(ZCNHE)

通過Mass Hunter數(shù)據(jù)分析軟件匹配NIST 11譜庫,比對(duì)碎片離子豐度以及相似度,確定其香氣成分,同時(shí)采用面積歸一化法確定其相對(duì)含量,如表2所示。

紐荷爾臍橙果實(shí)中的芳香物質(zhì),如醇、酮、萜烯等是其成熟過程中形成的次生代謝產(chǎn)物,它們以一定比例構(gòu)成了臍橙特有的香氣特征。由表2可知,臍橙果酒、果汁中共鑒定出香氣成分54種,其中酯類化合物12種,萜烯類化合物17種,醛類化合物14種,醇類化合物8種,其他化合物3種。

表2　紐荷爾臍橙果汁、果酒的香氣成分及含量Table 2　Aroma components in Newhall navel orange juice and wine

續(xù)表

注：-表示未檢出。

果酒中鑒定化合物27種,其主要成分含量從高到低依次為辛酸乙酯(23.54%)、4-萜烯醇(13.45%)、芳樟醇(8.54%)、苯乙醇(8.45%)、己酸乙酯(7.38%)、癸酸乙酯(6.64%)、香茅醇(5.72%)、十六酸乙酯(5.41%),占總含量的79.13%。臍橙釀酒過程中酵母菌代謝糖類會(huì)生成乙醇和二氧化碳,同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生很多副產(chǎn)物,從各類物質(zhì)的來源來看,醇類主要來源于發(fā)酵、氨基酸的轉(zhuǎn)化以及亞麻酸降解物的氧化,其中多數(shù)對(duì)酒的香氣有不良的影響;酯類主要來源于果實(shí)中脂肪酸與醇類通過輔酶A形成,即醇?；D(zhuǎn)移酶途徑,絕大多數(shù)酯類具有令人愉快的香氣。香氣中己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯、十六酸乙酯、油酸乙酯分別為C6～C18偶數(shù)碳鏈脂肪酸與乙醇酯化生成的高級(jí)脂肪酸乙酯。碳鏈長度在C4～C10的乙酯類物質(zhì)具有迷人的果香味[14],比如己酸乙酯具有較強(qiáng)烈的菠蘿、香蕉的水果香氣,葵酸乙酯具有椰子型香氣;隨著碳鏈長度的增長酯類會(huì)產(chǎn)生像肥皂泡一樣的氣味,當(dāng)碳鏈長度達(dá)到C16～C18時(shí),會(huì)有陳油香味,并且可以增加酒體的醇厚感和后味,降低酒中的干澀味[15]。辛酸乙酯是濃香型白酒中重要的呈香物質(zhì)[16],具有杏、香蕉、菠蘿等果香氣,其香氣強(qiáng)度(OAV)在酯類中僅次于己酸乙酯,嗅覺識(shí)別閾參考值為127 μg/L[17],是臍橙酒果香的主要呈味物質(zhì)。含量第二的4-萜烯醇又稱4-松油醇,是單環(huán)單萜烯醇,具有辛香、木香和百合香氣,是茶樹油的主成分和常用的日用香料之一。芳樟醇又名沉香醇,是鏈狀萜烯醇,純種的芳樟葉油有非常清新而強(qiáng)烈的花香香氣,似剛開放的鈴蘭花,也像剛采摘的茶葉香味,讓嗅聞到的人們聯(lián)想到柑橘、甜橙的果香,聞之令人愉悅欣快,其帶有一點(diǎn)令人神清氣爽的涼氣,似薄荷又似留蘭香,沒有各種萜烯生硬的木頭氣息[18]。苯乙醇是一種芳香高級(jí)醇,因其具有柔和、愉快而持久的玫瑰香氣,在橙花、風(fēng)信子等多種花香型香精中大量使用,是酒精飲料中重要的高沸點(diǎn)香氣成分,廣泛存在于各種酒精飲料中[19]。李曉英從臍橙果酒中共鑒定出30種成分,主要香氣成分為苯乙醇、異戊醇、d-檸檬烯、2,3-丁二醇、乙酸乙酯、香葉醇、棕櫚酸乙酯等[20],這與本研究鑒定的物質(zhì)不全相同,這是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)用臍橙果酒經(jīng)過較長時(shí)間的陳釀,大部分都轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的酯類,這些醇、酸、酯類相互協(xié)調(diào)構(gòu)成了酒中特有的果香和酒香。

表3　紐荷爾臍橙果汁、果酒中四種苦味物質(zhì)含量Table 3　The content of four bitter substances in Newhall navel orange juice and wine

注：ND為未檢出。

果汁中鑒定化合物31種,其主要成分含量從高到低依次為D-檸檬烯(33.74%)、巴倫西亞橘烯(25.12%)、γ-芹子烯(4.98%)、2-已烯醛(4.17%)、β-蒎烯(3.67%)、β-芹子烯(3.50%),共占總含量的75.19%。Plotto A[21]與李曉英[20]的研究表明,檸檬烯、β-水芹烯、巴倫西亞橘烯為橙汁中主要的揮發(fā)性烯類成分,這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。林祥云[22]參照太陽光七色光譜原理,將自然界里各種氣味歸納成32個(gè)基本氣味,形成氣味輪,并具有“對(duì)角補(bǔ)缺”,“相鄰補(bǔ)強(qiáng)”的性質(zhì),其中柑橘香位列第三,屬于水果香的一部分,但又明顯區(qū)別于一般的水果香,其主要香氣成分是苧烯即檸檬烯,它與相鄰的芳樟醇、橙花醛相互調(diào)和,這些香氣有增食減疲的效果。D-檸檬烯又稱苧烯,是一種環(huán)狀單萜烯,廣泛存在于各種精油,特別是檸檬油和橙子油中,是一種低沸點(diǎn)、高蒸氣壓的頭香香料,留香時(shí)間很短,但香氣較強(qiáng),具有令人愉悅的檸檬樣香氣并且性質(zhì)活潑,可自動(dòng)氧化成一系列的氧化單環(huán)單萜,如香芹醇和香芹酮。巴倫西亞橘烯為柑橘類水果特有成份,呈柑橘似香氣,天然存在于柑橘類水果和可可中。2-已烯醛又稱青葉醛、反式-2-已烯醛,呈濃郁新鮮水果、綠葉清香氣,天然存在于橙皮中。β-蒎烯為橙油中常見物質(zhì)[23],楊君等[24]采用GC-MS和GC-O技術(shù)分析佛手精油,其中成分β-蒎烯呈現(xiàn)清香、果甜和松針味,并且具有很高的香氣稀釋值(FD)值,表明β-蒎烯在濃度極低的情況下仍具有強(qiáng)烈的香氣。

紐荷爾臍橙果汁和果酒中共同檢出的香氣成分有:2-已烯醛、芳樟醇、壬醛、香茅醇。壬醛是用于調(diào)配橙花、茉莉、玫瑰、鈴花的日用香精,具有柑橘、玫瑰的油脂果香氣味,香茅醇具有甜的玫瑰香氣,其香氣比香葉醇柔和,可用于調(diào)配玫瑰和鈴蘭等花香型日用香精[24]。

2.2　苦味物質(zhì)測定

QuEChERS為果蔬中農(nóng)藥多殘留樣品前處理方法,于2003年由Anastassiades M[25]提出,經(jīng)改進(jìn)先后成為美國官方分析方法(AOAC 2007.01)[26]及歐盟官方分析方法(BS EN:15662:2008)[27],本實(shí)驗(yàn)將QuEChERS方法應(yīng)用于果汁及果酒中的凈化,將N-丙基乙二胺固相吸附劑填料(PSA)加入液體中,用于去除樣品中的有機(jī)酸、色素和金屬離子,后用純水稀釋十倍,減少基質(zhì)效應(yīng)的影響。

紐荷爾臍橙果汁和果酒中橙皮苷(CPG)、橙皮素(CPS)、檸檬苦素(NMKS)、諾米林(NML)四種苦味物質(zhì)的色譜圖見圖3。

圖3　四種苦味物質(zhì)的色譜圖Fig.3　Chromatogram of four bitter substances

果汁及果酒中四種苦味物質(zhì)的含量見表3,釀酒過程中檸檬苦素的含量由4.43 μg/mL降低為0.05 μg/mL,味覺上果酒相比于果汁少了明顯的后苦味。類檸檬苦素化合物是三萜類的植物次生代謝產(chǎn)物,主要存在于蕓香科和楝科植物中,比如臍橙、柑橘等,其中檸檬苦素和諾米林都為類檸檬苦素化合物,在柑橘果汁中含量超過6 mg/L則已不適宜飲用,所以它們是引起柑橘汁苦味的重要原因[28]。釀造過程中,檸檬苦素及其類似物諾米林通過酵母發(fā)酵、酶的作用等原因逐漸降解,轉(zhuǎn)變?yōu)闆]有苦味的脫氫檸檬苦素及酸類[29],因此果酒中檸檬苦素的含量變低為0.05 μg/mL,諾米林在果酒中沒有檢測到。果汁中橙皮苷(13.4 μg/mL)和橙皮素(0.02 μg/mL)含量與果酒中橙皮苷(16.7 μg/mL)和橙皮素(0.08 μg/mL)的含量差異不大。

3　結(jié)論

本研究通過頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析紐荷爾臍橙果汁及果酒的香氣成分,其中果汁中鑒定化合物31種,主要成分為D-檸檬烯(33.74%)和巴倫西亞橘烯(25.12%),果酒中鑒定化合物27種,主要成分為4-萜烯醇(13.45%)、芳樟醇(8.54%)、苯乙醇(8.45%)以及高級(jí)脂肪酸乙酯。通過液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定果汁、果酒中苦味物質(zhì)含量,其中果汁中主要苦味物質(zhì)為橙皮苷(13.4 μg/mL)、檸檬苦素(4.43 μg/mL)、橙皮素(0.02 μg/mL)、諾米林(0.07 μg/mL),果酒中主要苦味物質(zhì)為橙皮苷(16.7 μg/mL)、檸檬苦素(0.05 μg/mL)橙皮素(0.08 μg/mL),果酒中沒有檢測到諾米林的存在,橙皮苷和橙皮素的含量沒有顯著變化。

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