流式細(xì)胞技術(shù)檢測酸性飲料中菌落總數(shù)的研究

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(1.達(dá)能(中國)食品飲料有限公司,廣東中山 528415; 2.廣東出入境檢驗檢疫技術(shù)中心,廣東省動植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點實驗室，廣東廣州 510000)

隨著科技的發(fā)展和人們生活水平的不斷提高,食品安全日益受到人們的關(guān)注,其中微生物污染是影響食品安全的主要因素,因此作為食品生產(chǎn)企業(yè),對微生物污染的預(yù)防和監(jiān)控顯得尤為重要。傳統(tǒng)微生物檢測方法具有耗時長、工作量大、不易檢出芽孢等缺點[1],嚴(yán)重影響了對微生物污染控制的時效性,從而制約了企業(yè)的放貨速度和運轉(zhuǎn)效率,這是所有食品行業(yè)所面臨的共同難題。近年來,隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,各種快速檢測方法如生物熒光法、免疫化學(xué)法和流式細(xì)胞技術(shù)等已廣泛運用于食品、飲料、發(fā)酵和環(huán)保領(lǐng)域,其中流式細(xì)胞技術(shù)(Flow Cytometry,FCM)因其可解決傳統(tǒng)微生物檢測手段檢測周期過長、無法大批量檢測樣本等缺點[1]而廣受青睞。FCM法是一種采用流式細(xì)胞儀檢測溶液中懸浮細(xì)胞或微粒的現(xiàn)代分析技術(shù),通過熒光探針的協(xié)助,從分子水平上獲取多種信號,對細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選,有研究報道[2-4]比較了流式細(xì)胞法與平板法或濾膜法檢測菌落總數(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)流式細(xì)胞儀檢測時間只需2 h左右,而平板計數(shù)法或濾膜法則需要2 d左右,而且在一定濃度范圍內(nèi),前者具有更好的符合性,更加靈敏、準(zhǔn)確、高通量,對液態(tài)食品的貨架期、倉儲、保質(zhì)期、出口等順利進(jìn)行提供了高效的技術(shù)平臺[1,5]。

FCM法在細(xì)菌[6-7]、真菌等微生物檢測方面的應(yīng)用已非常廣泛[8-9],目前已成為飲料、發(fā)酵和環(huán)保等微生物質(zhì)量檢測領(lǐng)域的常用工具和有力手段[10-12],但是關(guān)于FCM法直接檢測低含菌量的酸性飲料菌落總數(shù)方面的應(yīng)用研究,國內(nèi)還鮮有報道。2015年國家食品安全法提倡食品飲料企業(yè)運用先進(jìn)的技術(shù)手段來加速產(chǎn)品放行,因此將流式細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用到含菌量低的酸性飲料菌落總數(shù)的檢測,對于飲料行業(yè)具有非常重要的現(xiàn)實意義,可以縮短培養(yǎng)時間,加快產(chǎn)品放行,從而提高產(chǎn)品的新鮮度,降低庫存成本。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

酸性飲料(pH<4.6)中山市小欖鎮(zhèn)超市購買;胰蛋白胨大豆瓊脂TSA、平板計數(shù)瓊脂PCA、營養(yǎng)肉湯TSB、無菌平皿(50 mm & 90 mm)廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;0.85%無菌生理鹽水自制;0.45 μm濾膜密理博(中國)有限公司;CS13、ChemSol S 50X、Diluent R、CSR、Isored、Antifoam、Cleaning 5、Cleaning 3、Standard G、ChemChrome V26、CSV、B24梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；實驗用菌株詳見表1所示。

BactiFlow ALS system流式細(xì)胞儀梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司;生物安全柜/超凈工作臺蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;生化培養(yǎng)箱美墨爾特(上海)貿(mào)易有限公司;三聯(lián)過濾裝置密理博(中國)有限公司。

表1　實驗用菌株編號及名稱Table 1　Number and name of the test strains

1.2　實驗方法

1.2.1菌種的保藏和活化實驗菌株在TSA培養(yǎng)基上,(36±1) ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行復(fù)蘇,對復(fù)蘇后的菌株純度及生化特性做確認(rèn),通過一系列的生化實驗、16S rDNA測序及MODI-TOF分子生物學(xué)鑒定實驗確證實驗菌株。將表1所列菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯TSB培養(yǎng)基中,(36±1) ℃培養(yǎng)24 h 后,菌懸液備用。

1.2.2濾膜法將含菌飲料手動混勻,在無菌操作環(huán)境下,抽濾250 mL含菌飲料,用無菌鑷子將濾膜轉(zhuǎn)移至平板計數(shù)瓊脂(PCA),于(36±1) ℃倒置培養(yǎng)(48±4) h,觀察并計數(shù)[13]。

1.2.3FCM法增菌:將含菌飲料手動搖勻,在無菌操作環(huán)境下,抽濾250 mL含菌飲料,用無菌鑷子將濾膜轉(zhuǎn)移至100 mL TSB肉湯,于(36±1) ℃培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)。

檢測:用無菌移液器移取上述增菌后的菌液100 μL加入20 mL無菌試管中,依次加入90 μL CS13,于無菌環(huán)境靜置30～60 min。開機清洗校正完成后將含樣品的20 mL試管置于SPU樣品架,試劑Cleaning 5、還原劑(CSR+DR+隔離油)、CSV和B24放置在試劑架,V26放置在冷卻架。編輯程序,運行檢測,其稀釋倍數(shù)為30[14]。

1.2.4平板法將菌液手動搖勻,在無菌操作環(huán)境下,用無菌移液器移取1 mL含菌溶液至無菌平皿中,傾注溫度為(46±1) ℃的平板計數(shù)瓊脂(PCA),搖勻,靜置凝固后倒置于(36±1) ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(48±4) h,觀察并計數(shù)[15]。

1.2.5FCM法和平板法檢測不同基質(zhì)中實驗菌株菌濃度的對比研究以生理鹽水為基質(zhì),將表1中的新鮮培養(yǎng)物制備成約103～109CFU/mL濃度的菌懸液,分別運用平板法和FCM法對菌懸液的菌濃度進(jìn)行檢測。

以酸性飲料為基質(zhì),將表1中的新鮮培養(yǎng)物制備成約103～109CFU/mL濃度的菌懸液,分別運用平板法和FCM法對菌懸液的菌濃度進(jìn)行檢測。

1.2.6增菌時間對FCM法和平板法檢測低含菌量樣品菌濃度的影響以酸性飲料為基質(zhì),選擇常見實驗菌株13株(A～M),制備濃度為1～10 CFU/250 mL的菌懸液,菌懸液的初始菌濃度由濾膜法確定。另過濾富集250 mL樣品中的微生物,將濾膜置于100 mL TSB肉湯培養(yǎng)基中,(36±1) ℃增菌培養(yǎng)6 h和22 h后,使用FCM法與平板法同時檢測增菌后的微生物水平,對FCM法與平板法的檢測結(jié)果與濾膜法的定性檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析。

1.2.7增菌時間對FCM法檢測強壯類和愛媛類芽孢桿菌菌濃度的影響以酸性飲料為基質(zhì),選擇生長較為緩慢的強壯類和愛媛類芽孢桿菌(A和B),分別制備成濃度為1～10 CFU/250 mL的菌懸液。每個菌株選擇6個樣品(A-1～A-6,B-1～B-6),樣品的菌濃度由濾膜法確定均在1～10 CFU/250 mL的范圍內(nèi),分別過濾富集250 mL樣品中的微生物,將濾膜置于100 mL TSB肉湯培養(yǎng)基中(36±1) ℃培養(yǎng)0、6、22 h后,采用FCM法檢測增菌后的微生物水平,每個樣品分別上機檢測2次,并與濾膜法的定性檢測結(jié)果進(jìn)行對比,分析增菌時間對FCM法檢測強壯類和愛媛類芽孢桿菌的影響。

1.2.8濾膜法與增菌22 h后FCM法定性結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析以酸性飲料為基質(zhì),選擇常見實驗菌株13株(A～M),分別制備成濃度為1～10 CFU/250 mL,10～100 CFU/250 mL和>100 CFU/250 mL的菌懸液。120個陰性樣品(無菌酸性飲料)與936個陽性樣品(每個菌株每個濃度梯度選擇24個樣品),分別過濾富集250 mL樣品中的微生物,將濾膜置于100 mL TSB肉湯培養(yǎng)基中(36±1) ℃增菌培養(yǎng)22 h,采用FCM法檢測增菌后的微生物水平,每個樣品分別上機檢測2次,并與濾膜法的定性檢測結(jié)果對比,進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3　數(shù)據(jù)處理

運用McNemar的Kappa統(tǒng)計分析1.2.8的檢測結(jié)果[16]。

2　結(jié)果與分析

2.1　蠟樣芽孢桿菌在不同基質(zhì)中FCM法和平板法檢測結(jié)果的一致性研究

圖1　FCM法和平板法檢測不同基質(zhì)中蠟樣芽孢桿菌結(jié)果的線性關(guān)系Fig.1　The linearity of FCM and pour plate methods to test bacillus cereus in different substrates

FCM法與平板法檢測不同基質(zhì)中蠟樣芽孢桿菌(G)結(jié)果的線性關(guān)系如圖1所示。以生理鹽水為基質(zhì),蠟樣芽孢桿菌有1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108和1×109CFU/mL七個濃度梯度,平板法和FCM法檢測結(jié)果的線性關(guān)系為R2=0.9823>0.95;以酸性飲料基質(zhì),蠟樣芽孢桿菌有1×105、1×106、1×107、1×108和1×109CFU/mL五個濃度梯度,平板法和FCM法檢測結(jié)果的線性關(guān)系為R2=0.9607>0.95。說明在酸性飲料和生理鹽水中兩種方法對于蠟樣芽孢桿菌菌濃度的檢測在一定濃度范圍內(nèi)均具有較高的相關(guān)性,無顯著性差異,采用FCM法可以準(zhǔn)確的檢出蠟樣芽孢桿菌。

2.2　不同基質(zhì)對FCM法與平板法檢測13種實驗菌株菌濃度的影響

不同濃度13種(A～M)實驗菌株在酸性飲料中和生理鹽水中FCM法和平板法的檢測結(jié)果如表2所示。以生理鹽水為基質(zhì)時,FCM法和平板法的計數(shù)結(jié)果表現(xiàn)出較高的一致性,除菌株E和G外平板法與FCM法檢測結(jié)果均在一個數(shù)量級上。以酸性飲料為基質(zhì)時,其中C、D、E、F、H、I、L、M均不能被FCM法檢出,另A、B、G、J、K可以被平板法和FCM法檢出,但差異較大。一方面可能是由于酸性飲料基質(zhì)成分會特異性的干擾部分菌株;另一方面可能是FCM的檢測限一般在102～103CFU/mL,對于低含菌量的樣品無法檢測出其初始菌濃度[17-18]。故針對含菌量低的酸性飲料可過濾富集后增菌培養(yǎng),一方面排除基質(zhì)的干擾[4],另一方面通過增菌培養(yǎng)達(dá)到FCM法的最低檢測限,以獲得與濾膜法或平板法更為一致的定性結(jié)果。

表2　FCM法與平板法檢測不同基質(zhì)中13種實驗菌株的菌濃度結(jié)果對比Table 2　The results comparison of FCM and pour plate methods to detect 13 strains in different substrates

2.3　增菌時間對FCM法和平板法檢測低含菌量樣品菌濃度的影響

表3　酸性飲料中13種實驗菌株經(jīng)增菌6 h和22 h后FCM法和平板法的檢測結(jié)果Table 3　The results of FCM and pour plate methods to detect 13 strains in acid beverage after proliferation for 6 h and 22 h

增菌時間對FCM法和平板法檢測低含菌量樣品菌濃度的影響如表3所示。初始菌液經(jīng)濾膜法計數(shù)均為陽性,增菌6 h后,強壯類和愛媛類芽孢桿菌(A和B)可以被平板法檢出而不能被FCM法檢出,可能是由于強壯類和愛媛類芽孢桿菌生長分裂緩慢,故在培養(yǎng)6 h后含菌量還不足以達(dá)到FCM法的最低檢測限;當(dāng)增菌時間延長至22 h,13種實驗菌株經(jīng)FCM法檢測均能獲得與濾膜法一致的定性結(jié)果,且FCM法的定量檢測結(jié)果與平板法均在一個數(shù)量級,說明增菌22 h,可以獲得更為穩(wěn)定的結(jié)果。

2.4　增菌時間對FCM法檢測強壯類和愛媛類芽孢桿菌菌濃度的影響

酸性飲料中不同濃度強壯類和愛媛類芽孢桿菌(A和B),經(jīng)增菌0、6、22 h后,FCM法的檢測結(jié)果如表4所示。0 h時,FCM法檢測結(jié)果為陰性,顯示未檢出;增菌時間延長至6 h,部分FCM法檢測結(jié)果為陽性,與濾膜法的定性結(jié)果是一致的,但仍有部分FCM法檢測結(jié)果顯示陰性,說明部分菌株生長稍緩慢,在增菌6 h的情況下,菌株還未能繁殖至FCM法的最低檢測限,從而無法與濾膜法獲得一致的定性結(jié)果。當(dāng)增菌時間延長至22 h,所有樣品的FCM法檢測結(jié)果均顯示陽性與濾膜法的定性結(jié)果一致,說明增菌時間達(dá)到22 h時,FCM法可替代濾膜法進(jìn)行酸性飲料中強壯類和愛媛類芽孢桿菌的定性檢測。

2.5　濾膜法與增菌22 h后FCM法定性結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析

對酸性飲料中低、中和高濃度的13種(A～M)實驗菌株進(jìn)行濾膜法與FCM法檢測結(jié)果的定性對比研究。在增菌22 h的條件下,對于低、中和高濃度的13種實驗菌株FCM法與濾膜法表現(xiàn)出高度一致的定性結(jié)果,統(tǒng)計學(xué)分析見表5所示。在初始含菌量<1 CFU/250 mL的情況下,卡方值X2=1.5<3.84，F(xiàn)CM法的假陽性率=4.2%<9.6%，特異性=95.8%>90.4%;當(dāng)初始含菌量在1～10 CFU/250 mL的范圍內(nèi)時,卡方值X2=1.1<3.84,FCM法的假陰性率=1.9%<2%,靈敏度=98.1%>98%;當(dāng)初始含菌量>10 CFU/250 mL時,靈敏度=100%>98%,無假陰性的結(jié)果。以上統(tǒng)計學(xué)分析[16]表明濾膜法與增菌22 h后FCM法的定性結(jié)果無顯著差異；在增菌22 h的條件下,FCM法可替代濾膜法進(jìn)行酸性飲料中菌落總數(shù)的定性檢測,從而縮短檢測周期,加速產(chǎn)品放行。

注：a:每250 mL酸性飲料中含有的細(xì)菌總數(shù)的可能數(shù);b:反應(yīng)FCM法和達(dá)能濾膜法確認(rèn)性結(jié)果相等的數(shù)量;c:樣品的數(shù)量;d:x2由NcNema定義為(|m-n|-1)2/(m+n)，其中m等于FCM法的陽性樣本數(shù)和達(dá)能濾膜法的陰性樣本數(shù)，n等于FCM法的陰性性樣本數(shù)和達(dá)能濾膜法的陽性樣本數(shù)。x2值大于3.84表示顯著性差異為p<0.05。e:假陰性率為100-靈敏度;f:靈敏度定義為100乘以“已知”陽性測試樣品數(shù)除以“已知”樣品總數(shù)，“已知”指用參考方法確認(rèn);g:假陽性率為100-特異性;h:特異性定義為100乘以“已知”陰性測試樣品數(shù)除以“已知”樣品總數(shù)，“已知”指用參考方法確認(rèn)。

3　結(jié)論

本研究采用FCM法替代濾膜法定性檢測低含菌量酸性飲料的菌落總數(shù),通過添加不同類型的13種(A～M)實驗菌株進(jìn)行驗證。模擬酸性飲料在不同濃度不同種類微生物污染的情況下,過濾富集菌于TSB肉湯中增菌培養(yǎng)一定時間,經(jīng)FCM法檢測,并與平板法和濾膜法進(jìn)行對比分析。結(jié)果表明:FCM法可替代濾膜法用于酸性飲料菌落總數(shù)的定性檢測從而加速產(chǎn)品放行。FCM法可短時間內(nèi)出具產(chǎn)品的微生物分析結(jié)果,能夠?qū)ιa(chǎn)、運輸和庫存環(huán)節(jié)的微生物污染進(jìn)行及時有效的控制而產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益[19],比濾膜法或平板法節(jié)省1 d的檢測時間。FCM法檢測成本高,因此應(yīng)進(jìn)一步加強試劑和耗材的研究和開發(fā),降低檢測成本,從而使FCM法檢測菌落總數(shù)可以得到更為廣泛的運用;其次進(jìn)一步縮短培養(yǎng)時間或運用FCM法對低含菌量酸性飲料中霉菌、酵母以及耐酸菌的檢測在食品飲料企業(yè)亦具有非常廣大的應(yīng)用前景。

[1]何方洋,萬宇平,賈芳芳,等. 流式細(xì)胞儀在檢測食品中微生物的應(yīng)用研究[J]. 山東畜牧獸醫(yī),2016,37(8):82-84.

[2]潘洛安,張利華,張經(jīng). 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測定水體異養(yǎng)細(xì)菌[J]. 海洋環(huán)境科學(xué),2005,24(1):54-58.

[3]劉新星,霍轉(zhuǎn)轉(zhuǎn),云慧,等. 流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)菌快速檢測中的應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)通報,2014,41(1):161-168.

[4]劉道亮,胡連霞,趙占民. 流式細(xì)胞技術(shù)快速檢測果汁中的霉菌、酵母菌[J]. 食品工業(yè)科技,2011,32(3):387-391.

[5]王寧,劉寧. 流式細(xì)胞術(shù)快速檢測生乳中細(xì)菌總數(shù)[J]. 食品工業(yè)科技,2007,28(9):197-200.

[6]辛忠濤,薛沿寧,柳川. 流式細(xì)胞分選技術(shù)在微生物表面展示文庫篩選中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,2003,31(3):62-65.

[7]董成霞. 流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)菌快速檢測中的應(yīng)用研究[J]. 中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè),2014(11):194-195.

[8]趙現(xiàn)方,陳林海,李宗義,等. 流式細(xì)胞術(shù)及其微生物學(xué)中的應(yīng)用[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2005(6):5-9.

[9]張艷.流式細(xì)胞術(shù)在微生物檢測中的應(yīng)用[J]. 醫(yī)療裝備,2011,24(5):33-35.

[10]李文華,胡茂志,嚴(yán)秋香,等. 流式細(xì)胞術(shù)在營養(yǎng)和食品衛(wèi)生評價中的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(11):279-281.

[11]Broger T,Odermatt R P,Huber P,et al. Real time on-line flow cytometry for bioprocess monitoring[J].Journal of Biotechnology,2011,154(4):240-247.

[12]鄭海萍,李艷輝. 流式細(xì)胞儀的原理及應(yīng)用[J]. 醫(yī)療器械,2003,16(3):286-286.

[13]孫娜,劉海洲,張捷,等. 濾膜法與國標(biāo)法用于微生物檢驗的比較研究[J]. 化學(xué)與生物工程,2008,25(8):70-72.

[14]劉道亮,趙占民,胡連霞,等. 應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)快速檢測液態(tài)商品中的細(xì)菌總數(shù)[J]. 食品科學(xué),2011,32(2):157-163.

[15]GB 4789.2-2016,食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定[S]. 北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2016.

[16]李宏,雷質(zhì)文. 食品微生物檢測方法確認(rèn)和證實手冊[M].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2013:5-90.

[17]Gunasekera TS,Attfield PV,Veal DA. A flow cytometry method for rapid detection and enumeration of total bacteria in milk[J]. Applied and Environmental Microbiology,2000,66(3):1228-1232.

[18]李萍,溫平威,許恒毅,等. 流式細(xì)胞術(shù)在食源致病菌檢測中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(14):375-379.

[19]孫曉霞,趙占民,劉道亮,等. 應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)快速定量檢測UHT奶產(chǎn)品中的微生物[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2011,37(2):160-164.