人參果多糖的分離純化及體外抗氧化活性研究

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(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所,吉林長春 130112; 2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林長春 130041)

人參果又名人參子,是五加科植物人參(PanaxginsengC. A. Meyer)的果實,可單獨入藥,也可作為保健食品原料使用。據(jù)《本草綱目拾遺》記載,人參果具有疏表透疹的功效,可用于治療氣血不足、痘發(fā)不暢等癥。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,人參果具有抗衰老[1]、抗疲勞[2]、降血糖[3]、抗腫瘤[4-5]等多種功效。人參果中含有皂苷、多糖、揮發(fā)油、生物堿、氨基酸[2]等多種活性成分。一直以來,皂苷被認(rèn)為是人參果中的主要活性成分。隨著研究越來越深入,發(fā)現(xiàn)作為人參果的重要組成成分的多糖,與人參果生物活性的發(fā)揮也密切相關(guān)。人參果粗多糖主要由酸性雜多糖組成[6],單糖組成比較復(fù)雜。能夠調(diào)節(jié)血糖[7],降低老年大鼠血清中MDA含量及腦和肝組織中脂褐質(zhì)的含量,顯著提高血清中SOD、CAT、GSH-Px活性及皮膚羥脯氨酸含量[8]、提高小鼠抗應(yīng)激和免疫能力、保護(hù)肝臟和延緩衰老[9]等活性。目前人參果多糖的主要研究對象為總多糖,缺乏對組成、結(jié)構(gòu)和活性的全面研究和考察。因此,本工作擬對人參果水溶性總多糖進(jìn)行系統(tǒng)的分級和純化,并對其單糖組成、總糖含量、糖醛酸含量、分子量及抗氧化活性進(jìn)行分析和檢測,為人參果的進(jìn)一步加工利用提供實驗依據(jù)和基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

人參果購于吉林省撫松縣,經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所許世泉研究員鑒定為五加科植物人參(PanaxginsengC. A. Meyer)的果實;單糖標(biāo)準(zhǔn)品Sigma-Aldrich公司;層析柱、C16/26 DEAE-Sepharose Fastflow凝膠GE公司;DPPH(Cat# CD4891-500MG)Coolaber公司;羥自由基測定試劑盒南京建成生物工程研究所;透析袋上海綠源生物科技有限公司;其它試劑分析純。

TGL-16A高速臺式離心機上海安亭科學(xué)儀器廠;FD-1A-50低溫冷凍干燥機北京博醫(yī)康技術(shù)有限公司;JP-100ST超聲波清洗機深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;QD8J(BL)單煎機青島達(dá)爾電子機械銷售有限公司;高效液相色譜儀、SPD-M20A紫外檢測器日本島津儀器有限公司;LC-16溶劑輸送泵、CTO-16柱溫箱島津儀器(蘇州)有限公司;ODS Hypersil色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2　實驗方法

1.2.1人參果總多糖的提取采收新鮮人參果,手搓去籽,剩余人參果肉按1 kg質(zhì)量加入8 L蒸餾水的比例,100 ℃提取4 h,四層紗布過濾,留取濾液,沉淀重復(fù)提取兩次。合并三次提取所得濾液,利用單煎機保持微沸狀態(tài)濃縮至1.5 L,離心(4500 r/min,10 min),棄去沉淀。上清于60 ℃水浴濃縮至1 L,至室溫后,加入95%乙醇調(diào)節(jié)乙醇終濃度為80%,沉淀過夜。離心(4500 r/min,10 min),收集沉淀。向沉淀中加入800 mL蒸餾水,充分溶解,重復(fù)醇沉一次。沉淀用蒸餾水復(fù)溶后冷凍干燥,得人參果總多糖(WGBP,Water-soluble Ginseng Berry Polysaccharide)。

1.2.2人參果多糖的分離純化

1.2.2.1凝膠的預(yù)處理DEAE-Sepharose Fastflow凝膠篩除碎膠及雜質(zhì)后,裝入層析柱(8.0 cm×20 cm),依次用3倍柱體積的蒸餾水、2倍柱體積的2 mol/L NaCl和2倍柱體積的蒸餾水進(jìn)行平衡,平衡流速為15 cm/h。

1.2.2.2洗脫濃度的確定取15 mg人參果多糖樣品,溶于1 mL蒸餾水中,離心(4500 r/min,10 min)后上樣于DEAE-Sepharose Fastflow凝膠層析柱。先用二倍柱體積的蒸餾水洗脫,再利用梯度混合器,對多糖進(jìn)行0～0.5 mol/L NaCl線性梯度洗脫,流速2 mL/min,2 min/管。檢測收集的洗脫液中的總糖和酸性糖分布情況,繪制洗脫曲線。

1.2.2.3樣品分級制備取5 g WGBP溶于80 mL蒸餾水中,離心(4500 r/min,10 min)后上樣于平衡好的DEAE-Sepharose Fastflow層析柱(8.0 cm×20 cm),依次用2 L蒸餾水、0.06、0.26、0.37 mol/L NaCl溶液洗脫,流速10 mL/min,每燒杯收集50 mL洗脫液,檢測收集的洗脫液中的總糖和酸性糖分布情況。分別收集不同的洗脫峰,水洗級分濃縮、鹽洗級分透析(Mw3500)除鹽后冷凍干燥,最終獲得蒸餾水洗脫組分WGBP-N和0.06 mol/L NaCl溶液洗脫組分WGBP-1、0.26 mol/L NaCl溶液洗脫組分WGBP-2、0.37 mol/L NaCl溶液洗脫組分WGBP-3。

1.2.3多糖級分的分子篩層析分析將5 mg多糖樣品溶于1 mL洗脫液中,離心(10000 r/min,5 min),上清上樣于凝膠層析分析柱(Sepharose CL-6B或Superdex 75,1.6 cm×80 cm)[10],洗脫液為0.15 mol/L NaCl溶液,流速0.15 mL/min,使用收集器20 mL/管自動收集洗脫液。測定洗脫液的總糖和糖醛酸含量分布,繪制洗脫曲線。

1.2.4理化性質(zhì)測定采用苯酚-硫酸法測定總糖含量[11];間羥基聯(lián)苯法測定糖醛酸的含量[12]。

單糖組成分析[13-14]:稱取多糖樣品2 mg,依次用1 mol/L鹽酸-甲醇溶液和2 mol/L三氟乙酸溶液水解,PMP衍生化后HPLC檢測。采用Shimadzu HPLC系統(tǒng),Hypertsil ODS色譜柱,柱溫箱控制柱溫為35 ℃,流動相為82.0% PBS(0.1 mol/L,pH7.0)和18.0%乙腈(v/v),等梯度洗脫,流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣量為20 μL,檢測波長為245 nm。

1.2.5多糖樣品的DPPH·清除率檢測將樣品配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/mL濃度梯度的水溶液。取0.5 mL樣品溶液,加入0.5 mL 5% DPPH乙醇溶液,混勻后避光反應(yīng)1 h,517 nm測吸光值[15]。

DPPH·清除率(%)=[1-(A樣品-A空白)/A對照]×100

其中,A樣品:0.5 mL樣品溶液+0.5 mL DPPH;A空白:0.5 mL樣品溶液+0.5 mL無水乙醇;A對照:0.5 mL DPPH+0.5 mL蒸餾水。

1.2.6多糖樣品的羥自由基清除率檢測應(yīng)用羥自由基清除試劑盒進(jìn)行檢測。將樣品配制成0.025、0.05、0.075、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL濃度梯度的水溶液。按試劑盒說明書上的方法,配制H2O2應(yīng)用液、底物儲備液、顯色劑等,37 ℃水浴中進(jìn)行反應(yīng),550 nm測定吸光值,計算多糖樣品的羥自由基清除率。

表1　人參果多糖各級分的得率、總糖含量、糖醛酸含量及單糖組成Table 1　Yield,total carbohydrate contents,uronic acid contents and monosaccharide composition of ginseng berry polysaccharide fractions

注：a多糖與人參果質(zhì)量的百分比。羥自由基清除率(%)=(A對照-A樣品)/A對照×100

其中,A對照:0.2 mL蒸餾水+0.2 mL底物應(yīng)用液;A樣品:0.2 mL樣品+0.2 mL底物應(yīng)用液。

1.3　數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)表示為Mean±SD,通過雙因素方差分析(Two-way ANOVA)進(jìn)行所有統(tǒng)計分析,使用GraphPad Prism版本5(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)。

2　結(jié)果與分析

2.1　人參果多糖的分級純化及單糖組成分析

2.1.1人參果多糖的單糖組成及分子篩層析分析人參果多糖WGBP得率為1.2%。通過HPLC分析單糖組成,表1結(jié)果表明,WGBP主要由鼠李糖(rhamnose,Rha,5.4%)、半乳糖醛酸(galacturonic acid,GalA,19.1%)、半乳糖(galactose,Gal,51.2%)、阿拉伯糖(arabinose,Ara,10.5%)、葡萄糖(glucose,Glc,11.3%)和少量葡萄糖醛酸(glucuronic acid,GlcA)、甘露糖(mannose,Man)組成。WGBP在Sepharose CL-6B分析柱上呈現(xiàn)不均一的峰(圖1),分子量分布較廣,不適合用該層析柱進(jìn)行進(jìn)一步的分級純化。

圖1　WGBP在Sepharose CL-6B分析柱上的總糖和糖醛酸分布圖Fig.1　Elution profiles of WGBP on Sepharose CL-6B 注:Vo外水體積;Vt總體積。

2.1.2WGBP的離子交換層析純化將WGBP上樣于DEAE-Sepharose Fastflow分析柱,0～0.5 mol/L NaCl線性梯度洗脫。結(jié)果如圖2(a)所示。根據(jù)洗脫數(shù)據(jù)分析,在NaCl濃度為0.06、0.26和0.37 mol/L時,有明顯的洗脫峰,因此確定最終對WGBP進(jìn)行純化分級時的洗脫液分別為蒸餾水、0.06、0.26、0.37 mol/L NaCl。進(jìn)一步進(jìn)行柱層析分析驗證,結(jié)果如圖2(b)所示,該濃度梯度能夠?qū)GBP純化為一個中性糖級分(WGBP-N)和三個酸性糖級分(WGBP-1、WGBP-2、WGBP-3),得率及單糖組成見表1。WGBP-N和WGBP-2得率較高,分別為0.67%和0.26%。WGBP-N由Gal、Ara和Glc組成,WGBP-1～WGBP-3主要由GalA、Gal、Ara和Rha組成。

圖2　WGBP經(jīng)DEAE-Sepharose Fastflow層析柱洗脫曲線Fig.2　Elution profiles of WGBP on DEAE-Sepharose Fastflow column注:(a)線性洗脫;(b)濃度梯度洗脫。

2.1.3人參果多糖子級分的分子篩層析和單糖組成測定WGBP-N是人參果多糖的中性糖級分。如圖3(a)所示Sepharose CL-6B分析柱洗脫結(jié)果,WGBP-N分子量分布較廣,呈現(xiàn)三個明顯的洗脫峰。WGBP-N由Gal、Ara、Glc和Man組成(表1),比例為62.7∶17.0∶17.1∶3.2,其中Gal含量最高,可能含有半乳聚糖等結(jié)構(gòu)單元。

圖3　人參果多糖各級分凝膠柱層析分析的總糖和糖醛酸分布圖Fig.3　Elution profiles of polysaccharide fractions注:(a)WGBP-N上Sepharose CL-6B柱層析;(b)WGBP-1上Superdex 75柱層析; (c)WGBP-2上Sepharose CL-6B柱層析;(d)WGBP-3上Sepharose CL-6B柱層析;Vo外水體積;Vt 總體積。

WGBP-1得率低,在Sepharose CL-6B層析柱上呈現(xiàn)無規(guī)則的洗脫峰,而在Superdex 75層析柱上呈現(xiàn)對稱性較好的兩個峰,如圖3(b)所示,其中分子量大的部分糖醛酸含量較低,為富含中性結(jié)構(gòu)域的果膠級分,分子量小的部分糖醛酸含量高,富含酸性果膠,可以利用該凝膠進(jìn)行進(jìn)一步的純化,目前這部分工作也在進(jìn)行中。WGBP-1主要由Rha(2.6%)、GalA(46.6%)、Gal(36.4%)、Ara(8.3%)組成(表1)。其中,GalA含量較高,預(yù)示大量聚半乳糖醛酸(homogalacturonan,HG)結(jié)構(gòu)的存在。

WGBP-2在Sepharose CL-6B層析柱上呈現(xiàn)三個明顯的洗脫峰,如圖3(c)所示,其中分子量大的兩個洗脫峰級分中果膠含量較低,分子量小的峰酸性果膠含量較高。WGBP-2主要由Rha(6.6%)、GalA(62.2%)、Gal(18.3%)、Ara(7.0%)組成,含有少量的Glc和GlcA(表1)。Rha與GalA的比例為0.11,符合文獻(xiàn)中對I型聚鼠李半乳糖醛酸果膠(type I rhamnogalacturonan,RG-I)的定義[16-17]。根據(jù)Rha與GalA的含量與比例可以推測,WGBP-2中含有RG-I和HG結(jié)構(gòu)域,并且HG結(jié)構(gòu)域含量較高。

WGBP-3在Sepharose CL-6B層析柱上呈現(xiàn)兩個相對均一的峰,如圖3(d)所示。同WGBP-1和WGBP-2相似處在于,富含酸性果膠的部分分子量較小。WGBP-3主要由Rha(10.7%)、GalA(41.7%)、Gal(28.8%)、Ara(13.6%)組成(表1)。Rha與GalA比例為0.26,具有典型的RG-I果膠結(jié)構(gòu)特征,但RG-I結(jié)構(gòu)單元的比例高于WGBP-1和WGBP-2。

2.2　人參果多糖抗氧化活性分析

自由基氧化應(yīng)激反應(yīng)對許多生物大分子均有損傷作用,最常見的是對蛋白質(zhì)和DNA的破壞[18-19]。DPPH·和羥自由基是常見的具有損傷作用的自由基,其清除率是評價抗氧化作用的重要指標(biāo),可通過清除率來說明抗氧化能力的強弱。

2.2.1人參果多糖各級分對DPPH自由基的清除活性由圖4可以看出,人參果總多糖WGBP具有非常明顯的DPPH自由基清除活性,在0.1～2 mg/mL的濃度范圍內(nèi),清除率隨濃度的升高而逐漸加強。當(dāng)WGBP濃度為2.0 mg/mL時,清除率可達(dá)62.7%。由WGBP得來的子級分對DPPH自由基的清除活性較WGBP弱,并且也有一定的濃度依賴性。其中,WGBP-3的活性優(yōu)于WGBP-N,而WGBP-1和WGBP-2活性較弱。

圖4　人參果多糖各級分的DPPH·清除率Fig.4　Scavenge ability of DPPH radical of ginseng berry polysaccharide fractions

2.2.2人參果多糖各級分對羥自由基的清除活性人參果總多糖WGBP具有明顯的羥自由基清除活性(圖5),在0.025～1 mg/mL的濃度范圍內(nèi),WGBP的清除率隨濃度的升高而逐漸加強,當(dāng)濃度大于0.2 mg/mL時,清除率為81.2%。子級分對羥自由基也有一定的清除活性,但不如WGBP明顯。子級分中,當(dāng)多糖濃度范圍在0.025～0.4 mg/mL時,WGBP-3的活性較大;濃度大于0.4 mg/mL時,WGBP-N的活性較大。

3　結(jié)論

通過離子交換層析確定了人參果多糖的純化方法:依次用蒸餾水、0.06、0.26和0.37 mol/L NaCl洗脫,將WGBP純化為一個中性糖級分(WGBP-N)和三個酸性糖級分(WGBP-1、WGBP-2、WGBP-3),并

圖5　人參果多糖各級分的羥自由基清除率Fig.5　Scavenge ability of hydroxyl radical of ginseng berry polysaccharide fractions

對每個級分的總糖含量、酸性糖含量、單糖組成和分子量分布進(jìn)行了分析。WGBP-N主要由Gal、Ara、Glc組成,WGBP-1～WGBP-3主要由不同比例的Rha、GalA、Gal組成。

通過DPPH和羥自由基清除實驗,分析了人參果多糖各級分的體外抗氧化活性。結(jié)果表明,WGBP活性優(yōu)于四個子級分,對DPPH和羥自由基的清除能力隨濃度升高而增強。子級分間可能存在一定的協(xié)同作用。

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